全 文 ：2. 3 干扰性考察: 分别吸取供试品液、阴性对照溶
液、对照品溶液各 20 L,注入液相色谱仪。结果在
葛根素峰对应的保留时间处无干扰杂质峰,见图 1。
* -葛根素
* -puer arin
图 1 葛根素对照品(A)、通脉口服液(B)
和缺葛根的阴性对照( C)的 HPLC图谱
Fig. 1 HPLC chromatograms of puerarin ref erence
sbustance (A) , Tongmai Oral Liquid (B) , and
negative sample without Radix Puerariae ( C)
2. 4 线性关系的考察:分别精密吸取葛根素对照品
溶液 1、2、3、5、8、10 mL,置 50 mL 量瓶中,加 30%
甲醇至刻度,摇匀,各进样 20 L,测定峰面积值。以
葛根素的质量浓度为横坐标, 峰面积值为纵坐标作
图得一直线,其回归方程为 Y= 94. 207 X+ 13. 642,
r= 0. 999 9。表明葛根素在 0. 159～1. 597 g 与峰面
积呈良好的线性关系。
2. 5 精密度试验:精密吸取供试品溶液 20 L, 注
入高效液相色谱仪, 重复 5次,测定峰面积,结果葛
根素峰面积的 RSD为 0. 74%。
2. 6 稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液, 分别
于 0、2、4、6、8、10 h 测定峰面积, 结果葛根素峰面积
的 RSD为 1. 10%。结果表明供试品溶液在 10 h 内
基本稳定。
2. 7 重现性试验: 取同一批样品(批号: 030705) 5
份, 制备供试品溶液, 测定, 结果葛根素峰面积的
RSD= 0. 65%。
2. 8 加样回收试验: 精密吸取样品(批号: 030705)
0. 5 mL, 共 6 份, 分别精密加入葛根素对照品溶液
适量,按供试品溶液的制备方法操作。精密吸取 20
L, 注入色谱仪, 依法测定, 结果平均回收率为
100. 26% , RSD为 0. 36% ( n= 6)。
2. 9 样品测定结果:精密吸取对照品溶液和样品供
试液各 20 L 进样, 记录峰面积,按外标法计算 10
批样品中葛根素含量, 结果分别为 6. 86、7. 05、
7. 43、6. 96、7. 28、7. 14、7. 09、6. 89、7. 24、7. 17 mg /
mL ( n= 2)。
3 讨论
供试品溶液的制备中使用正丁醇、甲醇、30%甲
醇、30%乙醇进行定容, 结果以 30%乙醇直接定容
效果最佳。对流动相甲醇-水( 25∶75)、甲醇-1. 8%
醋酸溶液( 20∶80)的考察表明, 甲醇-水( 25∶75)效
果好, 使葛根素和相邻成分的分离度为 1. 93, 葛根
素理论板数为 3 285。
四神丸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的 HPLC分析
甄 攀,白雪梅, 王治宝
(河北北方学院, 河北 张家口 075000)
四神丸由肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸、大枣
组成,具有温肾暖脾、涩肠止泻的功效。用于命门火
衰、脾肾虚寒、五更泄泻或便溏腹痛、腰酸肢冷等病
症。吴茱萸是其主要组成部分, 具有温胃止吐、温脾
止泻、镇痛、升高体温、轻度影响呼吸与血压的作
用[ 1]。吴茱萸的主要成分为挥发油和生物碱,生物碱
包括吴茱萸碱( ev odiamine)和吴茱萸次碱 ( rutae-
carpine)等。本实验在参考文献[ 2～4]的基础上,利用
甲醇提取吴茱萸碱和吴茱萸次碱, 用 HPLC 法检
测, 建立了四神丸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的分析
方法。该方法稳定性高、重现性好、操作简单, 是四神
丸质量监控较理想的方法。
·1249·中草药 Chinese T radit ional and Herbal Drugs 第 35 卷第 11 期 2004年 11 月
收稿日期: 2004-01-11作者简介:甄 攀( 1965—) ,女,副教授,硕士,主要从事中药及天然植物成分研究。
T el: ( 0313) 8041654 E-m ail : zh enpan8051226@ yahoo. com. cn
1 仪器与试药
Agilent 1100 Series 高效液 相色谱仪, HP
HPLC ( 3D) 化学工作站。吴茱萸碱 (批号: 802-
9401)和吴茱萸次碱(批号: 801-9001)对照品由中国
药品生物制品检定所提供。甲醇、乙腈为色谱纯试
剂,其他试剂均为分析纯试剂,水为二次蒸馏水。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件: 色谱柱: YWG-C18 ( 250 mm×4. 6
mm , 10 m) ;流动相:水-甲醇-乙腈梯度洗脱, 0～15
min, 水-甲醇-乙腈( 40∶30∶30) , 15～27 min, 乙
腈-水 ( 70∶30) , 27 min 以后, 水-甲醇-乙腈( 40∶
30∶30) ; 体积流量: 1. 0 mL/ min; 柱温: 30 ℃;检测
波长: 225 nm。
2. 2 工作曲线的制备:精密称取吴茱萸碱和吴茱萸
次碱对照品 1. 0 mg 和 0. 9 mg, 用甲醇溶解并稀释
至 1. 0 mL,按 1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶200
