全 文 ：·制剂与质量·
半边旗中二萜类化合物的超临界 CO2萃取及HPLC-MS分析
邓亦峰,梁念慈X
(广东医学院 广东省天然药物研究与开发重点实验室, 广东 湛江　524023)
摘　要: 目的　建立一种高效准确的提取和分析半边旗中二萜类化合物的方法。方法　以超临界 CO2 与改性剂乙
醇组成的复合流体萃取半边旗中二萜类化合物, 采用正交设计法优化萃取条件; 建立了 HPLC-大气压化学电离源
( APCI) -MS 联用的分析方法, 以选择离子监测( SIM )方式进行含量测定, 以选择离子峰面积与总离子流峰面积的
比值优选改性剂。主要的二萜类化合物 5F 的准分子离子为[ M - H] - 1。采用[ M- H] - 1为选择监测离子,以色谱保
留时间和选择监测离子流峰面积定量。结果　超临界流体萃取最佳条件: 25 MPa、60 ℃、15%甲醇、流量 3. 0 mL /
min; 分析条件: Diamonsil ODS 色谱柱( 150 mm×4. 6 mm, 5 Lm) , 流动相为 CH3CN-2 mm ol/ L NH4AC ( 35∶65) ,
流速 1. 0 mL / min, 进样 5 LL, 线性范围为 0. 05～2. 5 Lg ,检出限达 0. 4 ng。5F 的加样回收率为 97. 8% ( n= 3)。结
论　本法提取效率高、检测灵敏度高、选择性好, 可应用于半边旗中二萜类抗癌化合物的深入研究和质量标准的制
定。
关键词: 半边旗;二萜类化合物; 超临界 CO2 萃取;液相色谱-质谱联用;改性剂
中图分类号: R284. 1; R286. 02　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 02 0145 04
Extraction of diterpenoids from Pteris semipinnata by supercritical CO2
fluid and their analysis with HPLC-MS
DENG Yi-feng, LIANG Nian-ci
( Guangdong Medical Co llege , Guangdong Key Labor ator y fo r Research and Development
o f Nat ur al Drug s, Zhanjiang 524023, China)
Abstract: Object　T o establish a high-ef ficient and reliable method for ext ract ion and analysis o f the
diterpenoids in P ter is semip innata L. Methods　Supercritical CO 2 f luid modif ied with alcohol w as used to
ext ract the diterpenoids in P . semip innata, the ext ract ing condit ions were opt imized by orthogonal design
method, and the modifying so lvent was invest igated through total ions chromatog raghy normalizat ion. A
quadrupo le mass spect rometer coupled with atmospheric pressure chemical ionization interface w as em-
plo yed as a detector for HPLC, the [ M - H]
- 1
ion w as used as select iv e ion fo r the detecting o f ent-11 A-hy-
droxy-15-oxo-kaur -16-en-19-olic acid ( 5F) in select iv e ion monitor ing ( SIM) mode. The peak area of SIM
and tolal ion chromato gram ( T IC) were used fo r quant itative determinat ion. As an example o f it s applica-
tion, this method w as used to determ inate the content of 5F as ant itumor diterpenoids in P . semip innata.
Results　 T he opt im ized conditions fo r supercrit ical CO 2 f luid ex t ract ion are 25 M Pa, 60 ℃, 15%
methanol, f low rate 3. 0 mL/ min; analyt ical column was Diamonsil ODS ( 150 mm×4. 6 mm, 5 Lm) ; the
mobile phase of HPLC was CH3CN-2 mmol / L NH4AC ( 35∶65) , f low rate 1. 0 mL/ m in, inject ion volume
5 LL; the standar d curve show ed good linearity over the range o f 0. 05—2. 5 Lg; the limit of detect ion is
0. 4 ng ; the r ecovery is 97. 8% ( n= 3) . Conclusion 　This method is highly ef ficient , sensit iv e, and selec-
tiv e, w hich can be applied to study the antitumor dr ug o f diterpenoids in P . semip innata and to establish
the drug standard.
