免费文献传递   相关文献

Photodynamic therapy with hypericin and its signaling pathway system of apoptosis and antiapoptosis

金丝桃素光动力学疗法与其诱导细胞凋亡、抗凋亡信号转导系统



全 文 :金丝桃素光动力学疗法与其诱导细胞凋亡、抗凋亡信号转导系统
白 洁1, 2,杨得坡1, 2
( 1. 中山大学药学院 生药学与天然药物化学实验室,广东 广州 510275;
2. 中山大学 基因工程教育部重点实验室, 广东 广州 510275)
摘 要: 金丝桃素在光诱导下产生活性氧,利用其光动力学治疗( PDT )在肿瘤细胞中显示出细胞毒作用, 能以浓度
和光依赖的方式诱导肿瘤细胞产生凋亡与坏死;通过细胞凋亡、抗凋亡信号转导通路调节细胞死亡程序。临床上利
用 PDT 的金丝桃素被认为是安全、有效的新型抗肿瘤药物。
关键词: 金丝桃素;光动力学疗法; 细胞凋亡;信号转导
中图分类号: R285   文献标识码: A   文章编号: 0253 2670( 2004) 01 0106 03
Photodynamic therapy with hypericin and its signaling pathway system
of apoptosis and antiapoptosis
BAI Jie
1, 2
, YANG De-po
1, 2
( 1. Depar tment of Natur al D rug Chemist ry , Schoo l o f Pharmaceut ical Sciences, Sun Yat -sen Univer sity ,
Guangzhou 510275, China; 2. Gene Engineer ing Key Labo rat or y o f M inistr y o f Education,
Sun Yet -sen Univer sity , Guang zhou 510275, China )
Key words : hypericin; photodynamic therapy ( PDT ) ; apoptosis; signaling pathw ay
  金丝桃素( hyper icin)为萘骈二蒽酮类化合物,存在于贯
叶连翘 Hyper icum p erf oratum L . 及同属植物。1911 年,
Cerny 命名 hyper icin, 1957 年 Brockmann 从贯叶连翘和
Hir sutum 中首次分离得到金丝桃素, 并完成了全合成工作。
金丝桃素除具有抗抑郁、抗炎、免疫等药理作用外[ 1, 2] ,还是
一种有效的光敏剂,在光动力学治疗( Photodynamic T her a-
py , PDT )中表现出强的诱导肿瘤细胞凋亡与抗病毒的活
性[ 3, 4]。近年来,金丝桃素因其对人体无基因毒性与系统性毒
性, 作为一种有效、安全的抗肿瘤药物, 引起人们的广泛兴
趣。本文涉及金丝桃素PDT 及其诱导细胞凋亡、抗凋亡的信
号转导作用。
1 光动力学疗法(PDT)
  PDT 是一种新的治疗肿瘤的技术, 将光敏剂集聚于恶
性组织,在与之吸收光谱相匹配的光激活下, 基态的光敏剂
经短暂存在的激发态单线态转变成为激发态三线态光敏剂,
后者一方面作用于组织底物, 其产物与氧作用生成各种氧化
物; 另一方面它直接将能量转移给氧,形成单线态氧1O 2, 单
线态氧和氧化物都具有细胞毒作用, 尤其是单线态氧是
PDT 诱导肿瘤损伤的主要形式, 它能对肿瘤细胞产生不可
逆的光损伤, 除了直接引起肿瘤细胞的死亡以外, 在体内实
验中 PDT 能使肿瘤血管发生重大变化,导致血流阻滞、血管
破裂或渗漏等[ 5]。此外, PDT 也能引起细胞因子和其他炎症
