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西红花酸对羟自由基损伤的原代心肌细胞的保护作用
沈祥春,钱之玉

(中国药科大学 药理教研室,江苏 南京　210009)
摘　要: 目的　研究西红花酸 ( cro cetin) 对羟自由基 ( OH·) 损伤的原代培养心肌细胞的保护作用。方法　培养
的原代心肌细胞加入不同浓度的西红花酸后, 用 0. 5 mmo l/ L OH·损伤原代培养的心肌细胞,检测细胞培养上清
液中的乳酸脱氢酶 ( LDH)、心肌细胞线粒体琥珀酸脱氢酶 ( MSD) 的活性, 心肌细胞线粒体膜电位 ( M MP) 的变
化,并用流式细胞仪及 DNA 梯度电泳检测细胞凋亡。结果　0. 5 mmol/ L OH·使细胞培养上清液中 LDH 活性增
加、MSD 的活性降低、MMP 降低、心肌细胞凋亡率增加。西红花酸 1. 0, 0. 1
mol/ L 明显降低培养上清液中 LDH
活性、提高 MSD 的活性及 MM P、降低心肌细胞凋亡率, 与模型组比较差异显著 (P < 0. 05)。结论　西红花酸对
OH·所致的心肌细胞损伤(凋亡)具有保护作用。
关键词: 西红花酸;羟自由基; 心肌细胞
中图分类号: R286. 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 06 0657 04
Protection of crocetin on primary culture cardiac myocyte injured by hydroxyl free radicals
SHEN Xiang-chun, QIAN Zhi-yu
( Department o f Pharmacolog y , China Pharmaceut ical U niver sity , Nanjing 210009 China)
Abstract: Object　T o study the cardio-pr otective effect of crocet in on primary culture cardiac myocy te
injured by hydr oxy l fr ee radicals. Methods　After adding crocetin, primary culture cardiac myocyte w as
injured by 0. 5 mmol / L hydro xy l fr ee radicals w hich w ere generated by Fenton systems. T he act ivity of
lact ic dehydr ogenase ( LDH ) and mitochondrion succinic dehydrogenase ( M SD) w as observed. M itochon-
drion membrane potent ial ( MMP) w as detected by Rh123. The rat io of car diac myocyte apoptosis w as in-
vest igated by flow cytometry and DN A ladder elect ropho resis. Results　Compared w ith the model group,
cr ocet in significant ly decr eased the act ivity of LDH in culture super natant and the rat io o f cardiac myocy te
apoptosis, markedly increased the act ivity of M SD and MMP. Conclusion　Cr ocet in has the protect ive ef-
fect on the apoptosis of cardiac myocy te injured by hydr oxy l f ree radical .
Key words : crocet in; hydroxyl f ree radicals; cardiac myocyte
　　近期的研究结果表明心肌受损的主要途径之一
是氧自由基及其引起的脂质过氧化反应而导致的心
肌细胞凋亡[ 1, 2]。羟自由基 ( OH·)是人体内反应性
最强的氧自由基,尽管它的半衰期短, 扩散范围小,
但极其活泼, 易溶于脂质, 因此 OH·的危害性更
大, 它及其介导的脂质过氧化反应与体内许多重要
生理和病理过程密切相关[ 3]。西红花苷及其苷元西
