全 文 ：的细胞外环境中, 较高浓度 (本实验为 1×10- 3 mo lö
L ) 的 H 2O 2引起的 [Ca2+ ] i 荧光强度增加率会比无
Ca2+ 时加大, 可能涉及到L 2型Ca2+ 通道之外的膜通
透性增加机制造成胞外Ca2+ 大量内流。
西红花酸具有广泛的药理活性[8 ]。目前认为, 西
红花酸的各种药理作用可能与其较强的抗氧化作用
有关[8, 9 ]。我们在研究中观察到西红花酸可减轻
H 2O 2对培养心肌细胞造成的损伤, 推测相关的机制
是: 西红花酸具有亲脂性能与细胞膜紧密结合或亲
脂部分进入细胞内, 抵抗 H 2O 2对细胞的攻击; 能与
细胞氧化应激中产生的·OH、膜脂质过氧化自由基
(LOO ·) 或脂质自由基 (L ·) 结合形成较稳定的
复合物, 中断膜脂质过氧化反应的连锁和放大, 减轻
·OH 对膜性细胞器的损伤作用。本研究表明, 无论
细胞外环境是否存在 Ca2+ , 采用西红花酸均能显著
降低 H 2O 2诱发的培养心肌细胞 [Ca2+ ] i 上升的幅
度, 由此可以断定西红花酸能够有效地调整胞内钙
库释放和摄取Ca2+ 、减少 Ca2+ 内流, 与我们上述关
于西红花酸在细胞膜或细胞内发挥抗氧化作用的推
测是相符的。显然, 西红花酸能够抑制 H 2O 2诱发的
[Ca2+ ] i 增高是其抗氧化应激性损害机制之一。
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槲皮素对乳腺癌细胞M CF-7 增殖及凋亡的影响
罗　玲, 吴凯南, 吴晓健Ξ
(重庆医科大学附属第一医院 普外科, 重庆　400015)
　　槲皮素具有广泛的生理及药理活性[1 ] , 因其扩
张冠脉、调血脂、降低血管通透性被作为心血管药物
而在临床广泛应用。已有文献报道槲皮素在体外对
肿瘤的化学预防和治疗作用及其机制[2, 3 ]。此前, 已
对槲皮素抑制 DM BA (二甲基苯并蒽) 诱导的 SD
大鼠乳腺癌的发生及增殖进行了研究并探讨机
制[4, 5 ]。本实验采用 ER (雌激素受体) 阳性的乳腺
癌细胞株M CF27, 初步观察槲皮素在体外对该细胞
增殖、凋亡及细胞周期的影响, 为进一步探讨其作用
机制及其应用于临床治疗乳腺癌提供部分依据。
1　材料与方法
111　药物与细胞系: Q uercet in (槲皮素, Q 0125, FW : 33813) 购于美国 Sigm a 公司, 用DM SO (二甲基亚砜) 配成储液, - 20 ℃ 冰箱保存。试验时用1640 培养基稀释, DM SO 的终浓度小于 019%。M CF27 细胞购自武汉大学典型动物保藏中心。112　M T T 法检测槲皮素对乳腺癌细胞生长的影响: 实验分为 7 组: 细胞对照组、溶剂对照组 (019%DM SO )、槲皮素 1, 10, 25, 50, 100 Λmo löL 组。M T T法分别测定槲皮素作用 24, 48, 72 h 后的吸光度(A 600) 值, 并计算出槲皮素对乳腺癌细胞的抑制率,每组实验均重复 3 次。用回归方程求出槲皮素的半数抑药浓度 ( IC 50)。增殖抑制率= (1- A 药物öA 细胞对照)×100%
·17·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2003206214
基金项目: 重庆市卫生局科研基金面上项目 (9922021# )
作者简介: 罗　玲 (1969—) , 女, 硕士, 主治医师, 研究方向为槲皮素对肿瘤血管生成因子V EGFmRNA 及M T P53、Ras 蛋白表达的影
响。T el: (023) 66908378, 89012715　E2m ail: www. 11m b. sohu. com.