介质的释放, 产生炎症反应,这种作用机制与组织类型及光
敏剂的特性等因素有关。
2 金丝桃素的 PDT
2. 1 金丝桃素的光敏性: 金丝桃素是最有效的光敏剂之一,
具有很大的三线态量子产额( quantum y ield) , 并能有效地产
生1O 2[6]。体外实验表明金丝桃素可以抑制蛋白激酶 C
( PKC)、上皮生长因子受体、酪氨酸激酶活性, 并且具有琥珀
酸氧化酶的活性。金丝桃素的光敏作用可使呼吸控制比率和
线粒体膜电势(  m)下降[ 7]。 m 降低, 目前被认为是细
胞凋亡早期阶段的特征性表现: 细胞皱缩、细胞核裂解、
DNA 片段化。此作用可能与线粒体通透性改变导致氧化磷
酸化的解偶联以及产生超氧阴离子有关,因此线粒体可能是
金丝桃素的重要靶标,并与其抗肿瘤活性有关[ 8]。一项对接
种 RIF-1肿瘤的 C3H 小鼠的研究发现, 金丝桃素在光照条
件下给药 0. 5 h 后主要分布在肿瘤血管中;而在无光照情况
下, 6 h 后肿瘤细胞中药物浓度达到最大 ,但在血管中荧光微
弱,由此说明血管损伤也是金丝桃素诱导的 PDT 抗肿瘤的
重要途径[9]。
2. 2 金丝桃素的细胞毒作用: PDT 可以快速清除肿瘤细
胞,在肿瘤活组织检查中发现, 存在细胞凋亡与坏死区域。光
敏剂诱导细胞凋亡和坏死的效价与细胞类型、光敏剂浓度、
亚细胞定位、光照强度等因素有关[6]。光敏剂的亚细胞定位
决定了光损害的细胞内位点, 是影响细胞死亡的关键因素。
Hela 细胞能高度富集金丝桃素, 并对光诱导产生的细胞毒
作用有良好的反应性。对癌细胞的检查发现金丝桃素位于细
胞核周围,很可能分布在内质网与高尔基体内[ 7]。这种亚细
·106· 中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 35 卷第 1 期 2004年 1月
 收稿日期: 2003-04-30基金项目:国家教育部高等学校骨干教师资助基金项目;广州市科技局重大项目( 2000-Z-101-01)作者简介:白 洁( 1976—) ,女(回族) ,安徽省阜阳市人,中山大学生命科学学院博士生,主要从事天然药物的研究与开发。
* 通讯作者 Tel: ( 020) 84113967 E-m ail : ls39@ zsu. edu . cn
胞分布可在金丝桃素与癌细胞共同孵育 30 min 内达到, 并
且不受细胞外金丝桃素的浓度和随后的光照条件的影响。增
加金丝桃素浓度, 肿瘤细胞由凋亡转变为坏死。浓度在 80~
250 nmo l/ L 光激活的金丝桃素引起的细胞死亡,几乎都是
由于诱导细胞凋亡引起的。在光照条件下, 增加金丝桃素的
浓度达到 1 mo l/ L 时可产生细胞坏死[ 6]。采用 125 nmo l/ L
的金丝桃素进行 PDT ,光照后很快就产生凋亡的特征性形
态改变。需要强调的是, 在这个过程中细胞死亡严格地依赖
光照,因为在没有光照的条件下金丝桃素的浓度即使达到
10 mol/ L , 与对照组比较都没有显著性差异。细胞内 ATP
的水平是决定细胞死亡的关键因素。1 mo l/ L 光激活的金
丝桃素还能导致细胞总 AT P水平和线粒体呼吸功能显著不
可逆地下降, 当细胞 AT P 耗竭达到临界值时凋亡信号可以
转变为坏死信号[ 10]。金丝桃素在 PDT 中促进细胞凋亡并不
伴随主要的炎症反应, 但是否可以将其作为治疗优势还需进
一步探讨。
3 金丝桃素 PDT诱导细胞凋亡和抗凋亡信号转导通路
3. 1 促凋亡 caspase 介导的信号通路:天冬氨酸特异性半胱
氨酸蛋白酶 caspases 介导了濒死细胞中高度特异的蛋白裂
解活动, 集中体现了细胞凋亡的表型。Caspases 按结构和功
能可分为上游/起始 ca spases 和下游/效应 caspases。一旦被
激活, 起始 caspases 即转活化其他的 caspases 酶原, 引起级
