全 文 ：肠内菌群对七叶皂苷体外代谢转化产物的研究
陈继永 1, 2 ,吴立军 1 ,滕厚雷 2 ,刘　珂 2
( 1. 沈阳药科大学中药学院 ,辽宁 沈阳　 110016;　 2. 烟台大学药学院 ,山东 烟台　 264003)
摘　要: 目的　通过离体实验观察人肠道内细菌对七叶皂苷的代谢。方法　离体培养人肠道内细菌 ,与七叶皂苷厌
氧温孵 ,采用硅胶柱色谱和制备型高效液相色谱等方法对七叶皂苷的肠菌代谢产物进行分离和代谢转化产物的鉴
定。 结果　代谢产物经 IR、 MS和 NM R鉴定为: 21β-巴豆酰基原七叶皂苷元 (Ⅰ ) , 21β -当归酰基原七叶皂苷元
(Ⅱ ) , 21β -巴豆酰基 -22α-乙酰基原七叶皂苷元 (Ⅲ ) , 21β -当归酰基 -22α-乙酰基原七叶皂苷元 (Ⅳ )。其中Ⅲ和Ⅳ为首
次发现的新天然产物。 结论　在离体条件下 ,七叶皂苷可被人肠内菌代谢为 21β -巴豆酰基原七叶皂苷元 (Ⅰ )、 21β -
当归酰基原七叶皂苷元 (Ⅱ ) , 21β -巴豆酰 -22α-乙酰基原七叶皂苷元 (Ⅲ )、 21β -当归酰基 -22α-乙酰基原七叶皂苷元
(Ⅳ )。
关键词: 七叶皂苷 ;七叶树属 ;肠内菌群
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 11 0970 04
Study on aescin metabolism in intestinal flora in vitro
CHEN Ji-yong
1, 2
, WU Li-jun
1
, TEN G Hou-lei
2
, LIU Ke
2
( 1. Colleg e of Chinese Ma teria Medica , Shenyang Pha rmaceutical Univ ersity, Shenyang 110016, China;
2. Schoo l o f Pharmacy, Yantai Univ e rsity , Yantai 264003, China )
Abstract: Object　 To study the aescin metabolism in human intestinal f lora in vit ro. Methods　 Hu-
man intestinal flo ra and aescin w ere incuba ted in vitro. T LC and HPLC were used to examine aescin and i ts
metaboli tes; the metabolites w ere separated and purified by si lica g els column chromatog raphy and pre-
paration high perfo rmance liquid ch romatog raphy. Results　 Their st ructures w ere identified by IR, M S
and NMR as 21β -tig loy l-pro toaescigenin (Ⅰ ) , 21β-angeloy l-pro toaescigenin (Ⅱ ) , 21β-tiglo yl-22α-acety l-
protoaescig enin (Ⅲ ) , 21β-angeloy l-22α-acetylpro toaescig enin (Ⅳ ) . Among themⅡ andⅣ were new nat-
ural products found from this plant. Conclusion　 Aescin can be in v itro metabolized by intestinal f lora into
21β-tig loyl-pro toaescig enin (Ⅰ ) , 21β -angeloyl-pro toaescig enin (Ⅱ ) , 21β -tig loy l-22α-acetylprotoaescig enin
(Ⅲ ) , 21β -angeloyl-22α-acety lpro toaescig enin (Ⅳ ) .
