全 文 ：丹酚酸 B 和丹参酮Ê A 不同配比对肿瘤坏死因子 Α
损伤大鼠心脏微血管内皮细胞的影响
张　萌1, 张伯礼1, 高秀梅1, 郭利平2, 杜　嵘1Ξ
(11 天津中医学院 中医药研究中心, 天津　300193; 21 天津中医学院第一附属医院, 天津　300193)
摘　要: 目的　观察不同配比的丹酚酸 B (Sal B )、丹参酮Ê A (T anÊ A ) 对体外肿瘤坏死因子 Α (TN F2Α) 损伤大鼠
心脏微血管内皮细胞 (CM EC) 的影响。方法　采用 CM EC 体外培养技术, 建立 TN F2Α损伤模型, 以细胞活力, 细
胞培养液中乳酸脱氢酶 (LDH ) 释放、一氧化氮 (NO ) 合成、内皮素 (ET ) 分泌、超氧化物歧化酶 (SOD ) 活性及丙
二醛 (M DA ) 含量的变化为评价指标, 观察 Sal B 和 T anÊ A不同配比 (10∶0, 8∶2, 5∶5, 2∶8, 0∶10) 对 TN F2Α
损伤 CM EC 的保护作用。结果　SalB 和 T anÊ A (5∶5) 组明显提高细胞活力, SalB 和 T anÊ A (8∶2) 组显著降低
LDH 释放水平, T anÊ A 促进 NO 合成、降低 ET 分泌以及抗氧化的作用最好。结论　Sal B 和 T anÊ A 的各配比组
均能明显改善细胞的损伤, 最佳配比根据检测指标的不同而不同。
关键词: 丹酚酸 B; 丹参酮Ê A ; 肿瘤坏死因子 Α; 心脏微血管内皮细胞
中图分类号: R 28515　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 01 0063 03
Effect of d ifferen t proportion s of sa lv ianol ic ac id B and tan sh inone Ê A on ra t card iac
m icrova scular endothel ia l cells in jured by tum or necrosis factor Α in vitro
ZHAN G M eng1, ZHAN G Bo2li1, GAO X iu2m ei1, GUO L i2p ing2, DU Rong1
(11R esearch Center of T radit ional Ch inese M edicine, T ian jin Co llege of T radit ional Ch inese M edicine, T ian jin 300193,
Ch ina; 2. F irst A ffilia ted Ho sp ita l of T ian jin Co llege of T radit ional Ch inese M edicine, T ian jin 300193, Ch ina)
Key words: sa lviano lic acid B (Sal B ) ; tan sh inone Ê A (T an Ê A ) ; tumo r necro sis facto r Α (TN F2Α) ;
card iac m icrovascu lar endo thelia l cells (M EC)
　　丹参是常用的活血化瘀药, 广泛应用于心脑血
管疾病的治疗。丹参的化学成分为水溶性酚酸和脂
溶性二萜醌[1 ]。丹酚酸 B (Sal B ) 是丹参的主要水
溶性成分, 是非常强的抗氧化剂[2 ] , 不仅对心血管系
统具有一定的保护作用, 还在体外逆转肝炎肝纤维
化[3 ]。丹参酮Ê A (T anÊ A ) 是丹参主要脂溶性成分,
为蒽醌类衍生物, 具有抗炎、抗氧化作用, 对心血管
系统有较好的保护作用[4 ]。
肿瘤坏死因子 Α (TN F2Α) 是由激活的巨噬细
胞分泌的一类具有多种生物学效应的细胞因子。病
理状态下 TN F2Α可损伤心功能、诱导心肌细胞凋
亡[5 ] , 而且 TN F2Α血清水平的变化与多种心脏疾病
相关[6 ]。为寻找 Sal B 与 T anÊ A的最佳配比和各自
作用的靶点, 本实验以 TN F2Α为刺激因素作用于
体外培养的心脏微血管内皮细胞 (CM EC ) , 观察
Sal B 2T anÊ A不同配比对损伤 CM EC 的保护作用。
1　材料与方法