113　形态学观察: 倒置显微镜、光镜、电镜观察槲皮
素对乳腺癌M CF27 细胞的影响。
114　流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率: 25, 50Λmo löL 槲皮素作用 48 h, 70% 乙醇固定, 4 ℃ 过
夜。取 110×105ömL 细胞悬液, PBS 洗涤, 2 000×g
离心 5 m in, 去上清, P I 染液 110 mL 染 30 m in, 混
合液过 300 目尼龙网以除去杂质, 用 488 nm 激发
波长测定样品, 分析细胞周期和凋亡率。
115　免疫细胞化学检测槲皮素影响 PCNA (增殖
细胞核抗原) 蛋白质的表达: PCNA 定位于细胞核,
细胞核内有中等强度以上棕黄色或棕褐色颗粒, 或
核内弥散着色为阳性; 每张切片选择 3 个密集区域
的细胞观察, 计算 100 个细胞中的阳性细胞数, 取
其平均值。阳性着色细胞数< 10% 为“- ”, 10%～
50% 为“+ ”, > 50% 为“+ + ”。
116　统计分析: 实验采用 SA S 6112 软件包进行分
析。M T T 检测结果采用方差分析, 组间两两比较用
SN K 法 (q 检验) ; 免疫细胞染色结果分析采用秩和
检验进行统计处理。
2　结果
211　M T T 法检测槲皮素对乳腺癌细胞生长的影
响: 见表 1。
表 1　槲皮素对乳腺癌M CF-7 细胞生长的影响
Table 1　Effect of quercetin on breast cancer M CF-7 cells growth
组　别
剂　量ö(Λmo l·L - 1) 24 hA 抑制率ö% 48 hA 抑制率ö% 72 hA 抑制率ö%
细胞对照 　　　- 01623±0104 　0 01854±01034 　0 01873±0102 　0
DM SO 对照　　　- 01631±0108 0 01852±0108 0 01869±0104 0
槲皮素 　　　1 01621±01018 1191 01804±01021 6180 01782±01045 10142
10 01550±01021 13100 01704±01086 18198 01623±01076 28164
25 01510±01015 161223 01599±01013 321693 01366±01011 581123 △
50 01468±0103 201223 01532±01017 391683 01217±0106 751203 △
100 01427±0102 341223 01310±01014 451253 01166±0168 811003 △
　　　　与细胞对照组比较: 3 P < 0105; 　与 24 h 作用组比较: △P < 0105
　　　　3 P < 0105 vs cell con tro l group; 　△P < 0105 vs 24 h group
　　从表 1 可见, 槲皮素对M CF27 细胞生长抑制
作用存在时间及浓度依赖性。与槲皮素作用 24 h 相
比, 槲皮素作用 72 h 后乳腺癌细胞抑制率差异显著
(P < 0105) , 但与作用 48 h 后乳腺癌细胞抑制率比
差异不显著。说明随作用时间延长, 药物抑制作用增
强。不同时间细胞对照组与DM SO 对照组差异不显
著, 说明用作溶剂的DM SO 对M CF27 细胞生长无
影响; 与细胞对照组比, 槲皮素 1, 10 Λmo löL 对乳
腺癌细胞抑制率差异不显著; 而 25, 50, 100 Λmo löL
槲皮素对乳腺癌细胞抑制率差异显著 (P < 0105)。
用 SA S6112 软件包分析药物浓度的对数与存
活率之间的关系, 求出 IC 50 (槲皮素作用 72 h, 细胞
被抑制 50% 的半数抑药浓度) 为 15154 Λmo löL。
212　形态学观察: 25 Λmo löL 槲皮素作用 48 h 后,
倒置显微镜、光镜及电镜下均可观察到M CF27 细
胞出现凋亡的典型形态学改变: 细胞皱缩, 胞质浓
缩, 胞核凝聚, 位于核周膜成新月状, 块状。另可见核
碎裂成几个小块, 形成凋亡小体。而作用 3 d 后则可
见肿胀性坏死的表现。
213　流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡率: 见表
2。用流式细胞仪分析细胞DNA 含量分布, 对照组未