Key words: aescin; Aesculus L. ; intestinal f lo ra
　　七叶皂苷为七叶树属 Aesculus L. 多种植物中
含有的总皂苷 ,现收载于德国药品法典 ( DAC) 1997
年版 [1 ]和中国国家药品标准 [2 ] ,其主要成分为七叶
皂苷 A, B, C, D(α-aescin and β -aescin) ,化学结构见
图 1。七叶皂苷的主要生物活性为抗炎、消肿、抗渗
出。在欧洲 ,其适应症主要为外周循环障碍所致的水
肿 ,主要以口服和外用剂型为主。七叶皂苷口服的原
型生物利用度极低 ,仅为 0. 98% [3, 4 ]。七叶皂苷在体
内的药物代谢研究较少 ,其肠道菌代谢的研究目前
尚未见报道。 有关天然皂苷肠道代谢的研究以日本
学者小桥恭一教授为先导者 ,他先后证明人参皂苷、
甘草皂苷等多种皂苷口服大多以经肠道菌代谢后所
得的活性代谢产物入血发挥其疗效。并提出了天然
前药的概念 [5 ]。 本实验试图研究七叶皂苷的体内肠
道菌代谢转化途径。
本实验采用离体实验的代谢研究方法 ,用富含
肠内菌的粪便悬浮液与药物在厌氧条件下温孵 ,利
用硅胶柱色谱和制备型高效液相色谱从温孵物中得
到了 4种代谢产物 ,采用核磁共振谱等方法鉴定了
它们的结构 ,分别为 21β-巴豆酰基原七叶皂苷元
(Ⅰ ) , 21β -当归酰基原七叶皂苷元 (Ⅱ ) , 21β-巴豆酰
基-22α-乙酰基原七叶皂苷元 (Ⅲ ) , 21β -当归酰基-
22α-乙酰基原七叶皂苷元 (Ⅳ ) ,并根据此推断了七
叶皂苷的肠道菌代谢途径。
·970· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
收稿日期: 2003-05-06作者简介:陈继永 ( 1973- ) ,男 , 1997年毕业于沈阳药科大学 ,现在读沈阳药科大学药化专业在职硕士。
* 通讯作者　 Tel: ( 0535) 6713858　 E-mai l: liuke@ luye-ph arm. com
R1 R2 R3
七叶皂苷 A(β-aescin) -巴豆酰基 -COCH3 -H
七叶皂苷 B(β-aescin) -当归酰基 -COCH3 -H
七叶皂苷 C(α-aescin) -巴豆酰基 -H -CO CH3
七叶皂苷 D(α-aescin) -当归酰基 -H -CO CH3
图 1　七叶皂苷的化学结构
Fig. 1　 Chemical structure of aescin
1　仪器和材料
熔点用 X- 4熔点测定仪。红外光谱用 Perkin
- Elmer FT- IR光谱仪 , KBr压片。核磁共振波谱
仪 为 DELT A - 600 型 ( 1H-NM R, 600 MHz,
13
C-NMR, 150 M Hz; TM S为内标 )。 Mariner TOF
- M S质谱仪。柱色谱用硅胶 ( 200～ 300目 )及薄层
色谱用硅胶均系青岛海洋化工厂产品。厌氧培养罐
(825- A型 ,沈阳市第五人民医院 ) ;美国 Agi lent
1100高效液相色谱仪 ,检测波长为 220, 205 nm。美
国 Varian制备型液相色谱仪 ,制备型色谱柱: Hy-
persi l C18 ( 300 mm× 20 mm, 10μm) ,流动相为甲醇
-水 ,流速为 5. 0 mL /min。七叶皂苷 (含七叶皂苷 A,
B, C, D)由山东绿叶制药股份有限公司提供 ,经精制
后纯度为 98% ;厌氧培养液的组成及制备 [6 ]: 37. 5
m L A液 ( 0. 78% K2 HPO4 ) , 37. 5 mL B ( 0. 47%
KH2 PO4 , 1. 18% NaCl, 1. 2% ( N H4 ) 2 SO4 , 0. 12%
CaCl2 , 0. 25% MgSO4· H2O ) , C液 50 mL 8%
Na2 CO3。 L-半胱氨酸 0. 5 g , 2 mL 25% L-抗坏血
酸 ,牛肉膏 1 g ,蛋白胨 1 g ,营养琼脂 1 g ,加蒸馏水 ,
盐酸调 pH 7. 5～ 8. 0。乙腈为色谱纯 ,其他化学试剂
均为分析纯。
2　离体厌氧培养人肠内菌对七叶皂苷的代谢
按文献方法 [7 ]取新鲜的健康志愿者的粪便 ,按
0. 5 g∶ 1. 5 mL加入厌氧培养液 ,用玻璃棒打碎 ,经
纱布滤过得到含菌培养液。 加入七叶皂苷钠使培养
液中皂苷的浓度为 1 mg /mL,并作空白对照 ,密闭
恒温 37℃培养。分别于 0, 8, 12, 24, 48, 72 h各取样
5 mL,经水饱和正丁醇萃取 3次 ,合并萃取液蒸干 ,
残渣加甲醇溶解并定容至 5 mL,供 HPLC检测用。
3　色谱条件