联反应。Caspases 信号级联反应的发生主要通过 2 种机制实
现, 即死亡受体介导的信号系统和线粒体调节的途径。
PARP [ poly ( ADP-ribo se) po lymerase]是效应 caspase-3 和
caspase-7 的细胞核底物之一, PARP 的断裂被作为细胞凋
亡程序执行的标志。引起细胞凋亡浓度的光激活金丝桃素可
以诱导 PARP 断裂成凋亡特征性的片断。zVAD-fmk 是广谱
的 caspa se 抑制剂, zDEVD-fmk 是 caspase-3 的专属抑制剂,
在给予光照之前均能有效地阻断凋亡状态下 PARP 的断
裂。两者都能有效地拮抗金丝桃素诱导的凋亡,特别是 zDE-
VD-fmk 能阻止膜空泡的形成。Serpin 类似物的抑制剂 Cr-
mA(优先作用于 caspa se-1 和-8)在 Hela细胞中的过量表达
不能保护由金丝桃素诱导的细胞凋亡。由于 CrmA 的过量表
达能有效的阻断 TNF 和 Fas 在此细胞系中诱导的细胞凋
亡, 认为金丝桃素诱导的凋亡不依赖于 T NF-R1和 Fas 介导
的 caspase信号通路[6, 11]。使用单克隆抗体 Fas ( SM 1/ 23) ,
Fa sL ( Nok-2) , T NF-R1( M AB225)和多克隆兔抗人 T RAIL
( TNF-related apoptosis-inducing lig and)抗血清对死亡受体
的分析结果表明, TRAIL 抗体能阻断 TRAIL 与金丝桃素诱
导的 Jurka t细胞凋亡; 而 SM1/ 23 和 NOK-2抗体不能阻断
金丝桃素诱导的凋亡, M AB225 无效, 说明金丝桃素诱导的
细胞凋亡部分地通过 TRAIL / TRAIL-受体系统和对上游的
caspase 的激活而起作用[12]。金丝桃素在 Jurkat 细胞中诱导
的细胞凋亡与 caspase-8 的激活作用有关, 能被 caspase-8 抑
制剂 2-IETD-FMK 所阻断。因为 caspase-8是细胞死亡受体
的上游起始 caspase ,因此认为 T NF 受体家族可能参与金丝
桃素诱导的细胞凋亡。Ali等在研究金丝桃素对鼻咽癌细胞
的 PDT 中发现其能诱导死亡受体所介导的细胞凋亡[ 13]。金
丝桃素 PDT 的这种只对某些类型细胞(如 Jurkat)诱导 cas-
pase-8 酶原的激活, 而对其他细胞无此作用的性质, 可能与
其是否能产生有功能的死亡诱导信号复合物 ( DISC )有
关[14]。因此需进一步对多种类型的细胞进行研究,以证明金
丝桃素 PDT 诱导的细胞凋亡与死亡受体介导的通路有关。
  金丝桃素作用于线粒体结合的己糖激酶, 导致能量代谢
和神经胶质瘤细胞存活率的变化。在光照条件下, 长期存在
于金丝桃素溶液中的神经胶质瘤细胞, 其凋亡特征性的
DNA 片段化,金丝桃素诱导 Hela 细胞的光敏作用可使线粒
体释放细胞色素C 和激活 caspase-3 酶原,引起细胞凋亡。因
此,金丝桃素介导的 caspase 信号级联反应可通过非受体依
赖的途径参与线粒体调节的机制而激活 caspase-3 酶原。在
125 mo l/ L 金丝桃素光敏化的细胞质中, 细胞色素 C 聚集
很快, 24 h 后即可检测到; 1mo l/ L 金丝桃素 PDT 可导致
细胞色素 C 从线粒体到细胞质的快速释放。在这两种情况
下,细胞色素 C 的释放先于只在凋亡情况下才发生的 PARP
的断裂和细胞核片段的形成。由此可以推断 1 mo l/ L光激
活的金丝桃素启动了凋亡程序,随后所发挥的是过量的光损
害作用[6]。
3. 2 抗凋亡 JNK/ p38 MAPK 信号通路: 由于线粒体激活
的蛋白激酶 MAPK 信号通路在决定细胞死亡过程中起重要
