全 文 ：·药材与资源·
黄芩组织培养快速繁殖技术的优化
高山林, 陈柏君Ξ
(中国药科大学 遗传育种教研室, 江苏 南京　210038)
摘　要: 目的　建立和优化黄芩组织培养克隆化快速繁殖技术, 为保护黄芩的野生资源, 发展人工资源和探讨育种
新途径奠定基础。方法　在组织培养条件下进行黄芩愈伤组织的诱导、分化, 试管苗复壮和生根等一系列技术优化
试验。结果　黄芩试管苗的节、节间都很容易诱导出愈伤组织, 诱导率均达 100% , 而叶片的愈伤组织诱导率低,
PP333对黄芩试管苗的生长有着显著的矮壮作用。结论　黄芩试管苗的节是诱导愈伤组织的理想外植体, 在培养基
中适当添加 PP 333能显著改善试管苗的素质; PP 333与激素的配合使用, 能十分有效地调控黄芩愈伤组织的分化、试
管苗的生长与生根, 并能显著提高移栽成活率。
关键词: 黄芩; 组织培养; 快速繁殖
中图分类号: R 282121　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 03 0312 04
Optim iza tion on clon ing rap id-propaga tion technology
by tissue culture in Scu tella r ia ba ica lens is
GAO Shan2lin, CH EN Bai2jun
(D epartm ent of Genetics and B reeding, Ch ina Pharm aceu tical U niversity, N an jing 210038, Ch ina)
Abstract: Object　To estab lish and op t im ize the techno logy of clon ig rap id p ropagat ion by t issue cu l2
tu re in S cu tella ria ba ica lensis Geo rgi fo r the p ro tect ion and developm en t of natu re resou rce as w ell as seek2
ing fo r new b reeding w ay of S 1 ba ica lensis by b io techno logy1 M ethods　 R esearch on the op t im ized tech2
no logy of t issue cu ltu re including callu s inducing, d ifferen t ia t ion, p lan t let p ropagat ion, and roo t ing w ere
designed1 Results　Callu s cou ld be induced from nodes and in ternodes easily w ith 100% inducing ra te com 2
pared w ith that from leaves1 PP 333 has sign if ican t stocky effect to the p lan t lets1 Conclusion 　T he nodes
are good exp lan t sou rce in inducing callu s1 PP 333 in certa in concen tra t ion w h ich is added to cu ltu re m edia
cou ld imp rove and regu la te the differen t ia t ion of callu s and grow th of p lan t lets as w ell as increase the su r2
vival ra te of cu lt iva ted seeding1
Key words: S cu tella ria ba ica lensis Geo rgi; t issue cu ltu re; rap id2p ropagat ion
　　黄芩为唇形科植物 S cu tella ria ba ica lensis
Geo rgi 的干燥根, 具有清热、燥湿、解毒、止血之功
效; 用于治疗发热烦渴、肺热咳嗽、泻痢热淋、湿热黄
疸、胎动不安、痈肿疮毒等症。黄芩的临床疗效确切,
为常用中药之一。近年来, 临床上对黄芩药材的需求