111　材料: W istar 乳鼠由天津药物研究院实验动 物室提供。Sal B 纯度 80% ; T anÊ A纯度 80% , 均由清华大学分析中心提供。R PM I21640 (Gibco , 美国) ; TN F2Α (Sigm a, 美国) ; 第Ð 因子相关抗原抗体及免疫组化 SABC 染色试剂盒购自天津灏洋生物制品科技公司; 噻唑蓝 (M T T )、二甲基亚砜 (DM 2SO , Sigm a, 美国) ; LDH 检测试剂盒购自北京中生生物高技术公司; NO , SOD ,M DA 检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所; ET 检测试剂盒购自北京北免东雅生物技术研究所。112　CM EC 的培养与鉴定: 参照N ish ida 等方法略加改动[7 ]。无菌条件下取出W istar 乳鼠心脏, D 2H ank s 液冲洗, 去除大血管及结缔组织等。将心脏剪碎, 用 012% 胶原酶 (Sigm a, 美国) 和 011% 胰蛋白酶 (Gibco , 美国) 37 ℃ 振摇消化 30 m in, 分离下的细胞过 200 目网筛, 悬于含 20% 胎牛血清的 R PM I21640 培养液中 (内含青霉素 100 U ömL ,链霉素 100 ΛgömL )。调整细胞浓度至 104～ 105ömL , 接种于 75 cm 2培养瓶中, 于 37 ℃, 5% CO 2培
·36·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2003206207
基金项目: 国家重点基础研究发展规划“973”项目资助 (1999054403)
养箱中培养 2 h。去除未贴壁的细胞, 换含 10 m göL
ECGF (Sigm a, 美国) R PM I21640 培养液。每 2～ 3
d 换液 1 次, 直至细胞长成细胞单层, 铺满瓶底即可
传代。取稳定生长的第 3 代细胞供实验用。第Ð 因
子阳性鉴定培养的细胞为内皮细胞。
113　实验分组: 取细胞数均匀的 CM EC, 分种于 96
孔和 24 孔培养板孵育 24 h, 换既无血清又无 ECGF
的 R PM I21640 培养液继续培养 24 h。随机分组, 分
别加不同配比 (10∶0, 8∶2, 5∶5, 2∶8, 0∶10) 的
Sal B 和 T anÊ A , 终浓度均为 250 ΛgöL。除对照组
外, 每组同时加 TN F2Α (终浓度 500 U ömL ) , 继续培
养 24 h 后进行指标检测, 每组设 8 个平行孔。
114　样品检测: 取培养上清液以半自动生化分析仪
测定 LDH 释放量; 取培养细胞以M T T 比色法测
定细胞活力; 取培养上清液以硝酸还原酶法测定
NO 含量; 取培养上清液用放免法测定 ET 释放水
平; 取培养上清液用嘌呤氧化酶法测定 SOD 活性;
取培养上清液用硫代巴比妥酸法测定M DA 含量。
115　统计学处理: 数据以 x ±s 表示, 用 SPSS 10. 0
软件进行方差分析。
2　结果
211　对 TN F2Α损伤 CM EC 的细胞活力、LDH 的
影响: TN F2Α损伤 CM EC 后细胞活力明显降低、
LDH 释放增加, Sa l B 与 T anÊ A能明显改善细胞的
TN F2Α损伤, 表现为细胞活力增强, LDH 释放减
少。两者配伍后的作用优于单一药物。见表 1。
表 1　Sal B-TanÊ A各配比组对 TNF-Α 损伤 CM EC
的细胞活力和 LD H 的影响 (x±s, n= 8)
Table 1　Effect of d ifferen t proportion s of Sa l B-TanÊ A
on cell activ ity and LD H of CM EC in jured
by TNF-Α (x±s, n= 8)
组　别 Sal B2T anÊ A M T T ö(A 值) LDH ö(U ·L - 1)
对照 　　0∶0 01120±01004 54100±8147
TN F2Α 0∶0 01090±010043 68163±71953
Sal B 10∶0 01090±01002 51125±2182△△
Sal B2T anÊ A 8∶2 01094±01003 43175±4133△△
