全 文 ：4　讨论
　　活血通络 ,滋阴补血 ,平肝潜阳为中医治疗高血
压的常用方法。血虚血行壅滞 ,血瘀内停 ,血行缓慢
而发眩晕 ,以四物汤为主加味组成的养血清脑颗粒
具有滋阴补血 ,平肝潜阳 ,活血通络之效 ,共奏降压
之功。 养血清脑颗粒由当归、熟地、川芎、珍珠母、决
明子、夏枯草、白芍等组成 ,现代研究认为当归能降
低血小板聚集 ,抗血栓形成 ,扩张外周血管 ,缓解血
管平滑肌痉挛 ;熟地有一定降压作用 ;川芎抑制血管
平滑肌收缩 ,降低外周血管阻力 ;珍珠母镇惊安神 ,
调节中枢降压 ;决明子对动物有降压作用 ;夏枯草具
有降压活性 ;白芍解除血管平滑肌痉挛 ,有轻度降压
作用。诸药合用可干预血管壁平滑肌细胞膜的钙通
道 ,扩张血管口径 ,舒张阻力血管 ,并通过调节中枢
神经 ,对抗去甲肾上腺素引起的收缩而起降低血压
作用。
黄芩茎叶总黄酮对动脉粥样硬化早期病理改变的影响
于永芳 1 ,高瑞峰 2* ,李沈明 3
( 1. 承德医学院中药研究所 ,河北 承德　 067000; 2. 承德医学院附属医院 河北 承德　 067000; 3. 承德颈复康药业集团公
司 ,河北 承德　 067000)
　　黄芩具有清热澡湿、泻火解毒作用 ,其有效成分
是黄酮类化合物 ,具有抗炎、螯合金属离子和清除超
氧阴离子等药理作用 [1 ]。传统上黄芩以根部入药 ,但
野生资源非常有限。承德医学院河北省中药研究与
开发重点实验室进行了黄芩茎叶总黄酮的药理试
验 ,证实黄芩茎叶总黄酮具有降低血胆固醇作用 ,初
步的临床研究表明黄芩叶总黄酮对高血脂有一定的
防治作用。本实验旨在观察黄芩茎叶总黄酮对低密
度脂蛋白 ( LDL)氧化修饰及对氧化低密度脂蛋白
( Ox-LDL)所致血管内皮细胞 ( EC)损伤的影响。
1　材料
1. 1　药品:黄芩茎叶总黄酮由河北省中药研究与开
发重点实验室提供 (含量为 85% )。 EC生长因子购
于 Boehringer Mannheim 公司。 RPM I1640购于
Gibco公司。四已氧基丙烷购于 Sigma公司。淋巴
细胞分离液购于中国医学科学院天津血液病研究
所。 Ⅷ 因子抗体和羊抗兔荧光抗体购于中山公司。
2　方法
2. 1　 LDL的分离提取及氧化修饰: 取健康人新鲜
血浆 ,用一次密度梯度法分离制备 LDL[2 ] , LDL氧
化修饰采用硫酸铜法 [3 ] ,硫代巴比妥酸法 [ 3]鉴定
LDL氧化修饰程度 ,用四已氧基丙烷作标准 ,结果
以 LDL蛋白中 MDA (丙二醛 ) 含量表示 ( nmo l /
mg)。 Ox-LDL的值显著高于正常 LDL 5倍以上。
2. 2　对 Cu2+ 诱导的 LDL氧化修饰的影响: 用 PBS
调节 LDL浓度为 100 mg蛋白 /L,加入不同浓度的
黄芩茎叶总黄酮 ( 25, 50, 100 mg /L ) ,混匀后 ,加入
CuSO4使其终浓度达 5μmol /L , 37℃ 水浴 2. 5 h,
加入 0. 1 mmol /L的 EDTA冰水浴终止反应。紫外
分光光度计鉴定共轭双烯生成量 [4 ] (以吸光度 A234nm
值表示 ) ,硫代巴比妥酸法检测 MDA生成量。
2. 3　人脐静脉 EC的培养、鉴定及细胞毒性实验:
参照 Jaf fo[ 5]培养 EC方法 ,用胰蛋白酶取代胶原
酶。 人脐静脉 EC的鉴定采用人第Ⅷ因子荧光抗体
检验鉴定。为确定黄芩茎叶总黄酮 ( TFSLSBG)对
人血管 EC作用的最佳剂量 ,用 25, 50, 100, 200
mg /L黄芩茎叶总黄酮处理人脐静脉 EC,观察 48 h
细胞存活情况 ,选用 48 h内无毒性反应的最大剂量
为最大无毒作用剂量。
2. 4　对 Ox-LDL所致 EC损伤实验:取接种于 24
孔板、生长状态良好的 EC,换含 5% 胎牛血清
( FBS)的 RPM I-1640培养液 1 mL (对照组 )和不
