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植物药材总 DNA提取
李晓波 1, 2 ,冯　波 2 ,张朝晖 3 ,王峥涛 2 ,徐珞珊 2
( 1. 上海交通大学药学院 ,上海　 200030; 2. 中国药科大学中药学院 ,江苏 南京　 210038; 3. 第二军医大学南京军医学院 ,江
苏 南京　 210099)
摘　要:目的　为获得高质量的 DNA,研究木质部较发达的根、根茎类以及茎木类药材的 DN A提取方法。方法　
总 DN A的提取过程包括用 T ris缓冲液洗净、 CT AB抽提和纯化。 结果　对升麻、 木、木香、乌药、芍药和木通等
进行了 DN A提取 ,能较好的去除色素、多糖等干扰 PCR物质。结论　本法使用常用试剂 ,成本低 ,易于推广 ,为药
材 DN A分子鉴别的应用奠定了基础。
关键词: DNA提取 ;中药材 ;升麻
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 07 0652 03
Isolation of total DNA from Plant Chinese medicinal materials
LI Xiao-bo
1, 2
, FEN G Bo
2
, ZHANG Zhao-hui
3
, WANG Zheng-tao
2
, XU Luo-shan
2
( 1. Schoo l o f Pharmacy, Shanghai Jiao tong Univ e rsity , Shanghai 200030, China; 2. College o f Chinese Ma teria Medica ,
China Pharmaceutical Univ ersity, Nanjing 210038, China; 3. Nanjing Milita ry M edical Colleg e,
Second M ilitar y Medical Univ e rsity , Nanjing 210099, China)
Abstract: Object　 To explo re the method for high-quali ty DN A ex tract from plant Chinese medicinal
materials containing developed xylem. Methods　 The process of DN A includes w ash w ith Tris-buf fer, ex-
tract wi th CY AB-buffer and purification mainly. Results　 Using this method, the total DN A was iso lated
f rom Cimicifugae foel ida L. , Arlia chinensis L. , Paeoniae lactif lora Pall. , Aucklandia lappa Decne. , Lin-
dera aggregata ( Slms) Ko stern. , a nd Akebia quinata Decne. etc. This method is preferable in removing
pigments, po lysaccharides, substance disturbing PCR. Conclusion　 In this pro cess, common reagents are
used, low er co st is of advantag e to popularize. This study provids the applying foundations for the DN A i-
denti fica tion of plant Chinese medicinal materials.
Key words: DN A ex tract; plant Chinese medicinal materials; Cim icif ugae foel ida L.
　　 DNA分子鉴别的第一步就是要获得高质量的
可作为 PCR模板的 DNA。药材不同于新鲜的动植
物材料 ,药材的干燥、加工、贮藏等过程均造成了
DNA不同程度的降解 ;同时药材中的蛋白质、多糖
以及多酚类化合物等都是影响 PCR成败的因素。
因此 ,针对不同药材采用不同的 DNA提取方法才
·652· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