5∶5 01104±01006△△ 49100±5145△△
2∶8 01098±01004△ 54138±3102△△
T anÊ A 0∶10 01092±01004 51150±1185△△
　　与对照组比较: 3 P < 0105
　　与 TN F2Α组比较: △P < 0105　△△P < 0101
　　3 P < 0105 vs con tro l group
　　△P < 0105　△△P < 0101 vs TN F2Αgroup
212　对 TN F2Α损伤 CM EC 的NO , ET 的影响: 随
着 T anÊ A 所占比例增加, NO 的产生随之升高, 提
示 T anÊ A 有促进 NO 产生的作用; 各配比组均能
减少 ET 释放, T anÊ A的作用最显著。见表 2。
表 2　Sal B-TanÊ A各配比组对 TNF-Α 损伤CM EC
的 NO 和 ET 的影响 (x±s, n= 8)
Table 2　Effect of d ifferen t proportion of Sa l B-TanÊ A
on NO and ET of CM EC in jured
by TNF-Α (x±s, n= 8)
组　别 Sal B2T anÊ A NO ö(Λmo l·L - 1) ET ö(pg·mL - 1)
对照 　0∶0 531171±41123 58160±13173
TN F2Α 0∶0 633184±331643 81146± 71903
Sal B 10∶0 570112±52117 60184± 9164
Sal B2T anÊ A 8∶2 689103±55190 57171±12155△
5∶5 711189±40183△ 66172±10153
2∶8 708154±20157△ 62185± 8150
T anÊ A 0∶10 716138±32120△ 54172± 9107△
　　与对照组比较: 3 P < 0105; 　与 TN F2Α组比较: △P < 0105
　　3 P < 0105 vs con tro l group; 　△P < 0105 vs TN F2Αgroup
213　对 TN F2Α损伤 CM EC 的 SOD , M DA 的影
响: TN F2Α损伤 CM EC 后, SOD 活性降低, M DA
含量明显增加, 提示 TN F2Α损伤与过氧化损害相
关。Sal B 2T anÊ A 的各配比组均有升高 SOD , 减少
M DA 的趋势。T anÊ A 抗氧化的能力最强。见表 3。
表 3　SalB-TanÊ A各配比组对 TNF-Α损伤CM EC
的 SOD 和MDA 的影响 (x±s, n= 8)
Table 3　Effect of d ifferen t proportion of Sa l B-TanÊ A
on SOD and MDA of CM EC in jured
by TNF-Α (x±s, n= 8)
组　别 SalB 2T anÊ A SOD ö(NU ·mL - 1) M DA ö(nmo l·mL - 1)
对照 　0∶0 45149±0197 1115±01102
TN F2Α 0∶0 44194±0137 1152±01183
SalB 10∶0 45192±0185 1113±0117△
SalB2T anÊ A 8∶2 45151±1137 1135±0117
5∶5 46131±1115 1137±0111
2∶8 45175±0189 1138±0108
T anÊ A 0∶10 47142±1147△ 0190±0109△
　　与对照组比较: 3 P < 0105; 　与 TN F2Α组比较: △P < 0105
　　3 P < 0105 vs con tro l group; 　△P < 0105 vs TN F2Αgroup
3　讨论
　　TN F2Α是具有多种生物学效应的细胞因子, 对
心血管系统的作用主要包括, 增强黏附分子的表达,
释放内皮NO , 提高血管通透性等[8 ]。本研究结果表
明, TN F2Α与 CM EC 共同孵育后LDH 释放、ET 分
泌及M DA 含量均明显升高; 细胞活力显著降低;
SOD 活性有降低的趋势。LDH 广泛存在于各种组
织细胞的细胞浆中, 病理情况下细胞膜通透性增高,