稀释得标准系列。定量阀进样, 进样量为 20 L。以
峰面积( Y )对质量浓度( X )作图,得工作曲线,拟各
回归方程。吴茱萸碱: Y= 147. 37 X+ 1 186. 32, r=
0. 999 9, 线性范围: 5. 0～1 000 g/ mL; 吴茱萸次
碱: Y= 101. 19 X + 279. 81, r= 0. 999 9,线性范围:
4. 5～900 g / mL。
2. 3 检测限试验:用吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品
溶液逐级稀释后进样。用峰高相当于 3倍噪音标准
差时对照品的质量浓度表示。吴茱萸碱的最低检测
质量浓度为 0. 10 g / mL,吴茱萸次碱的最低检测质
量浓度为 0. 18 g/ mL。
2. 4 精密度试验:取吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品
溶液重复进样 6次,每次进样 20 L, 记录峰面积,
计算得吴茱萸碱和吴茱萸次碱的峰面积 RSD分别
为 0. 85%和 0. 63%。
2. 5 稳定性试验: 取四神丸供试品溶液于 1、2、8、
16、24、48 h 进样分析, 每个时间点进样 3 次, 每次
进样 20 L, 记录峰面积。结果吴茱萸碱峰面积的
RSD 为 1. 26%, 吴茱萸次碱峰面积的 RSD 为
1. 39%。说明四神丸的甲醇提取液在 48 h 内稳定。
2. 6 重现性试验: 四神丸(批号: 20020801) 3 份,
每份约 2 g ,制备供试品溶液,每次进样 20 L。结果
吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积的 RSD 分别为
1. 02%和 0. 99%。
2. 7 回收率试验: 精密称取四神丸 ( 批号:
20020801) 3份,约 0. 75 g, 准确加入一定量的吴茱
萸碱和吴茱萸次碱对照品, 制备供试品溶液,测定,
计算回收率,结果吴茱萸的平均回收率为 99. 83%,
RSD = 1. 35%; 吴茱 萸次碱的平均回收率 为
98. 72%, RSD= 2. 97% ( n= 5)。
2. 8 样品分析:取各种四神丸适量, 粉碎, 精密称
定, 分别用甲醇浸泡 0. 5 h, 用索氏提取器提取 2. 0
h, 滤过,均定容至 50 mL。用 0. 45 m 微孔滤膜滤
过。定量阀进样,每次进样 20 L。残渣经检验,没有
吴茱萸碱和吴茱萸次碱色谱峰。色谱图见图 1,测定
结果见表 1。
1-吴茱萸碱 2-吴茱萸次碱
1-evodiamine 2-rutaecarpine
图 1 四神丸(A)、阴性样品(B)和
对照品(C)的 HPLC图谱
Fig. 1 HPLC chromatogram of Sishen Pill (A) , nega-
tive sample (B) , and ref erence substances (C)
表 1 四神丸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量
Table 1 Evodiamine and rutaecarpine in Sishen Pill
样 品 生产公司 生产批号 吴茱萸碱
/ ( mg·g- 1)
吴茱萸次碱
/ ( mg·g- 1)
四神丸 邢台市人民药 20020801 1. 716 0. 995
业有限公司 20020602 1. 603 0. 950
四神丸
唐山天恩药业
有限公司
1. 640
1. 018
肉蔻四神丸 北京中药二厂 1080085 0. 346 0. 385
1080116 0. 378 0. 410
3 讨论
吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品用甲醇溶解后,
在 200～400 nm 扫描, 吴茱萸碱和吴茱萸次碱在
225 nm 波长处都有较大吸收, 因此选定 225 nm 作
为检测波长。
比较了水、酸水、碱水、甲醇和乙醇对吴茱萸碱
和吴茱萸次碱的提取效率。发现水、酸水、碱水不能
提出吴茱萸碱和吴茱萸次碱; 甲醇较乙醇提取效率
高,因此用甲醇作为提取溶剂。
如果采用乙腈-甲醇-水( 40∶40∶30)等梯度洗
脱,样品中各组份已得到了良好的分离,但最后一个
组份洗脱出柱很晚(保留时间约为 40 min) ,且在其
前面较长一段时间没有色谱峰。因此, 为了节省时
间, 在进样 15 min 后设置了梯度洗脱,将最后一个
组份的保留时间提前到 22. 78 min, 既加快了分析
速度,又保证了良好的重现性。
·1250· 中草药 Chinese T radit ional and Herbal Drugs 第 35 卷第 11 期 2004年 11 月
致谢:得到了实验中心王德宝、贾天军、罗强等
的热情帮助!
References:
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Med ica ( 中药大辞典 ) [M ] . Shanghai: Sh angh ai People s
Publis hing House. 1977.
[ 2] Hou X H, Yu Z G, Du H L, et al. Determinat ion of th e ru tae-
carpine in th e rat plasm a by HPL C [ J] . J S heny ang P harm U-
niv (沈阳药科大学学报) , 2001, 18( 5) : 335.