作用, P atrizia等[ 6]研究了金丝桃素的光敏活性对 M APK 家
族成员:细胞外信号调节激酶 ERK、c-Jun N-末端激酶 JNK1
和 p38 MAPK 激酶的作用, 发现引起凋亡浓度的金丝桃素
能快速持续性的激活 JNK1 和 p38 MAPK ,而严重抑制基础
水平的 ERK2 的活性;而未被光激活的金丝桃素对此 2种激
酶均无作用。在 HeLa细胞中观察 PDT 对于 MAPK 活性的
影响,可认为是金丝桃素治疗作用在细胞水平上的反映。使
用光敏剂苯卟啉衍生物 BPD 进行 PDT 表现出诱导 JNK1
和 p38 MAPK 的活性, 并且这些应激激酶的活性能被加入
抗氧剂如 N -乙酰半胱氨酸所反转, 提示 ROS 制剂和激酶活
性之间存在一定的关联。与此不同的是,金丝桃素诱导的应
激激酶的活性并不受抗氧剂 N-乙酰半胱氨酸影响。使用
BPD 进行 PDT 时不抑制 ERK 通路, 但是金丝桃素进行
PDT 时却能抑制 ERK 通路[ 15]。ERK 通路能促进细胞的增
殖, JNK / p38 MAPK 信号通路能保护细胞, 是 PDT 中细胞
反应的生存信号; JNK/ p38 M APK 和 ERK 的活性间存在的
平衡决定了在细胞应激后是否激活细胞的程序性死亡。特别
地, ERK 的失活和 JNK / p38 MAPK 的激活或者两者同时发
生是影响细胞凋亡的关键性因素。另外, JNK1/ p38 MAPK
通路和 caspase激活作用在 PDT 中可能存在着相互关系,光
激活的金丝桃素对 JNK1 和 p38 MAPK 信号级联反应的作
用并不需要激活 caspase-3,因此认为 caspase的激活作用是
位于 JNK1 和 p38 M APK 激活的下游或是其所不依赖的
途径。
JNK1 和 p38 MAPK 可以保护 HeLa 细胞免受 PDT 诱
导的细胞毒性,很可能是通过诱导生存基因的转录, 直到细
·107·中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 35 卷第 1 期 2004年 1月
胞毒的破坏作用达到引起细胞凋亡的临界阈值而延迟细胞
凋亡的进程, 但它们不能对抗由金丝桃素所诱导的细胞死
亡。金丝桃素可以维持 JNK1 和 p38 M APK 的活性, 但与此
同时其又能不可逆的抑制促生长的 ERK 信号系统,与保护
反应形成抗平衡而导致细胞的死亡。这种不能有效提高细胞
存活的反应可能也是金丝桃素 PDT 在体内抗肿瘤的原因之
一[7]。金丝桃素诱导的凋亡和抗凋亡的信号转导通路如图 1
所示。
图 1 金丝桃素光动力学治疗诱导的信号转导通路
Fig. 1 Signaling pathways induced by hypericin with photodynamic therapy
4 结语
  金丝桃素光细胞毒性作用的分子机制揭示其作为光敏
剂以浓度和光依赖的方式诱导肿瘤细胞凋亡与坏死。金丝桃
素 PDT 能通过对多种凋亡和抗凋亡信号转导通路的作用,
对细胞的死亡程序产生正向或是负向调节, 诱导细胞凋亡。
临床上利用金丝桃素 PDT 有效的治疗了人类基底、鳞状细
胞瘤和膀胱癌等[16]。金丝桃素为安全、有效的天然药物, 采
用 PDT 技术,该化合物可以选择性地富集于肿瘤组织, 而对
健康组织的损伤很小, 有关的分子药理学与临床试验证实,
它是一种新型的抗肿瘤药物。
References:
[ 1] Robert B R. Screen of receptor and uptake-site act ivity of hy-
pericin component of S t . J ohns Wor t reveals receptor bind-
ing [J ] . P harm L et t, 1998, 62( 16) : 291-294.