红花酸是西红花的主要有效成分[ 4] ,具有不饱和共
轭烯酸结构,属类胡萝卜素类,具有极强的抗氧化作
用[ 5]。国外研究资料提示西红花酸可抑制蛋白激酶
·657·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 6 期 2004年 6月

收稿日期: 2003-11-13作者简介:沈祥春,男,山东郯城人,中国药科大学博士研究生,主要研究方向为生化药理学和心血管药理学。
* 通讯作者　Tel: ( 025) 83271322
A ( PKA)、蛋白激酶 C ( PKC) 的作用[ 6] ,本实验室
研究结果表明西红花酸对大鼠、犬由冠脉结扎引起
的心肌缺血及缺血再灌注损伤具有很好的疗效,并
对缺糖缺氧心肌细胞损伤具有保护作用[ 7]。本实验
研究西红花酸对 OH·损伤的体外培养原代心肌细
胞的保护作用及其可能的作用机制。
1　材料
1. 1　药品与试剂:西红花酸,本实验室精制,含量>
90% ( HPLC 法测定)。MTT , Fluka 产品; 低糖
DMEM 培养基, Gibco 产品; P I、罗丹明 123 ( Rho-
damine123, Rh123) 为 Sigma 公司产品; Rnase A,
华美生物工程公司产品;葛根素注射液,广东省大日
生物化学药业有限公司,规格: 100 mg / 2 mL;批号:
0005181。
1. 2　仪器: Eppendorf 5417R 冷冻离心机; FAC-
SCalibur 流式细胞仪, Becton Dickinson 公司; 1420
Victor 2多标记免疫分析仪, Per kinElmer Lifescience
公司; GDS8000 凝胶成像分析系统 ( Syngene Cor -
por ation,英国)。
1. 3　动物:新生 1～3 d SD 乳鼠, 由中国药科大学
实验动物中心提供。
2　方法
2. 1　心肌细胞培养:新生 1～3 d 的 SD 乳鼠, 取心
室肌置 D-hanks 液中剪成约 1 mm3大小的碎块,用
0. 1% 的胰蛋白酶置 37 ℃ 水浴, 磁力搅拌器分次
消化,共消化 8 次, 每次 10 min,将消化所得细胞悬
液收集在 100 mL 培养瓶中, 置于 5% CO2培养箱
中, 37 ℃ 培养 4 h 后吸出细胞悬液, 细胞记数后以
1×106 / mL 接种于培养板, 用含 10% 小牛血清的
DMEM 培养液培养 2～3 d 后, 显微镜下可见细胞
单层同步搏动, 频率约 70～90 次/ min,此心肌细胞
用于以下实验。
2. 2　实验分组及药物处理: OH·由 Fenton 体系
产生 ( Fe2+ + H 2O 2 OH·+ OH- + Fe3+ )。心肌
细胞实验前先用 Hanks 液清洗 3 遍, 实验设心肌
细胞正常对照组,模型对照组, 西红花酸高、低剂量
组 (终浓度分别为 1. 0, 0. 1
mol/ L ) , 葛根素组
( 1. 0 mg / mL)。各组加入相应的药物温孵 1. 5 h 后,
除正常对照组外, 其余各组均加入 0. 5 mmol / L
FeSO 4 与 0. 5 mmo l/ L H2O 2 , 使 OH·终浓度为
0. 5 mmol/ L。继续培养 16 h 后检测各项指标。
2. 3　乳酸脱氢酶 ( LDH ) 活性测定:细胞经损伤处
理后,收集上清液,参照试剂盒说明书测定培养上清
液中 LDH 的活性。
2. 4　线粒体琥珀酸脱氢酶 ( MSD) 活性测定:活细
胞的 MSD 能使外源性的 MTT 还原为蓝紫色结晶
物, 沉积在细胞中(而死细胞无此功能) , 用 DMSO
溶解, 用酶标仪在 570 nm 波长处测定吸光度 ( A )
值,可以反映线粒体的功能,同时可以间接反映活细
胞的数量。
2. 5　线粒体膜电位 ( MMP) 的测定:心肌细胞在
造模 16 h 后, 吸取上清液, 加入缓冲液 [成分
( mmol/ L ) , N aCl 122, NaHCO 3 25, M gSO 4 1. 2,
K 2HPO 4 0. 4, CaCl2 1. 4, HEPES 10, gluco se 10]
37 ℃ 预温孵 30 min, 然后换成含 20
mol/ L
RH123 的缓冲液温孵 120 min,用冰冷的缓冲液冲
洗 3次终止孵育。用 1420 Victor 2多标记免疫分析
仪, 在激发波长 485 nm, 发射波长 535 nm 处测荧
光强度,以荧光强度表示 MMP 的变化。
2. 6　流式细胞仪检测细胞凋亡: 心肌细胞经
0. 06% 的胰蛋白酶消化后, 收集细胞, 用预冷的