[3] Li Q Y, Hong X K, Wang Z H, et al . Determination of evodi-
amine in Fruc tus Evod ia by h igh perform ance capil lary ele-
crophores is [ J] . Chin J P harm Anal (药物分析杂志 ) , 2000,
20( 6) : 370.
[4] Hou X H, Yu Z G, Xu Z M , et al . Determinat ion of th e con-
ten ts of evodiamine and ru taecar pine in 34 species of E vod ia
R utaecarp a by HPLC [ J ] . J S henyang P harm Univ (沈阳药
科大学学报) , 2000, 17( 5) : 334.
月见草油中 -亚麻酸柱色谱分离纯化的正交试验优选
薛 刚1, 2 ,刘凤霞1, 2 ,黄开勋1,高伟霞2,张立华3
( 1. 华中科技大学,湖北 武汉 430074; 2. 南阳理工学院 生物与化学工程系,河南 南阳 473004;
3. 南阳普康药业有限公司,河南 南阳 473004)
富集月见草油中 -亚麻酸的方法主要有有机
溶剂萃取法、银离子树脂色谱法、真空精馏法、冷冻
结晶法、尿素包合法和超临界 CO 2萃取法等[ 1]。国
内主要采用尿素包合法[ 2] ,或从月见草油中分离高
浓度 -亚麻酸甲酯[ 3]。低温结晶法得到-亚麻酸只
有 30%～50% ,真空分馏法得到的 -亚麻酸纯度为
80%。只有纯度大于 90%的 -亚麻酸才可以合成二
高 -亚麻酸。采用银离子树脂色谱法可以达到要
求,但在分离过程中有银离子,对制药不利。因此本
实验尝试采用硅胶柱色谱法对月见草油中的 -亚
麻酸进行富集,为二高 -亚麻酸的合成提供原料。
1 仪器和材料
GC—14B 气相色谱仪(日本岛津) , 硅胶(青岛
海洋化工厂) ,月见草油(江西) , -亚麻酸(尿素包合
产物,自制) , 尿素(山西天脊化工股份有限公司) ,其
他试剂均为分析纯。
2 方法和结果
2. 1 -亚麻酸的测定
2. 1. 1 色谱条件: 色谱柱: 300 m 长的毛细管柱,
PEG-20 m 极性柱, 温度: 230 ℃, 进样口温度: 250
℃,检测器 280 ℃,压力: N 2 140 kPa, H2 70 kPa,空
气 50 kPa。
2. 1. 2 测定:取 -亚麻酸0. 1 g 置 10 mL 具塞试管
中,加入 0. 5 mol/ L KOH 甲醇溶液 2 mL 于 63 ℃
水浴上皂化 20 min,加入 BF 3-乙醚溶液( 1∶1) 0. 2
mL, 63 ℃水浴上甲酯化 5 m in, 取出冷水冷却,加 2
mL 石油醚,振摇,吸取上层 2 L 进样,按面积归一
法计算。其中 -亚麻酸保留时间在 16. 6 m in左右。
2. 2 柱色谱分离法: 称取硅胶 100 g , 120 ℃活化
1. 5 h,加入等体积的氯仿,摇匀。取两支色谱柱( 40
cm×2 cm ) , 各先加 20 mL 氯仿, 然后加入硅胶, 轻
轻敲打装完后垫上一层滤纸, 加适量无水硫酸钠, 打
开旋塞, 用氯仿洗柱 1 h,将尿素包合后得到的 -亚
麻酸用等体积的氯仿溶解后加入, 收集 30 m in以后
的产物,回收氯仿和甲醇,得产物。
2. 3 正交试验设计及分析:由于实验的目的是通过
柱色谱纯化不同含量 -亚麻酸, 因此对 -亚麻酸质
量分数( A )考虑了 4个水平, 同时考虑了硅胶的粒
度( B)、流动相氯仿-甲醇的配比( C)和色谱分离次
数( D) , 见表 1, 选用 L 8 ( 4×24 )正交表(表 2) , 并进
行方差分析(表 3)。
表 1 因素水平表
Table 1 Factors and levels
水平 A B/目 C D
1 60 100～200 90∶10 1
2 65 200～300 100∶0 2
3 70
4 75
从表 2 可知, 最优组合为 A 4B1C1D 2 即 -亚麻
酸质量分数为 75% ,硅胶粒度为 100～200目,流动
相配比为 90∶10,色谱分离次数为两次。
通过方差分析,说明 A、B 因素达到了显著水
平, 应控制在最优水平, 即 A 4B1 , C 和 D 因素不显
著, 可以在任意水平, 为方便操作, C 应在 C2 水平,
即用氯仿作为流动相,为节省成本和省时, D因素应
·1251·中草药 Chinese T radit ional and Herbal Drugs 第 35 卷第 11 期 2004年 11 月
收稿日期: 2004-02-18作者简介:薛 刚( 1961—) ,副教授,硕士,从事生化工程的教学和生物制药的研究工作。