同浓度 ( 25, 50, 100 mg /L )的黄芩茎叶总黄酮、
Ox-LDL ( 100 mg /L )等实验因子的培养液 (实验
组 )于 37℃ 温育 12 h,台盼蓝法计算细胞存活率
(每组计 2孔 ,每组计算 3次 ) ,并测定乳酸脱氢酶
( LDH)含量 [6 ]。
2. 5　单核细胞—内皮细胞 ( M C-EC)黏附实验: 密
·1033·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
收稿日期: 2003-01-03作者简介: 于永芳 ( 1948— ) ,男 ,河北秦皇岛人 ,副主任药师 ,市级拔尖人才 ,获省科委二等奖 1项 ,三等奖 2项 ,四等奖 1项 ,获市科委一等奖 4项 ,研究方向为中药药理。 Tel: ( 0314) 2062312-8348　 E-mail: yuyongfangcncn@ yahoo. com. cn
* 通讯作者
度梯度离心法分离单核细胞 [7 ]。将接种于 24孔板、
生长状态良好已融合的 EC,用 RPM I-1640培养液
1 mL (对照组 )和含不同浓度 ( 25, 50, 100 mg /L)
的黄芩茎叶总黄酮、 Ox-LDL ( 100 mg /L)等实验因
子的培养液 (实验组 )于 37℃ 温育 24 h,然后吸出
培养液 , PBS洗 1次 ,再加含 1× 106 /mL单核细胞
( M C) 的 RPM I-1640培养液 , 37℃ 温育 1 h ,用
FBS洗去未黏附的 MC,以 6 mol /L NaOH溶解细
胞 ,测蛋白含量 ,以不加 MC的培养孔内蛋白含量
为基础 ,计算 MC黏附率。
黏附率= [ ( EC+ M C)蛋白量 - EC蛋白量 ] /1 mL MC
蛋白量× 100%
2. 6　统计学分析:结果以 x± s表示 ,组间比较用方
差分析和 t检验。
3　结果
3. 1　对 EC的毒性:细胞计数法观察结果表明 ,在
低于 150 mg /L时 ,细胞存活率能维持较高水平
( 90% 以上 ) ,而 150 mg /L以上浓度时细胞存活率
明显下降 ,至 200 mg /L接近 60% 死亡。因此 ,以
25, 50, 100 mg /L为体外试验浓度。
3. 2　对 Cu2+ 诱导的 LDL氧化修饰的影响: 见表
1。 可见 ,黄芩茎叶总黄酮在浓度为 50, 100 mg /L
时 ,可明显抑制 LDL的氧化 ( P < 0. 05) ,并且抑制
强度与剂量成良好的相关性。
表 1　黄芩茎叶总黄酮对 Cu2+ 诱导的 LDL氧化的影响
Table 1　 Ef fect of TFSLSBG on oxidation
of LDL induced by Cu2+
组　别 剂　量
/ (mg· L- 1 ) A 234 nm
MDA
/( nmol· mg- 1 )
LDL - 0. 18± 0. 015 2. 89± 0. 25
LDL+ Cu2+ - 0. 62± 0. 067 26. 22± 2. 21
黄芩茎叶总黄酮+ LDL+ Cu2+ 25 0. 51± 0. 031* 22. 83± 2. 06*
50 0. 28± 0. 032* * 14. 60± 21. 34* *
100 0. 22± 0. 027* * 9. 22± 0. 95* *
　　与 LDL+ Cu2+ 组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs LDL+ Cu2+ group
3. 3　对 Ox-LDL所致 EC损伤的影响:见表 2。可
见 ,黄芩茎叶总黄酮在浓度为 25, 50, 100 mg /L
时 ,可明显提高 EC存活率 ,并呈剂量关系。
3. 4　对 MC-EC黏附的影响:见表 3。可见 ,黄芩茎
叶总黄酮在浓度为 50, 100 mg /L时 ,可明显降低