检测到凋亡; 槲皮素作用 48 h 后M CF27 细胞凋亡 率为 15153% (25 Λmo löL ) 和 17179% (50 Λmo löL )。此外, 还显示出细胞的周期分布, 与对照组比槲皮素致细胞 G0öG1期阻滞; S 期细胞也有所下降。表 2　槲皮素作用 48 h 后对M CF-7 细胞周期分布及凋亡率的影响Table 2　Effect of quercetin for 48 h on cellcycle d istr ibution and apoptosisrate of M CF-7 cancer cell组　别 剂　量ö(Λmo l·L ) 细胞周期ö%G0öG1 S G2öM 凋亡率ö%对照 - 46175 39144 13181 -槲皮素 25 49192 32130 18128 1515350 48139 37172 13188 17179214　免疫细胞化学检测槲皮素作用前后 PCNA 蛋白质的表达, 见表 3。表 3　槲皮素对 PCNA 蛋白质表达的影响 (n= 8)Table 3　Effect of quercetin on expressionof PCNA prote in (n= 8)组　别 剂　量ö(Λmo l·L - 1) PCNA 阳性表达ö例+ + + - 阳性表达率ö%对照 - 　 4 1 　 3 　 　6215槲皮素 25 13 1 63 25350 13 1 63 253　　与对照组比较: 3 P < 0105　　3 P < 0105 vs con tro l group
·27· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
3　讨论
　　槲皮素在体外实验中可抑制乳腺癌、卵巢癌、结
肠癌、肝癌、胃癌、白血病等多种恶性肿瘤的生长。机
制可能与下列因素有关: 阻滞细胞周期、抑制肿瘤细
胞信号传导、调节生长因子等导致细胞增殖抑制; 诱
导肿瘤细胞发生凋亡及分化等[6, 7 ]。
　　本研究M T T 实验显示: 槲皮素对 ER 阳性
M CF27 细胞的增殖有明显的抑制作用, 并呈时间及
浓度依赖性。实验测得槲皮素对M CF27 细胞的
IC 50为 15154 Λmo löL。PCNA 是反映细胞增殖的指
标, S 期合成最多, 免疫细胞化学检测结果表明用药
组 PCNA 指数明显低于对照组, 提示槲皮素可通过
降低 PCNA 蛋白质表达抑制癌细胞DNA 生长, 从
而抑制细胞增殖。槲皮素 25 和 50 Λmo löL 作用 48
h 后, G0öG1期细胞较对照组明显增高, 故认为槲皮
素可引起M CF27 乳腺癌细胞 G0öG1期阻滞。槲皮
素具有诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。倒置显微镜下
动态观察槲皮素诱导凋亡的作用, 25 Λmo löL 作用
48 h, 可见到典型的凋亡细胞, 随作用时间延长, 凋
亡细胞数量明显增多。100 Λmo löL 槲皮素作用 24 h
后可见大量的凋亡细胞及悬浮不透亮的死细胞, 随
作用时间延长, 悬浮死细胞明显增多。在光镜下, H E
染色显示同样的结果。提示随着槲皮素浓度增加或
作用时间延长, 可见凋亡细胞发生继发性坏死, 表明
凋亡在一定的条件下可转化为坏死。
通过流式细胞仪观察到: 槲皮素作用 48 h 后诱
导凋亡, 随药物浓度增加, 凋亡率也随之增加, 而对
照组均未检测到凋亡细胞。槲皮素可抑制乳腺癌细
胞增殖, 引起 G0öG1周期阻滞, S 期细胞数目下降,
并诱导其凋亡, 这为其应用于临床提供了依据。
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六味地黄颗粒剂与丸剂的药效学研究
高瑞峰1, 于永芳2, 李沈明3Ξ
(11 承德医学院附属医院, 河北 承德　067000; 21 承德医学院中药研究所,
河北 承德　067000; 31 承德中药厂, 河北 承德　067000)
　　六味地黄丸 (简称丸剂) 是传统的中成药, 由
熟地黄、山药、山茱萸、泽泻、茯苓、牡丹皮 6 味中药
材经粉碎后用蜂蜜配制而成。在临床上曾发挥了卓
越的效能, 但随着医药科技的进步, 发现其有作用
慢, 含糖不利于糖尿病患者服用, 水分高易于霉变、
不利于贮存等缺点。六味地黄颗粒剂 (简称颗粒剂)
取代了传统剂型, 既保留了原药成分含量高的优点,
又有用量小、口感好、起效快、疗效高等特点。本实验
就两种剂型在药效学上的差异进行了研究。
1　材料
　　地黄、山药 (购于河南省温县医药公司) , 山茱
萸、泽泻、茯苓、牡丹皮 (购于河北省承德市医药公
司) , 均由承德医学院中药研究所于永芳副主任药师
鉴定。山茱萸、牡丹皮用 95% 乙醇提取 2 次, 浓缩
到 300 mL 备用, 提取过的山茱萸、牡丹皮与其他 4
味中药用水煎煮 2 次, 浓缩到 150 mL 后, 加 2 倍量
95% 乙醇搅拌, 放置 24 h, 滤过。回收乙醇, 浓缩, 加
甜蜜素 110 g、糊精 300 g 混匀, 烘干, 粉碎成 80～
·37·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2003204225
作者简介: 高瑞峰 (1953—) , 男, 河北省承德市人, 副主任药师, 执业药师, 副主任, 学科带头人, 研究方向为临床药学及中药药理。