收稿日期: 2001-11-06
基金项目:中国博士后科学基金 ( 1998年 )
作者简介:李晓波 ( 1963-) ,女 ,回族 ,博士 , 1991～ 1998年赴日留学攻读学位 ,主要从事生药学 ,分子生物学研究。 Tel: ( 021) 62933467
E-mai l: xbli@ mai l. sj tu. edu. cn
是科学、合理的。
升麻 Cimici fuga foetida L. 为根茎类药材 ,但
不同于薄壁细胞较丰富的人参、黄精等药材 ,其木质
部较发达 ,另外在升麻中多酚类物质又极其丰富 ,按
常规的植物 DNA提取方法 [1 ]所获得的 DNA溶液
呈褐色 ,无法进行 PCR。 为获得高质量的药材
DNA,结合升麻药材的特点探讨了木质部发达的根
及根茎类药材的总 DNA提取方法。
1　材料和方法
1. 1　实验材料:供试升麻样品分别购自浙江、山东、
河南、江苏省 ,详细来源见表 1,保存于中国药科大
学中药标本馆。 木 Arlia chinensis L.、木香 Auck-
landia lappa Decne.、 乌 药 Lindera aggregata
( Slms) Kostern.、芍药 Paeoniae lacti f lora Pall.、木
通 Akebia quinata Decne. 为第二军医大学南京军
医学院标本馆馆藏标本。样品用 70% 己醇擦洗表
面 ,或轻轻刮去表面的污染物后 ,切成小碎块备用。
表 1　升麻实验材料的来源
编号 来源 (省份 ) 时 间
J1 南京市百信药房 (江苏 ) 2000-09
J2 南京市健康中西药店 (江苏 ) 2000-09
ZH 海宁市药材公司 (浙江 ) 2000-04
ZD 东阳市中药房 (浙江 ) 2000-04
SW 潍坊医药公司 (山东 ) 2000-04
HZ 郑州医药公司医药大厦 (河南 ) 2000-04
1. 2　试 剂: 100 mmol /L Tris-HCl , 7. 5 mol /L
N H4OAc, 20% PV P ( polyvinylpy rrolidone ) , 100
mmol /L NaOAc ( pH 6. 0) , 3 mol /L NaO Ac, 5
mol /L NaCl。
1. 3　药材总 DNA的提取: 全提取过程主要由洗
净、抽提和纯化 3部分组成。
洗净:称取药材 100 mg ,用液氮研磨成细粉后 ,
放入 2 mL离心管中 ,加入 1 mL 100 mmo l /L Tris-
HCl缓冲液混匀 ,室温静置 10 min, 12 000 r /min离
心 5 min,弃上清 ,重复 1～ 2次。
抽提: 在洗净处理过的样品中加入 1 /2倍体积
(约 500μL) 的 CTAB提取液 ( 2% CT AB, 50
mmol /L Tris-HCl) ( pH 8. 0) , 20 mmol /L EDT A
( pH 8. 0) , 1. 4 mol /L NaCl,充分混合 , 56℃ 温育
40～ 60 min。加入 20% PV P使终浓度达到 6% ,
再加入 1 /10 倍 体 积 的 7. 5 mol /L N H4OAC
并于 - 20℃ 放置 30 min后 , 12 000 r /min离心 5
min。 取上清 ,加入等体积的苯酚-氯仿 -异丙醇
( 25∶ 24∶ 1) 颠倒混匀 , 4 000 r /min离心 15 min
后 ,再用 12 000 r /min离心 10 min。在离心所得上
清中加等体积的异丙醇 , - 20℃ 培养 1～ 2 h,
12 000 r /min离心 10 min。
纯 化: 用 400 μL 100 mmol /L ( pH 6. 0 )
NaO Ac溶解沉淀 ,缓缓加入 1 /10体积的无水己醇 ,
12 000 r /min离心 10 min。上清再加入 2. 5倍体积
的无水己醇沉淀 DNA。沉淀用 450μL TE缓冲液
A ( pH 8. 0, 10 mmo l /L Tris-HCl, 0. 1 mmol /L
EDT A, 1 mmol /L NaCl )溶解后 ,再加入 1 /10体
积的 10% CTAB、 1 /10体积的 5 mo l NaCl、 1 /3体
积的 CHCL3混合抽提 ,轻轻颠倒混匀 5 min后
12 000 r /min离心 5 min。加入 1 /10体积 3 mol /L
NaO Ac 和 2. 5倍体积 100% EtO H沉淀 DNA,
20～ 30μL的 T E缓冲液 B ( pH 8. 0, 10 mmol /L