[ 2] Peter M B, Susanne B M, Lienhard S. Hypericin as a non-
an tioxid ant inh ibitor of NF-B [ J ] . P lanta Med , 1999, 65:
277-300.
[ 3] Misk ovsky P. Hypericin—a new ant iviral and ant itumor ph o-
tos ens it izer mechanism of action and interact ion with biologi-
cal m acromolecules [ J] . C arr Drug T arg ets, 2002, 3 ( 1 ) :
55-84.
[ 4] Prince A M, Pascual D, Merudo D. St rategies for evaluation
of enveloped virus inact ivat ion in red cell concent rates using
hypericin [ J] . Photochem Photobiol, 2000, 71( 2) : 188-195.
[ 5] Dough erty T J, Gom er C J, Henerson B W , et al. Photody-
nam ic th erapy [ J] . Canc er Inst, 1998, 90: 889-905.
[ 6] Pat rizia A, Zerihun A, Annel ies V, et al . Apoptot ic and
an ti-apototic s ignaling pathw ays indu ced by photodynamic
therapy w ith hypericin [ J] . A dvan E nzyme Regul , 2000,
40: 157-182.
[ 7] Engli sh D S, Doyle R T, Pet rich J W, et al . S ubcellu lar dis-
tr ibut ions an d excited-state p roces ses of hypericin in neurons
[ J ] . P hotochem P hotobiol , 1999, 69( 3) : 301-305.
[ 8] Roman C , Pat rice X P. Over-exp res sion of bcl-2 does not
protect cell s f rom h ypericin ph oto in duced mitochondrial
m embrane dep olariz at ion, b ut delays sub sequent events in
the apoptot ic pathw ay [ J] . FEB S L et t, 1999, 462: 295-301.
[ 9] Chen B, Xu Y, Roskam s T . Eff icacy of ant itumoral photo-
dynamic therap y w ith hyper icin: relat ionsh ip b etw een b iod is-
t ribut ion and ph otodynamic ef fect s in the RIF-1 m ou se tumor
m odel [ J] . Int J Cancer, 2001, 93( 2) : 275-282.
[10] Eg uxhi Y, Sh imizu S , Tsujimoto Y. Int racel lular AT P levels
determine cell d eath fate by apoptosis or necrosis [ J] . Cance r
R es, 1997, 57: 1835-1840.
[11] Pat rizia A, Annel ies V, Wil fr ie M . et al . Hypericin in cancer
t reatment : more l ight on the w ay [ J] . Int ernat J B iochem
Cel l B iol , 2002, 34: 221-241.
[12] S chempp C M , Simon-Haarhaus B, T ermeer C C , et al . Hy-
pericin photo-induced apoptosi s involves the tum or necros is
factor-related apoptosis-in ducing ligand ( T RAIL) and activa-
t ion of caspase-8 [ J ] . FEB S L et t, 2001, 493: 26-30.
[13] Ali S M , Chee S K, Yuen G Y, et al . Hypericin induced
death receptor-mediated apoptosis in photoactivated tumor
cel ls [ J] . Int J Mol M ed, 2002, 9( 6) : 601-616.
[14] Fulda S, M eyer E, Fries en C, et al . Cell t ype specif ic in-
volvement of death receptor an d mitochondrial pathw ays in
dru g-induced apoptosis [ J] . Oncogene, 2001, 20: 1063-
1075.
[15] T ao J, S angh era J S, Pelech S L, et al. St imulat ion of
s t ress-act ivated protein kinase and p38 HOG1 k inase in
m urine ker at inocytes follow ing photodynamic th erapy w ith
benzoporph yrin derivat ive [ J] . J Biol Chem, 1996, 271:
27107-27115.
[16] Kamuhabw a A A, Coss erat-Gerardin I, Didelon J , et al .
Biodis tribut ion of h ypericin in orthotopic trans iti on al cell car-
cinoma bladder tumors: implication for w hole bladd er w al l
ph otodynamic therapy [ J ] . Int J Canc er, 2002, 97( 2) : 253-
260.
·108· 中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 35 卷第 1 期 2004年 1月