量大增, 黄芩野生资源破坏严重, 因此, 不少学者呼
吁对黄芩的资源进行保护和培育的研究, 黄芩组织
培养是解决黄芩资源短缺的有效途径之一。有关研
究目前已有一些报道: 日本山本久之等[1 ]将黄芩茎
切成 5 mm 长的节断接种于L S 培养基中, 得到了淡
褐色的愈伤组织; 秦金山等[2 ]用黄芩种子发芽的子
叶和下胚轴为外植体, 接种在M S 培养基上, 经培养
可得到愈伤组织, 继续培养, 即可从愈伤组织直接分
化出苗, 但分化率较低, 仅为 12%。黄芩试管苗生根
率最高为 4117% , 而且苗生根少而细弱, 或较短, 且
生长缓慢。由此可见黄芩组织培养虽然能够成功, 但
是要达到黄芩试管苗克隆化, 规模化生产, 在技术上
有较大的难度。为此, 在承担国家中医药局重点科研
项目——黄芩组织培养多倍体育种技术研究中, 把
黄芩的组织培养技术的优化和大量快速繁殖作为重
点需要解决的难点, 进行了一系列培养基试验, 获得
了较好的结果。现报道有关的试验结果, 本研究对于
保护黄芩的野生植物资源, 培育黄芩优良品种并进
行克隆化快速繁育, 在尽量短的时间内繁育出优良
·213· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2003210208
基金项目: 国家中医药局重点科研项目 (97A 302)
作者简介: 高山林 (1946—) , 男, 江苏省江阴市人, 硕士, 1967 年毕业于南京农业大学遗传育种专业, 现任中国药科大学教授, 长期从事
药用植物生物技术的研究。
品种种苗, 供生产上示范推广具有重要意义和应用
价值。
1　材料和方法
111　材料: 黄芩种子由我国黄芩道地产区——河北省
承德地区药材公司提供, 经中国药科大学生药学博士
余伯阳教授鉴定为S cu tella ria ba ica lensis Geo rgi。
112　方法
11211　黄芩无菌试管苗的获得: 取黄芩种子用自来
水漂洗干净后放入 75% 乙醇中消毒 1 m in, 转入
011% 氯化汞溶液中消毒 10 m in, 然后用无菌水冲
洗 5 次, 接种在M S 基本培养基上无菌萌发, 15 d 后
获得无菌苗, 在附加 62BA 012 m göL 的M S 培养基
上不断继代保存。
11212　黄芩愈伤组织的诱导: 取黄芩试管苗 015
cm 左右的节、节间和切成 015 cm 见方的叶片分别
接种于M S+ 62BA 210 m göL + IAA 012 m göL 及
M S+ 62BA 110 m göL + IAA 012 m göL 两种培养基
中, 其中含蔗糖 3% , pH 518, 培养条件为 (25±1)
℃, 暗培养。
11213　黄芩愈伤组织分化试验: 把在M S+ 62BA
210 m göL + IAA 012 m göL 培养基中继代保存的黄
芩愈伤组织切成 013 cm 见方的小块, 分别接种到附
加不同浓度 62BA 及 IAA 的M S 培养基中, 其中含
蔗糖 3% , pH 518。培养条件: 每天光照 16 h, 光强
1 200 lx, 培养温度 (25±1) ℃。
11214　黄芩试管苗的复壮实验: 将在M S+ 62BA
011 m göL 培养基中继代保存的黄芩试管苗切成带
一个节的小段, 接种于附加一系列浓度的多效唑
Paclobu trazo l (PP 333) , 62BA 011 m göL , 蔗糖 5% ,
pH 518 的M S 培养基中, 培养条件同上。
11215　黄芩试管苗生根试验: 将黄芩试管苗切成带
1～ 2 个节的小段, 分别接种于附加 PP 333 0, 011,
015, 110, 210 m göL 的 1ö2 M S + NAA 011 m göL
培养基上, 培养条件同上。
2　结果与分析
211　黄芩愈伤组织的诱导: 黄芩试管苗的节和节间
接种到培养基上, 几天后, 在一部分节的叶腋处便长
出腋芽, 节和节间开始膨大, 约 10 d 后, 节和节间的
两端和一部分节的叶腋处可见肉色的愈伤组织, 以
后愈伤组织逐渐增大。叶片接种到培养基上后, 逐渐
皱缩、变厚, 随着培养时间的延长, 大部分叶片颜色
发褐而枯死, 只有小部分从叶缘切口长出愈伤组织,
而且生长很缓慢。结果见表 1。
　　从表中结果可以看出, 黄芩试管苗的节、节间都
表 1　不同外植体接种于两种培养基中诱导愈伤组织的结果
Table 1　Results of ca llus induced from differen t explan ts