Tris-HCl, 0. 1 mmo l /L ED TA) 或 ddH2O溶解
备用。
1. 4　 DNA的检测: 取 DNA溶液 5～ 10μL点样于
1% 的加入 EB琼脂糖凝胶上电泳 ,紫外观察并
拍照。
2　结果和讨论
采用上述方法提取升麻药材样品的总 DNA,
结果见图 1。此外对药材性状上质地较硬、组织解剖
学上为木质部所占横断面的比例较大的根类药材、
茎木类药材应用上述提取方法进行了 DNA提取实
验 ,实验药材分别为 木、木香、乌药、芍药和木通 ,
提取结果见图 2。
1～ 6分别为样品 ZD、 ZH、 J1、 J2、 HZ和 SW; M1和 M 2分别为
λ-HindⅢ dig es t和 DL 2000
图 1　从 6个升麻样品中提取的总 DNA的电泳结果
　　植物中的多酚类化合物和多糖对于 DNA质量
的影响 ,是植物分子生物学研究中最常遇到、必须解
决的问题 ,许多学者对于不同的植物作过研究报
道 [2～ 4 ]。中药材的特性又使得这一问题更为突出 ,即
从药材中提取高质量的 DNA并非易事。 本提取方
·653·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
1～ 6分别为 木、木香、乌药、芍药和木通的总 DN A; M1
和 M2分别为λ-HindⅢ digest和 DL 2000
图 2　从生药中提取的总 DNA的电泳结果
法能较好的除去色素、多糖等干扰 PCR的物质 ,获
得 DNA可直接用于 PCR扩增 (升麻的 DNA分子
鉴定另行发表 )。
首先 ,本法采用 100 mmol /L Tris-HCl ( pH
8. 0) 进行前洗净操作。该操作可在 DNA溶出前去
掉水溶性和部分脂溶性色素以及部分多糖 ,比在
DNA溶出后进行分离去除效果更佳。
一般对于新鲜的植物材料采用加入 β-巯基己
醇防止多酚类物质的氧化 (褐变 ) ,但由于对于药材
中的多酚类物质已被氧化 ,因此参照 Couth[ 5]等的
方法 ,采用加入 6% PV P及 7. 5 mmol /L N H4OAc
分离已被氧化的多酚类 ,获得 DNA溶液的颜色明
显变浅。
获得的 DNA溶液常常粘度大乃至呈胶状 ,是
植物 DNA提取中最常见的现象 ,其原因是 DNA
沉淀过程中多糖也同时被沉淀下来。植物 DNA的
提取不同于动物细胞 ,如何更能有效的去除植物中
特有的多糖 ,是获得高质量植物 DNA的关键。
CTAB即可裂解细胞 ,又能有效的沉淀多糖 ,是最常
采用的植物 DNA提取方法。但对于多糖极为丰富的
材料 ,单靠 CT AB还不能获得高质量的 DNA。本研
究通过以下两步操作 ,可明显去除多糖 ; 1) DN A沉
淀用 100 mmo l /L NaO Ac溶解后 ,利用在低浓度己
醇中多糖可被沉淀而 DNA保留在溶液中的原理 ,分
离出多糖 ; 2)采用 1 /10倍体积 10% CTAB、 1 /10倍
体积的 5 mol NaCl、 1 /3倍体积的 CHCl3抽提。
Mizukami
[6 ]曾报道了从生药中提取 DNA的方
法 ,在对提取液进行一次氯仿抽提后 ,使用 DNA纯
化试剂盒获得总 DNA。 Fu[7 ]等报道采用两步离心
法可获得长片段的 DNA,从文章的电泳图可见
DNA片段达 20 kb以上 ,从生药中获得如此长片段
的 DNA,可能是值得进一步验证的。
此外 ,本方法所用的试剂均为常用、低价格 ,为
药材 DNA分子鉴定法的应用奠定了基础。
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八角属药用植物资源
林　祁
(中国科学院植物研究所 ,北京　 100093)
摘　要: 目的　报道世界性八角属药用植物资源状况。 方法　根据对 18个国家 121个标本馆收藏的 10 000余份
·654· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
收稿日期: 2002-01-21
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39370056) ;中国科学院知识创新工程资助项目 ( KSCX2-1-06B) ;中国科学院生物分类区系学
科发展特别支持项目部分内容
作者简介:林　祁 ( 1957-) ,男 ,湖南长沙人 ,博士 ,研究员 ,从事植物分类学研究。 Tel: ( 010) 62591431-6476　 Fax: ( 010) 62590296
E-mai l: linqi@ ns. ibcas. ac. cn