流动相为乙腈 -水 ( 40∶ 60) ; 20～ 50 min,乙腈
量 40～ 80; 51～ 55 min,乙腈量 80～ 40; 56～ 60
min,乙腈量 40;柱温为 40℃ ,流速为 1. 0 mL /min。
检测波长为 220, 205 nm。
4　代谢产物的分离和纯化
按上述方法配制厌氧培养液 2 L,加入七叶皂
苷厌氧培养 ,培养结束后 ,溶液经水饱和正丁醇萃
取 ,萃取液浓缩蒸干后 ,得浸膏 ,经硅胶柱色谱分离 ,
以氯仿-甲醇梯度洗脱 ,在氯仿 -甲醇 ( 9∶ 1)洗脱部
分得化合物 246 nm,此流份中得到空白对照中未出
现的几个峰 ,且极性较小 , T LC鉴别硫酸 -乙醇显红
色 ,初步确定为皂苷的代谢物 ,经过进一步柱色谱分
离和制备 HPLC分离 ,得到 4个主要代谢产物Ⅰ ～
Ⅳ。
5　代谢产物的鉴定
化合物Ⅰ :为白色粉末。 13 C-NMR数据见表 1。
ESI-M S, IR,
1
H-NM R,
13
C-NMR光谱数据与文献报
道 [8 ]的一致 ,鉴定为 21β-巴豆酰基原七叶皂苷元。
化合物Ⅱ : 白色粉末。 13 C-NMR数据见表 1。
ESI-M S, IR,
1
H-NM R,
13
C-NMR光谱数据与文献报
道 [8, 9 ]的一致 ,化合物Ⅱ鉴定为 21β-当归酰基原七叶
皂苷元。
化合物Ⅲ :白色粉末。 ESI-M S: m /z 630[M ]+ ,
530[M
+
- tig lic acid ] , 653 [M
+
+ Na ] , 470 [M
+
-
tig lic acid- CH3 CO - H2O ]。 1 H-NMR( 600 M Hz,
py ridine-d5 )δ: 0. 92, 1. 00, 1. 10, 1. 31, 1. 54, 1. 81
(各 3H, s, 6× CH3 ) ; 1. 58( 3H, d, Tig-4-Me) , 1. 91
( 3H, d, Tig-5-M e ) , 1. 84 ( 3H, s, O Ac-Me ) , 3. 11
( 1H, t , H-3) , 3. 67( 1H, d, Ha-24) , 6. 48( 1H, d, J=
10. 0 Hz, H-21) , 7. 01( 1H, dq, Tig-3)。比较Ⅲ与Ⅰ
的 13 C-NM R数据 ,除多一个乙酰基信号外 , 22位碳
的化学位移向高场移动了 2,推断Ⅲ为Ⅰ的 22位乙
酰化物。 13C-NMR数据见表 1。综上数据 ,化合物Ⅲ
鉴定为 21β -巴豆酰基 -22α-乙酰基原七叶皂苷元。
化合物Ⅳ :白色粉末。 ESI-M S: m /z 630 [M ]+ ,
530 [M+ - angelic acid ] , 653[M+ + Na ] , 470 [M+ -
angelic acid- CH3 CO- H2O ]。 1 H-NMR( 600 M Hz,
py ridine-d5 )δ: 0. 92, 1. 00, 1. 13, 1. 31, 1. 56, 1. 82
(各 3H, s, 6× CH3 ) ; 2. 05( 3H, d, Ang-4-M e) , 1. 96
·971·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
( 3H, s, Ang-5-Me ) , 1. 82 ( 3H, s, O Ac-Me ) , 2. 87
(1H, dd, C18-H) , 3. 09( 1H, t , C3 -H) , 5. 88( 1H, dq,
Ang-3) , 6. 48( 1H, d,J= 10. 0 Hz, H-21)。比较Ⅳ与
Ⅱ的 13 C-NMR数据 ,除多一个乙酰基信号外 , 22位
碳的化学位移向高场移动了 2,推断Ⅳ为Ⅱ的 22位
乙酰化物。 1 3C-NMR数据见表 1。综上数据 ,化合物
Ⅳ鉴定为 21β -当归酰基 -22α-乙酰基原七叶皂苷元。
表 1　代谢产物Ⅰ ～ Ⅳ的 13C-NMR光谱数据 (氘代吡啶 )
Table 1　 13C-NMR spectral data of compounds
Ⅰ -Ⅳ ( pyridine-d5)
碳位 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
1 　 38. 9 　 38. 9 　 38. 9 　 38. 9
2 28. 5 28. 5 28. 5 28. 4
3 80. 1 80. 1 80. 1 80. 1
4 43. 2 43. 2 43. 2 43. 2
5 56. 4 56. 4 56. 4 56. 3
6 19. 1 19. 1 19. 1 19. 1