70% 乙醇固定, - 20 ℃ 过夜, 500 r/ min 离心 3
m in 去除乙醇, 细胞沉淀用 PBS 洗 1～2 次, 并用
0. 5 mL 磷酸枸橼酸缓冲液 ( PCB ) 抽提小分子
DNA 30 min, 500 r / min 离心 3 min 去除 PCB, 细
胞沉淀用 PI 染液染色 30 m in, 过 300 目尼龙网去
除细胞团, 激发波长 488 nm , 发射波长 630 nm ,
FACSCalibur 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡。
2. 7　DNA 琼脂糖凝胶电泳: 心肌细胞经 0. 06%
的胰蛋白酶消化后, 制成细胞悬液, 收集 6×106细
胞, 加入细胞裂解液 2 mL ( 100 mmol/ L NaCl , 10
mmol / L T ris-HCl , 25 mmol/ L EDTA, pH8. 0 及
0. 1 mg / mL 蛋白酶 K) , 50℃ 作用 12 h,再用苯酚-
氯仿抽提后,无水乙醇沉淀 DNA, 用 Rnase A 去除
RNA。样品以 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳 2 h,溴化乙啶
染色,紫外光下拍照。
2. 8　统计方法:数据均以 x±s 表示,采用 t 检验统
计差异。
3　结果
3. 1　对心肌细胞培养上清液中 LDH 活性及心肌
细胞 MSD活性的影响:结果见表1。OH·可使培养
上清液中 LDH 活性增高, 提示细胞膜损伤,细胞内
LDH 外漏; M SD 的活性降低, 提示心肌细胞能量代
谢障碍,同时间接反应心肌细胞数目减少,而西红花
酸对 OH·所致的 LDH 外漏及 MSD 活性的降低
具有明显的保护作用。
3. 2　对 MMP 的影响: 结果见表 2。0. 5 mmol/ L
OH·使 MMP 降低,表现为 Rh123 的荧光强度减
·658· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 6 期 2004年 6月
弱,西红花酸可以提高 MMP。
表 1　西红花酸对 OH·损伤心肌细胞
LDH 活性和 A570的影响 ( x±s, n= 6)
Table 1　Ef fect of crocetin on LDH activity and A570 of
cardiac myocyte injured by OH· ( x±s, n= 6)
组　别 终浓度 LDH/ (U·L- 1) A 570
正常对照 　　　- 154. 99±20. 30 　0. 987±0. 345
模型 　　　- 245. 50±47. 89# 0. 311±0. 064# #
葛根素 1. 0　mg·mL- 1 141. 35±36. 53* 0. 487±0. 112* *
西红花酸 1. 0
mol·L - 1 122. 33±63. 43* 0. 529±0. 210*
0. 1
mol·L - 1 162. 84±38. 12* 0. 508±0. 394
　　与正常对照组比较: # P< 0. 05　# # P < 0. 01
　　与模型组比较: * P< 0. 05　* * P < 0. 01
　　# P < 0. 05　# # P< 0. 01 v s normal cont rol group
　　* P < 0. 05　* * P< 0. 01 v s model group
表 2　西红花酸对 OH·损伤心肌细胞 MMP
的影响 ( x±s, n= 6)
Table 2　Effect of crocetin on MMP of cardiac myocyte
injured by OH· ( x±s, n= 6)
组　别 终浓度 荧光值 (×100)
正常对照 - 1 359. 2± 215. 7
模型 - 1 150. 1± 31. 2#
葛根素 1. 0 mg·mL- 1 1 277. 9±101. 3*
西红花酸 1. 0
mol·L- 1 1 273. 6±110. 7*
0. 1
mol·L- 1 1 264. 0± 69. 6* *
　　与对照组比较: # P< 0. 05;
　　与模型组比较: * P< 0. 05　* * P < 0. 01
　　# P < 0. 05 v s normal group;
　　* P < 0. 05　* * P< 0. 01 v s model group
3. 3　对心肌细胞凋亡的影响
3. 3. 1　流式细胞仪检测细胞凋亡: 检测结果表明
0. 5 mmol / L OH·作用于培养的原代心肌细胞 16