inoculated on two k inds of M S media
外植体
激素ö(m g·L 21)
62BA IAA 接种数 出现愈伤组织时间öd 30 d 后愈伤组织数 形成率ö% 生长状况
节 210 012 60 8 60 100 快
110 012 60 10 60 100 快
节间 210 012 60 10 60 100 慢
110 012 60 14 60 100 慢
叶 210 012 60 17 23 3813 最慢
110 012 60 20 16 2617 最慢
很容易诱导出愈伤组织, 诱导率均达 100% , 其中以
节间产生愈伤组织的速度最快; 而叶片的愈伤组织
诱导率很低, 并需要较长的诱导时间; 3 种不同外植
体在M S+ 62BA 210 m göL + IAA 012 m göL 培养
基中产生愈伤组织所需时间均比在M S+ 62BA 110
m göL + IAA 012 m göL 培养基中的短, 表明较高的
62BA 水平有利于黄芩愈伤组织的形成。在节的叶腋
处形成的愈伤组织生长速度最快, 节间次之, 叶最慢。
212　黄芩愈伤组织的分化: 将暗培养中的黄芩愈伤
组织转入分化培养基后, 4～ 5 d 愈伤组织开始转
绿, 然后表面出现绿色的芽点, 继续培养便陆续形成
小植株。结果见图 1 和表 2。
图 1　用黄芩节间部分诱导获得的愈伤组织
在培养基上分化出大量丛生芽
F ig11　Callus induced from in ternodes
form s a lot of buds on media
表 2　6-BA , IAA 及 PP333的不同配比
对黄芩愈伤组织分化的影响
Table 2　Effects of d ifferen t combination s of 6-BA ,
IAA , and PP333 on ca llus d ifferen tia tion
组别
激　素ö(m g·L 21)
62BA IAA PP333 接种数 成芽时间öd 得苗率ö% 植株性状
1 　0 　0 　0 80 12 100 细弱
2 011 0 0 80 12 100 细弱
3 011 011 0 80 12 100 细弱
4 011 0 015 80 19 9113 粗壮
5 015 0 0 80 16 7215 细弱
6 015 012 0 80 18 6613 细弱
7 015 0 015 80 23 6117 粗壮
　　表 2 的结果表明, 黄芩愈伤组织有着强烈的分
·313·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
化能力, 在不含任何激素或只含低水平细胞分裂素
的培养基中能很快分化形成丛生苗, 分化率达
100% , 而当细胞分裂素水平提高时, 其分化率反而
明显下降, 这可能是因为黄芩愈伤组织中内源激素
水平较高, 添加较高浓度的外源激素加快了细胞的
分裂速度, 反而不利于细胞的分化。从试验的 7 种培
养基效果看, 62BA 011 m gömL + PP 333 015 m göL 的
培养基上, 分化出的丛生芽多, 愈伤组织的分化率接
近 100% , 同时试管苗也比较粗壮。同时凡是添加了
植物生长延缓剂 PP 333 015 m göL 的培养基上 (4 和 7
号培养基) 长出来的试管苗均较粗壮, 叶色绿, 株形
紧凑。结果预示: PP 333对于壮苗有较好的效果。为此
进一步进行一系列 PP 333添加试验。
213　黄芩试管苗单节培养扩大繁殖和添加 PP 333的
复壮试验: 根据黄芩试管苗比较高, 节又比较多的特
点, 为了尽可能地扩大黄芩繁殖系数, 同时尽量减小
黄芩试管苗在扩大繁殖过程中发生变异的可能性,
在已经建立的愈伤组织培养产生丛生芽的基础上,
又 进 一 步 探 讨 建 立 了 单 节 培 养 ( Single2node
cu ltu re) [3 ]的方法进行黄芩试管苗的继代及扩大繁
殖试验, 将从丛生芽诱导获得的黄芩试管苗 (一般 5
个节, 较细长) 按每个节切成段, 接种在繁殖培养基
上, 10～ 15 d 后, 节上的侧芽启动并发育成新植株,
这一繁殖方法的成功, 使黄芩的繁殖系数在原来的
基础上又提高了 5 倍。另一方面, 由于黄芩试管苗生
长很快, 特别是节间的伸长生长很快, 致使试管苗较
细弱, 而且叶绿素合成不足, 叶片呈黄绿色, 而在前
述黄芩愈伤组织的分化试验中, 当在培养基中添加