7 33. 5 33. 5 33. 5 33. 5
8 40. 1 40. 1 40. 1 40. 1
9 47. 2 47. 2 47. 3 47. 3
10 37. 0 37. 0 37. 0 37. 0
11 24. 1 24. 1 24. 2 24. 2
12 123. 1 123. 1 123. 1 123. 1
13 143. 5 143. 5 142. 8 142. 7
14 41. 9 41. 9 41. 8 41. 8
15 34. 4 34. 4 34. 6 34. 6
16 68. 0 67. 9 67. 6 67. 7
17 48. 2 48. 2 47. 2 47. 2
18 40. 5 40. 5 40. 6 40. 6
19 47. 9 47. 9 47. 1 47. 1
20 36. 4 36. 2 36. 3 36. 1
21 82. 0 81. 6 81. 5 81. 2
22 72. 9 73. 0 71. 1 71. 0
23 23. 6 23. 6 23. 6 23. 5
24 64. 6 64. 6 64. 6 64. 5
25 16. 9 16. 8 17. 0 17. 0
26 16. 2 16. 2 16. 2 16. 2
27 27. 4 27. 4 27. 4 27. 4
28 66. 0 66. 0 66. 4 66. 4
29 29. 9 29. 9 29. 8 29. 8
30 20. 3 20. 4 20. 2 20. 2
T或 A-1 168. 6 168. 6 168. 4 168. 5
T或 A-2 129. 9 129. 6 129. 8 129. 5
T或 A-3 136. 1 136. 0 136. 2 136. 2
T或 A-4 14. 1 15. 9 14. 1 15. 8
T或 A-5 12. 4 21. 1 12. 4 20. 7
乙酰基 -1 170. 7 170. 7
乙酰基 -2 20. 8 21. 0
　　 T= 巴豆酰基 , A= 当归酰基
T= tigloyl , A= angeloyl
6　讨论
肠道内细菌对具有苷键的药物进行水解是因为
糖类化合物是肠道内细菌重要的碳源 [10 ]。在离体实
验中 ,人肠内菌对 aescin的代谢产物经 HPLC检测
分析 ,可以看到随着培养时间的延长 ,原型药物在逐
渐减少 ,代谢产物的量逐渐增多 ,但是代谢时间比较
长 ,可能是体外培养与体内是有差别的。由于七叶皂
苷的极性较大 ,而代谢产物的极性很小 ,本实验采用
HPLC梯度洗脱的方式 ,结合 T LC的检测结果 ,更
准确方便的观察原型药物和代谢产物的变化。也有
必要进一步对口服 aescin后原型及代谢产物入血
的情况进行研究 ,并对其生物活性方面进行考察 ,从
而对新药的开发奠定化学和药理学基础。
基于上述的研究结果推测七叶皂苷在人体的代
谢途径见图 2。
R1　分别为巴豆酰基或当归酰基
R2　为乙酰基
图 2　七叶皂苷肠道菌代谢的可能途径
Fig. 2　 Possible way of aescin metabolism
in intestinal f lora
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碱提山茱萸多糖的理化性质及抗氧化活性研究
李　平 ,王艳辉 ,马润宇
(北京化工大学 可控化学反应科学与技术基础教育部重点实验室 ,北京　 100029)
摘　要: 目的　研究碱提山茱萸多糖的单糖组成及抗氧化活性。方法　经热水抽提后的山茱萸残渣用碱提取、盐酸
中和、浓缩、透析、乙醇沉淀、 DEAE-纤维素柱色谱分离 ,再通过 Sephadex G-200柱色谱进一步纯化 ,得到白色粉末
状多糖 PFCCⅠ 。结果　该多糖经过完全酸水解、薄层色谱、红外光谱分析 ,证明 PFCCⅠ 由木糖和葡萄糖以 18. 8
∶ 81. 2摩尔比组成 ,平均相对分子质量为 7. 57× 104。 以羟基自由基 (· OH)清除剂苯甲酸和甘露醇为对照 ,用
Fenton反应检测 PFCCⅠ 对· O H的清除作用 ,三者对· O H的清除率达 50%所需浓度为 18, 330, 80μg /mL。
PFCCⅠ 可以有效抑制猪油和芝麻油的氧化 ,对 O÷2 的清除率达 50%所需浓度为 35. 0μg /m L。结论　该多糖为首
次提取制得 ,具有良好的抗油脂氧化及清除自由基能力。
关键词: 山茱萸 ;多糖 ;理化性质 ;抗氧化
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 11 0973 04
Study on phys iochemical characteristic and antioxidation activity of polysaccharide