MDA的生成 ( P < 0. 05) ,抑制 MC向 EC黏附。
4　讨论
　　动脉内皮长期反复损伤及其功能障碍是动脉粥
样硬化 ( AS) 病变形成的始动环节 [8 ]。 研究表明 ,
LDL发生氧化修饰 ,生成的 Ox-LDL是引起内皮损
表 2　黄芩茎叶总黄酮对 Ox-LDL所致 EC损伤的影响
Table 2　 Ef fect of TFSLSBG on cultured EC
injury induced by Ox-LDL
组　别 剂　量
/ ( mg· L- 1 )
EC存活率
/%
LDH
/%
对照 - 100. 0± 0. 04 17. 64± 1. 65
LDL - 98. 2± 0. 72 21. 35± 2. 36
Ox-LDL - 35. 2± 3. 97 65. 33± 4. 37
黄芩茎叶总黄酮+ Ox-LDL 25 81. 4± 3. 53* * 42. 24± 4. 11* *
50 89. 3± 2. 15* * 31. 14± 3. 43* *
100 95. 2± 1. 02* * 24. 67± 4. 27* *
　　与 Ox -LDL组比较: * * P < 0. 01
　　* * P < 0. 01 vs Ox-LDL group
表 3　黄芩茎叶总黄酮对 MC-EC黏附率和 MDA的影响
Table 3　 Ef fect of TFSLSBG on sticking rate
of MC-EC and MDA content
组　别 剂　量
/ ( mg· L- 1 )
M C-EC
黏附率 /%
M DA
/(nmol· mg- 1)
LDL - 4. 03± 0. 31 1. 10± 0. 18
Ox-LDL - 6. 87± 0. 62 2. 54± 0. 33
黄芩茎叶总黄酮+ Ox-LDL 25 28. 64± 2. 48* * 15. 31± 1. 48* *
50 21. 75± 2. 84* * 9. 39± 1. 56* *
100 9. 83± 1. 36* * 6. 80± 0. 68* *
　　与 Ox -LDL组比较: * * P < 0. 01
　　* * P < 0. 01 vs Ox-LDL group
伤的一个重要因子 , Ox-LDL可通过对 EC的毒性
作用、化学趋化作用、免疫源性和影响细胞因子的表
达等细胞生物学效应而促进 AS的发生与发展 [9 ]。
Ox-LDL可被巨噬细胞上的清道夫受体摄取 ,导致
细胞内大量胆固醇蓄积 ,形成泡沫细胞 , Ox-LDL以
及氧化的胆固醇对细胞具有毒性作用 ,最终导致细
胞坏死 ,堆积形成斑块 ,引起管腔狭窄 ,进而引起心血
管疾病。因此 ,增强机体内的抗氧化功能 ,阻断脂质过
氧化反应 ,防止氧化损伤是预防 AS的重要策略。
本实验应用体外细胞筛选方法 ,观察到黄芩茎
叶总黄酮在体外抑制 LDL的氧化修饰 ,阻止 Ox-
LDL对 EC的损伤 ,降低 MC-EC黏附率。其机制一
方面是黄芩茎叶总黄酮的抗氧化作用 ,另一方面是
通过直接作用于 EC,调节 EC功能 ,增强 EC对有
害物质的抵抗力和耐受性 ,从而保护 EC免受损伤。
本研究为黄芩茎叶总黄酮的开发利用、用于预防
AS提供了实验依据 ,为进一步研究其功能和临床
应用打下基础。
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芪丹通脉片对肿瘤坏死因子-α诱导的心肌细胞的
细胞间黏附分子-1表达的影响
王宗仁 1 ,肖铁卉 1 ,李晶华 1 ,马　静 1 ,邵中军 2 ,郑　瑾 1 ,马爱玲 1
( 1. 第四军医大学附属西京医院 中医科 ,陕西 西安　 710032; 2. 第四军医大学 流行病学教研室 ,陕西 西安　 710032)
　　近年来 ,冠心病发生发展中的细胞黏附机制日
益受到重视 ,其中内皮细胞 ( EC) ,白细胞和血小板