h 后, 出现明显的凋亡峰, 模型组凋亡率高达
21. 59% ,而西红花酸高、低剂量组均具有明显降低
凋亡率的作用, 凋亡率分别为 8. 77% , 11. 76%, 提
示其对心肌细胞凋亡具有一定的保护作用。正常对
照组与葛根素组的凋亡率分别为 0. 90% , 12. 52%。
3. 3. 2　DNA 琼脂糖凝胶电泳结果: 见图 1。0. 5
mmol/ L OH·使心肌细胞 DNA 有规律的断裂,出
现明显细胞凋亡的特征图谱即“DNA ladder”。
4　讨论
　　西红花酸为多不饱和共轭烯酸的类胡萝卜素类
物质,具有极强的抗氧化作用[ 5]。OH·是一种氧自
由基,直接作用于膜结构上的不饱和脂肪酸,诱发脂
质过氧化反应, 使膜的基本特性如变构、离子传递、
酶活性等发生变化,从而改变它们的功能[ 8]。本实验
结果表明 0. 5 mmol/ L OH·损伤的心肌细胞的培
养上清液中 LDH 活性明显提高,而西红花酸两个
A-OH·( 0. 5 mm ol/ L)　B-西红花酸 ( 0. 1
mol/ L )
C-西红花酸 ( 1. 0
mol/ L )　D-对照品　E-葛根素 ( 1 mg/ m L)
A-OH· ( 0. 5 mmol/ L)　B-crocet in ( 0. 1
mol/ L)
C-crocet in ( 1. 0
mol/ L)　D-cont rol　E-puerarin ( 1 mg/ m L)
图 1　心肌细胞 DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig. 1　Agarose gel electrophoretogram of DNA
extracted from cardiac myocytes
剂量组均可以明显降低上清液中的 LDH。MSD 是
反映细胞存活的重要指标之一,常采用 MT T 法, 测
定 A 570反应该酶的活性。本实验结果表明, 0. 5
mmol / L OH·明显降低 A 570, 1. 0
mol/ L 西红花
酸可以明显提高 MT T 法检测心肌细胞 A 570的值。
本实验中 0. 5 mmol / L OH·所致细胞培养上清液
中 LDH 增加及 A 570降低与文献报道一致[ 9]。西红花
酸降低细胞培养上清液中 LDH ,增强线粒体琥珀酸
脱氢酶活力, 提示其对 OH·所致的膜损伤具有一
定的保护作用。
Sureda 等发现 Rh123 主要聚集在线粒体, 通
过测定细胞内 Rh123 的荧光强度可以反映线粒体
膜电位变化[ 10]。细胞受损后, 线粒体膜通透性增加,
膜电位降低,线粒体对 Rh123 的荧光强度下降。本
实验结果证实, OH·可促使线粒体膜通透性增加,
降低 Rh123 的荧光强度, 而西红花酸可以提高
Rh123 的荧光强度, 提示西红花酸对 OH·损伤的
心肌细胞线粒体膜具有保护作用,这与前期体外抗
氧化研究结果相一致 [ 5]。
细胞凋亡是在基因调控下的细胞死亡。细胞膜
鼓泡或出芽、核固缩、胞浆浓集及凋亡小体形成为其
形态学特征, DNA 断裂在琼脂糖凝胶电泳图谱上
呈“梯”状带 ( DNA Ladder ) 为其生化特征。本实验
采用 DNA 琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪两种检测
方法考察 OH·对心肌细胞凋亡的影响, 结果提示
OH·可导致心肌细胞凋亡, 西红花酸对 0. 5 mmo l/
L OH·所致的细胞凋亡具有一定的改善作用,表现
为减低心肌细胞的凋亡率。
本实验结果提示, 西红花酸对 0. 5 mmol/ L
OH·诱导的心肌细胞损伤(凋亡)具有保护作用,其
·659·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 6 期 2004年 6月
可能的作用机制是通过西红花酸的抗氧化作用,而
发挥膜保护作用,从而阻止 LDH 外漏,保护线粒体
膜,提高线粒体膜电位和琥珀酸脱氢酶活力,保证心
肌细胞的能量供应。
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肉苁蓉总苷对大鼠局灶性脑缺血损伤的影响
蒋晓燕,王晓雯, 王雪飞,刘凤霞,孟新珍, 朱伟江

(新疆医科大学 药理教研室,新疆 乌鲁木齐　830054)
摘　要: 目的　研究肉苁蓉总苷 ( GCs) 对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用。方法　采用插线法阻塞大鼠大脑中
动脉 ( M CAO) 制造大鼠局灶性脑缺血模型, 采用 NBT 染色测定脑梗死范围,用“重量求面积法”计算梗死组织占