了生长延缓剂 PP 333后, 可明显改善成苗的质量。为
此, 在进行继代繁殖和单节繁殖时我们仍添加
PP 333, 并对其合适的浓度进行了试验, 以期进一步
复壮黄芩试管苗。结果见表 3。
表 3　不同浓度 PP333对黄芩试管苗生长的影响
Table 3　Effects of d ifferen t concen tration s
of PP333 on growth of plan tlets
组别 PP333浓度ö(m g·L 21) 节间长度ömm 茎直径ömm 叶片特征
1 　 　0 　　1619 　　0170 小且浅绿　
2 011 1417 0177 小且浅绿　
3 015 1110 0186 大且绿　　
4 110 716 0191 大且绿　　
5 210 410 0196 巨大且深绿
6 510 211 1103 巨大且深绿
　　节间长度和茎直径均是随机取苗 30 棵测量的平均值
　　L ength of in ternodes and diam eters of stem w ere average of 30
random samp les
　　表中结果表明, PP 333对黄芩试管苗的生长有着
显著的矮壮作用, 随着添加浓度的增大, 其矮壮作用
更加明显, 试管苗的节间明显缩短, 茎明显增粗, 植
株由浅绿色转变成深绿色。当 PP 333的浓度增加到
210 和 510 m göL 时, 会使试管苗过分矮化, 而不利
于进行扩大繁殖和生根移栽, 因此, PP 333合适的添
加浓度为 015～ 110 m göL。我们通过单节培养的方
法结合应用 PP 333进行黄芩试管苗的继代扩大繁殖,
取得良好的效果。这种促进侧枝增殖的方法是建立
在愈伤组织培养大量增殖芽的基础上的, 因此每经
一个流程, 嫩枝就以指数扩增, 能完全满足快速繁殖
的目的。另一方面, 由于茎尖组织在培养条件下不容
易发生基因型的改变。我们在实验过程中也注意到,
用单节培养的方法在繁殖过程中极少出现试管苗的
变异现象, 这对于保持各株系的遗传稳定性具有重
要的意义。
214　黄芩试管苗的生根试验结果: PP 333对黄芩试
管苗生根的影响, 在以上黄芩试管苗的繁殖试验中,
应用生长延缓剂 PP 333收到良好的效果。另据文献报
道[4, 5 ] , PP 333还能促进试管苗的生根及提高试管苗
的移栽成活率, 为此, 考察了不同浓度 PP 333对黄芩
试管苗生根的影响。结果见表 4。
表 4　不同浓度 PP333对黄芩试管苗生根的影响
Table 4　Effects of d ifferen t concen tration s
of PP333 on rooting ratios
组别 PP333浓度ö(m g·L 21) 接种数 生根率ö% 每苗平均根数 平均根长ömm 平均苗高ömm
1 0　 80 8112 117 4413 8215
2 011 80 8413 513 2511 6817
3 015 80 8617 617 1814 4316
4 110 80 7814 911 1511 2813
5 210 80 6114 417 712 1816
　　每苗根数、根长度及苗高度是随机取苗 20 棵测量的平均值
　　Roo t num ber, length, and p lan t heigh t w ere average of 20 ran2
dom samp les
　　表 4 结果可以看出, 黄芩试管苗可以在不附加
任何激素的 1ö2M S 培养基上自发生根, 生根率可达
80% 以上, 但根的数量较少, 且苗细弱, 显然不利于
试管苗的移栽。添加 PP 333对生根率有一定提高, 并
且一方面增加根的数量, 另一方面使苗矮壮, 但当其
浓度超过 110 m göL 时, 反而会抑制生根, 而且苗的
过度矮化也不利于移栽。所以, 认为在生根培养基中
添加 015 m göL 左右 PP 333较为合适。初步移栽试验
也表明, 在添加 PP 333的生根培养基中生长的试管
苗, 其移栽成活率明显高于对照组。结合前几项试验
结果可以发现, PP 333在黄芩的组织培养中发挥了十
·413· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
分重要的作用, 是完善黄芩离体培养激素调控系统
的一种有效的调节剂。
3　讨论
311　本研究为应用生物新技术培育黄芩优良品种
奠定了基础, 同时为培育成功的黄芩优良品种今后
在生产上的克隆化快速繁殖和示范推广提供了有效