LDH 大量释放到细胞外。ET 是一种血管活性多
肽, 是目前所知作用最强的长效血管收缩剂。M DA
为脂质过氧化产物, 可严重破坏细胞膜结构, 导致细
胞肿胀、坏死。本实验结果提示 TN F2Α通过内皮分
泌 ET 及脂质过氧化等作用导致 CM EC 损伤。
本实验观察 Sal B 2T an Ê A 不同配比对 TN F2Α
·46· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
导致 CM EC 损伤的保护作用, 从中发现不同配比的
药效变化并寻找两者的最佳比例和各自作用的靶
点。Sal B 由三分子丹参素和一分子咖啡酸组成, 由
于含有酚羟基, 有很强的抗氧化作用[9 ]。T anÊ A 为
樱红色针状结晶, 体外研究表明, T an Ê A 有较强的
抗炎、抗氧化能力, 可降低 TN F2Α诱导的升高的人
脐静脉内皮细胞 ICAM 21 表达; 抑制低密度脂蛋白
的氧化[10, 11 ]。在 TN F2Α 损伤条件下, Sa l B 与
T anÊ A 各配比组均可提高 CM EC 活力, 降低 LDH
释放, 但单用的作用不如二者配伍后明显。T anÊ A
增加NO 合成、减少 ET 释放的作用最显著。各配比
组均有增强 SOD 活性, 减少M DA 产生的趋势, 但
以 T anÊ A 抗氧化的能力最强。提示不同中药组份的
不同配比产生不同效应。
本实验重点研究组份的配比, 从中分析方剂多组
份配比与方剂配伍的相关性, 揭示主要药效组份对主
要靶点的影响规律及整体综合调节的生物学机制。这
为在明确主靶点, 强化主效应, 降低负效应的基础上,
建立以组份配伍研制现代复方中药的新模式, 寻求高
效可控的现代复方中药提供实验依据。
致谢: 天津市南开医院同位素室王民宪主任协
助检测 ET。
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甘遂醇提物中 4 种二萜类化合物的体内抗病毒活性研究
郑维发Ξ
(江苏省药用植物生物技术重点实验室, 江苏 徐州　221116)
摘　要: 目的　阐明甘遂醇提物中 4 种化合物: 甘遂大戟萜酯 A (É ) , 132十一酰基232(2, 42二甲基丁酰基) 巨大戟
萜酯 (Ê ) , 32(癸22, 42二烯酰基) 巨大戟萜酯 (Ë ) 及甘遂萜酯A (Ì ) 的体内抗病毒活性。方法　采用鼻吸入法以
流感病毒亚甲型小鼠肺炎适应株 FM 1对小鼠造模, 对病毒感染小鼠分别 ig 4 种二萜类化合物, 以对小鼠病毒感染
肺指数的抑制率为体内抗病毒活性指标。以3H 2T dR 渗入法测定 4 种二萜类化合物对小鼠淋巴细胞增殖反应的影
响。结果　4 种化合物都表现出一定的体内抗病毒活性, É～ Ì 分别在 20, 40, 50, 30 m gö(kg·d) 以下, 抗病毒活
性随剂量增加而增强; 3 种具有四环结构的 Ingeno l 衍生物其体内抗病毒活性呈现出明显的构效关系, 在适当剂量
下, C213, C220 有长链酰基的É 和Ê 表现出较强的体内抗病毒活性, 而这两个位点没有长链酰基的Ë 仅表现出弱
的抗病毒活性。在低浓度 (01025～ 7185×10- 4 ΛgömL ) 下, 4 种二萜类化合物对 Con A 诱导的淋巴细胞增殖有显
著的增强作用。结论　甘遂二萜类化合物中, C213, C220 有长链酰基的 Ingeno l 衍生物有显著的体内抗病毒活性,
其抗病毒的机制可能主要是通过提高机体的细胞免疫来实现的。
关键词: 甘遂; 二萜类化合物; 抗病毒活性; 淋巴细胞增殖
中图分类号: R 28515　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 01 0065 04
·56·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2003204227
基金项目: 江苏省政府青年科学基金资助项目 (BQ 98040) ; 江苏省教育厅自然科学基金重点项目 (98KJBZ300001)。
作者简介: 郑维发 (1962—) , 男, 博士后, 硕士生导师, 教授, 主要从事天然产物成分化学和药理学研究。
T el: (0516) 3403179　E2m ail: yyzw @xznu. edu. cn