extracted with sodium hydroxide from fruit of Cornus off icinalis
LI Ping , WANG Yan-hui, MA Run-yu
( Key Labo ra tor y o f Science and Techno log y o f Contro llable Chemical Reactions, M inistry
o f Education, Beijing Univ er sity o f Chemica l Techno log y , Beijing 100029, China)
Abstract: Object　 To study the chemical composi tion and antioxidation activi ty of poly saccha ride
f rom the f rui t of Cornus of f icinal is Zieb. et Zucc. Methods　 The po lysaccharide PFCCⅠ was iso lated
f rom C . of f icinalis through NaOH ex traction, neutra l reaction, ethano l precipi tation and DEAE-cellulose
column chromato graphy. It was further purified by Sephadex G-200 co lumn chroma tog raphy. Results　
The molecular w eigh t of PFCC Ⅰ was 7. 57× 104 . Monosaccharide composi tion analy sis by T LC and
HPLC show ed that it was composed of x ylo se and g lucose in a molar ratio of 18. 8∶ 81. 2. PFCCⅠ had
st rong activi ties of oxidation resistance to axunge and gingi li. It also had an action to scavenging hydroxyl
f ree radical (· OH) generated by Fenton raction and supero xide anion f ree radical ( O÷2 ) g enerated by pyro-
ga llol autoxidation system. The scavenging activi ty to· OH and O÷2 was represented by the content scav-
enging 50% of all radicals o r anion ( Ec50 ) , w hich w ere 80μg /mL and 35. 0μg /mL respectiv ely. Conclu-
sion　 This po lysaccharide is iso lated f rom C. of f icinal is fo r the fi rst time, which could resist oxidation of
axunge and gingili and scavenge f ree radical ef fectiv ely.
Key words: Cornus of f icinalis Sieb. et Zucc. ; polysaccha ride; phy siochemical cha racteristic; antioxi-
da tion
　　山茱萸为山茱萸科植物山茱萸 Cornus of f ici- nal is Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果肉 ,性平、味酸 ,
·973·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
收稿日期: 2003-01-07作者简介:李　平 ( 1973- ) ,女 ,山东济南人 ,博士研究生 ,研究方向为生化分离与制药工程。
Tel: ( 010) 64433790　 E-mail: lpxa@ 163. com
* 通讯作者　 Tel: ( 010) 64433790　 Fax: ( 010) 64423610　 E-mail: r. ma@ mail. buct . ed u. cn