的技术手段。通过对黄芩愈伤组织的诱导、分化, 黄
芩试管苗的继代扩大繁殖、生根等一系列优化试验,
有效地解决了黄芩试管苗大规模克隆化生产的技术
难点。在本研究建立的优化了的组织培养克隆技术
条件下: (1)黄芩试管苗的节和节间可以大量诱导出
愈伤组织, 并且愈伤组织保持着较强的再分化能力,
能在较短的时间里从愈伤组织再生出苗; (2)在试管
苗繁殖中, 应用单节培养的方法可以较大幅度地提
高黄芩繁殖速度, 真正达到大量克隆化生产水平;
(3) 黄芩试管苗生长培养基中适当添加植物生长延
缓剂 PP 333能显著改善试管苗的素质, 可明显提高生
根率, 改善根的质量和苗的性状, 提高移栽成活率,
在今后生产上可以有效地应用。
312　本实验报道了普通植物生长延缓剂 PP 333在黄
芩组织培养中的重要作用。PP 333是目前广泛应用于
农业和园艺的植物生长调节剂之一, 具有明显的增
产效应。其作用机制与 GA 3 (赤霉素) 有关, 通过抑
制植株体内贝壳杉烯氧化酶的活力, 阻碍 GA 3 的生
物合成, 因而使植株明显矮化[6 ]。我们在黄芩的组织
培养过程中, 应用 PP 333取得了很好的效果, 其与外
源性激素的配合使用, 能十分有效地调控黄芩试管
苗的生长与生根, 并能显著提高移栽成活率, 因此进
一步拓宽了 PP 333在组织培养中的应用价值。对其他
经济作物的组织培养具有一定的参考意义。
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山银花茎、叶、花中绿原酸分布规律研究
耿世磊1, 2, 徐鸿华2, 赵　晟1, 姚飞平1, 卢章会1Ξ
(11 华南农业大学生命科学学院, 广东 广州　510642; 　21 广州中医药大学中药学院, 广东 广州　510405)
摘　要: 目的　揭示山银花茎、叶及花中绿原酸的分布状况, 为确定金银花药材合理的药用部位及良种选育特征提
供依据。方法　利用荧光显微镜观察山银花茎、叶及花中有效成分绿原酸的分布规律。结果　绿原酸在花中主要分
布于萼筒2子房壁外表皮细胞及其下 3～ 5 层细胞、花冠外表皮细胞及其下 1～ 2 层细胞和花冠内表皮纤毛细胞; 在
叶片中主要分布于上表皮细胞和下表皮纤毛细胞; 在茎中仅零星分布于次生韧皮部细胞。结论　花中绿原酸分布
最为广泛、含量最丰富, 叶片次之, 茎中最少; 花冠内表皮纤毛和花冠外表皮腺毛的密集程度, 以及萼筒和花冠的长
度可作为山银花的育种特征。
关键词: 绿原酸; 分布; 山银花; 茎; 叶; 花
中图分类号: R 28212　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 03 0315 04
D istr ibution of chlorogen ic ac id in branch, blade, and f lower of L on icera conf usa
GEN G Sh i2lei1, 2, XU Hong2hua2, ZHAO Sheng1, YAO Fei2p ing1, LU Zhang2hu i1
(11 Co llege of L ife Science, Sou th Ch ina A gricu ltu ral U niversity, Guangzhou 510642, Ch ina; 21 Co llege of Ch inese
M ateria M edica, Guangzhou U niversity of T radit ional Ch inese M edicine, Guangzhou 510405, Ch ina)
Abstract: Object　To show the dist ribu t ion of ch lo rogen ic acid in b ranch, b lade, and flow er of
·513·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2003207209
基金项目: 国家科技部重大专项 (2001BA 701A 23203) ; 广东省科技攻关项目 (2KB01201S) ; 华南农业大学校长基金项目 (46002K03156)
作者简介: 耿世磊 (1965—) , 男, 华南农业大学生命科学学院副教授, 现于广州中医药大学在职攻读中药学博士学位, 主要从事中药资源
开发与利用方向的研究和教学工作。T el: (020) 85280193