对侧大脑质量的百分比作为对梗死范围的判定,行为指标评分采用 11 分评分制, 并测定缺血脑组织的抗氧化酶活
性及丙二醛 ( M DA ) 含量。结果　GCs 125, 250 mg / kg 可明显缩小脑梗死范围,改善神经症状,脑组织超氧化物歧
化酶 ( SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 ( GSH-Px) 的活性明显升高, MDA 含量显著下降。结论　GCs 对大鼠局灶性脑
缺血损伤具有神经保护作用, 此作用可能与 SOD , GSH-Px 活性水平的升高有关。
关键词: 肉苁蓉总苷; 局灶性脑缺血; 抗氧化酶; 丙二醛
中图分类号: R286. 10　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 06 0660 03
Effects of glycosides of cistanche on focal cerebral ischemic rats
JIANG Xiao-yan, WANG Xiao-w en, WANG Xue-fei, L IU Feng-x ia,
M EN G Xin-zhen, ZHU Wei-jiang
( Departm ent of Pharmacolog y , Xinjiang M edical Univ ersit y, U rumqi 830054, China)
Abstract: Object　To study the protect ive ef fects of g lycosides o f cistanche ( GCs) on focal cer ebral
ischemic rats. Methods　Focal cerebral ischemia in r ats w as induced by 24 h occlusion of the middle cere-
br al artery ( MCAO) . The infarct ar ea w as measur ed by nitrobenzene thio cyanate ( NBT ) staining tech-
nique. T he content o f neuro logical deficit s w as evaluated by 0—11 scales. T he act iv it ies o f ant io xidases
and contents of MDA in ischemic brain t issue w ere analyzed. Results　Significant decrease in infar ct area
and improvement in neurolo gical deficit s were observed by oral adm inistrat ion of GCs 125, 250 mg / kg , re-
spect iv ely . Significant increase in act iv it ies o f SOD and GSH-Px , and significant decrease in contents of
MDA in r ats w ere also observ ed af ter 24 h MCAO. Conclusion　GCs has a neur opr otect iv e ef fect against
fo cal cerebral ischemia and the ef fect may be related to the increase in act ivit ies of SOD and GSH-Px .
Key words : glyco sides of cistanche ( GCs) ; fo cal cerebral ischemia; ant iox idant enzyme; MDA
·660· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 6 期 2004年 6月
收稿日期: 2003-10-13基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目 ( 200121112)作者简介:蒋晓燕( 1972—) ,女,湖北省武汉市人。讲师,硕士,现于上海第二医科大学神经生物学实验室攻读博士学位,研究方向为生化药理。Tel: ( 021) 63846590-776577　E-mail: w xf jxy22103@ hotmail. com