之间以及与血管内皮基质间相互黏附、相互作用而
导致炎症反应和促凝异常、血栓形成 ,从而促进冠心
病的形成和发展 ,而黏附分子和黏附蛋白是介导细
胞黏附的分子基础。 研究发现 ,细胞间黏附分子 -1
( intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) 参与
中性粒细胞黏附心肌细胞 ,释放细胞毒过程 ,在心肌
细胞坏死过程中起关键作用。一些细胞因子如肿瘤
坏死因子-α( TN F-α) ,γ-干扰素 ( IFN-γ) ,胰岛素样
生长因子-1 ( IGF-1) ,白细胞介素 -1 ( IL-1) ,白细胞
介素-6 ( IL-6) ,脂多糖 ( LPS)和佛波酯 ( PMA)等
可促进上皮细胞和血管平滑肌等细胞 ICAM-1的表
达 ,其中 TN F-α的作用尤其引人注目 [1 ]。本研究观察
芪丹通脉片 ( QDTMP)对 TN F-α诱导的培养乳鼠
心肌细胞 ICAM-1表达的影响 ,探讨中药复方制剂
对冠心病发生发展中的细胞黏附过程的作用机制。
1　材料与方法
1. 1　材料: SD大鼠 30只 ,雄性 ,体重 ( 220± 18)
g ,第四军医大学实验动物中心提供。 DM EM、胰蛋
白酶、胎牛血清 ( FBS)、 TN F-α、抗 ICAM-1多抗及
DAB染色剂购于武汉博士德公司。生物素标记羊抗
兔抗体 (二抗 ) , ABC复合物 ,第四军医大学神经生
物教研室提供。芪丹通脉片提取浸膏干粉 ( 1 g干粉
相当于生药 2. 862 g ) ,由第四军医大学附属西京医
院提供。
1. 2　含药血清制备: SD大鼠按体重随机分成: 对
照组、芪丹通脉片低、高剂量组。对照组 ig生理盐水
10 m L /kg ,芪丹通脉片低、高剂量组分别 ig 1, 2 g
生药 /kg;连续 7 d。第 8天断头取血 ,离心 ,取血清 ,
分装保存于 - 20℃ 冰箱备用。
1. 3　心肌细胞原代培养:新生 1～ 3 d SD大鼠 (第
四军医大学实验动物中心提供 ) ,雌雄兼用 ,活杀取
心室 ,除去心包膜 ,放入不含钙、镁的 Hanks液中漂
洗 2次 ,洗去多余水分 ,剪成 1～ 2 mm3组织碎块 ,
置于 0. 2% 胰蛋白酶溶液中 , 37℃ 水浴振荡消化
15～ 20 min, 200目不锈钢筛滤过 ,将上层细胞悬液
吸入含 10% FBS DM EM培养基的消毒离心管中
混匀 , 800～ 1 000 r /min离心 10 min,离心后弃上
清液 ,加入不含钙、镁 Hanks液混匀 , 800～ 1 000 r /
min离心 10 min,离心后弃上清液 ,加 4 mL培养液
混匀 ,接种在消毒的载玻片上 , 37℃ 孵箱中静置 3
h,调整细胞浓度为 5× 108 /L ,吸入含 10% FBS的
DMEM培养基转入培养皿 37℃ CO2孵箱中培养 ,
并观察细胞生长状况。 48 h后换液备用。
1. 4　分组: 加用 TN F-α和芪丹通脉片 ,换液时将
培养的心肌细胞随机分为 3类 ,一类在含 10% FBS
的 DMEM中分别加入 TN F-α ( 100 U /mL) ,另一
类在 10% 高剂量含药血清的 DMEM 中加入
TNF-α( 100 U /mL) ,第三类在含 10% 低剂量含药
血清的 DMEM中加入 TN F-α ( 100 U /mL) ,均刺
激 6, 12, 24 h。
·1035·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
收稿日期: 2003-03-14基金项目: 陕西省重点课题 ( 2001K12-G7)作者简介: 王宗仁 ( 1951— ) ,男 ,博士生导师 ,第四军医大学附属西京医院中医科主任。
Tel: ( 029) 3375347　 E-mai l: zong ren@ fmmu. edu. cn