Key words : P ter is semip innata L. ; diterpenoids; supercr it ical CO 2 ext ract ion; HPLC-M S; modifying
so lvent
　　半边旗 Pteris sem ip innata L. 为凤尾蕨科植物,
收载于《中药大辞典》, 民间认为有解毒、消肿及治疗蛇
伤的功效。国外文献报道其含二萜和倍半萜等化合
物[ 1]。梁念慈等发现半边旗中具有 A、B-亚甲基环戊酮
基团结构的贝壳杉烷型二萜类化合物具有强烈的抗癌
作用, 并对它们作了分离鉴定。半边旗中二萜类化合物
·145·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 2 期 2004年 2月
X 收稿日期: 2003-05-06基金项目:国家自然科学基金资助项目( 3987099)作者简介:邓亦峰( 1960—) ,男,高级工程师。T el : ( 0759) 2388405　E-mail: dengyf@ gdmc. edu . cn
主要以5F( ent-11 A-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-
olic acid) 和 4F ( ent-11A-hydroxy-15-oxo-kaur-16-
en-19-olicacid)形式存在, 5F 为有效成分[ 2]。
　　现有的半边旗中二萜类化合物的提取方法主要
是乙醇回流提取方法, 效率低、共存组份多、难以分
离, 且受热时间长、活性成分容易被破坏。超临界
CO 2流体萃取天然产物的方法具有公认的优点,采
用该法萃取半边旗中二萜类化合物的研究国内尚未
见报道。本实验以 5F 为目标成分, 建立了超临界
CO 2流体萃取半边旗中二萜类化合物的方法,并以
HPLC-APCI-M S 联用分析方法优化了萃取条件,
测定了萃取产物中 5F 的含量。
1　仪器与材料
惠普 7680T 超临界流体萃取仪, 安捷伦 1100
改性剂添加泵; 岛津 LCMS—8000 A型高效液相色
谱-质谱联用仪(含在线脱气机,两台 LC—10Avp高
压输液泵, SPD—10Avp 紫外检测仪,柱温箱, APCI
源接口,四极杆质谱检测计)。
　　CH3CN ( HPLC 级) ,三重蒸馏水,试剂级二氧
化碳(南海清越气体公司) ,其他试剂均为分析纯。
5F 对照品(本课题组分离纯化、含量 98%, 由日本
东京理科大学药学部和广东医学院医用生化研究所
鉴定) ;半边旗生药材采集于广州郊区,由湛江海洋
大学杨燕君副教授鉴定。
2　方法与结果
2. 1　5F 的 HPLC-MS 测定方法
2. 1. 1　色谱条件: 色谱柱为 Diamonsil C18 ( 150
mm×4. 6 mm, 5 Lm) ; 流动相 A 为 2 mmol / L
NH4AC 水溶液, 流动相 B 为 CH3CN, A -B ( 65∶
35) ;流速: 1 mL/ m in;进样量: 5 LL。
2. 1. 2　质谱条件: APCI 离子源,电极温度 400 ℃,
电晕( corona)电压—4. 0 kV,离子传输电压+ 55 V、
温度250℃,偏转电压40 V,检测器电压 1. 6 kV,喷
雾氮气流速 2. 5 L/ min,采用选择离子监测( SIM )
方式,扫描间隔 1 s。以色谱保留时间 4. 3 min、m/ z
331为 5F 的选择监测离子。采用选择监测离子流
( M IC)图峰面积进行定量。
2. 1. 3　超临界 CO 2萃取样品方法:称取干燥的半
边旗地上部分粉末( 40目) 0. 500 g, 装入萃取仪的
萃取柱( 7 mL)中, 在 25 MPa、60℃、超临界 CO 2与
甲醇体积比为 85∶15 条件下萃取: 静态萃取 2
min,动态萃取 5倍柱体积、流量为 2. 0 mL/ min;萃
取流体经装有 C18柱填料的收集阱减压,然后流入收
集容器;萃取完成后,以 1. 0 mL/ min的甲醇洗涤收
集阱,洗脱液并入收集容器,定容至 10. 0 mL,备测。
萃取过程约 18 min,洗脱过程约 9 min,整个流程按
所选择的参数程序自动完成。
2. 1. 4　标准曲线:在本实验条件下, 0. 050～0. 500
Lg , 5F 的监测离子色谱峰面积与浓度呈线性关系,
回归方程为 Y = 1. 176× 108C + 9. 78×105 , r =
0. 999 8。5F 的最低检出限为 0. 4 ng (二倍信噪比对
应的量)。
2. 1. 5　加样回收率试验:平行称取 6份干燥的半边
旗地上部分粉末( 40目) 5. 00 g, 其中 3份作对照, 另
外 3份分别加入含 4. 00 mg 5F 对照品的甲醇溶液
(加入量与样品含量相近) , 待样品挥干溶剂后, 按
2. 1. 3项下方法操作,进行测定,计算回收率。结果
平均加样回收率为 97. 8% , RSD为 2. 9% ( n= 3)。
2. 1. 6　测定结果:按 2. 1. 3项下方法平行制备 4份
样品溶液, 进样 5 LL,测定 5F 的峰面积, 以外标法
代入回归方程计算含量。样品中 5F 含量为 1. 18
mg/ g。选择监测离子色谱图见图 1。
* -5F
图 1　半边旗萃取物的选择监测离子色谱图
Fig. 1　SIM chromatogram of extracts
from P. semipinnata
2. 2　正交设计优化超临界流体萃取条件: 按 2. 1. 3
流程,选取萃取温度( A)、萃取压力( B)、改性剂甲醇
在超临界流体中的体积分数( C)作为因素, 进行正
交试验, 采用 HPLC-MS 法测定 5F 的提取量作为
指标。因素水平见表 1,正交试验结果分析见表 2。
表 1　正交试验因素水平表
Table 1　Factors and levels of orthogonal test
水平 因　　素
A /℃ B/ MPa C/ %
1 40 25 5
2 50 30 10
3 60 35 15
　　直观分析结果表明, 以 5F 的提取量为考察指
标, 改性剂甲醇在超临界流体中的体积分数是影响
萃取的主要因素,其次是萃取温度和萃取压力。正交
试验得到的最佳萃取条件为 25 MPa、60 ℃、超临界
·146· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 2 期 2004年 2月
CO 2与乙醇体积比为 85∶15。
表 2　L9( 34)正交试验结果分析表
Table 2　Analytical results of L9( 34 ) orthogonal test
实验序号 A B C 5F 提取量/ m g
1 1 1 1 0. 156
2 1 2 2 0. 214
3 1 3 3 0. 238
4 2 2 3 0. 262
5 2 3 1 0. 180
6 2 1 2 0. 246
7 3 3 2 0. 255
8 3 1 3 0. 327
9 3 2 1 0. 185
K 1 0. 608 0. 729 0. 521
K 2 0. 688 0. 661 0. 715
K 3 0. 767 0. 673 0. 827
k1 0. 203 0. 243 0. 174
k2 0. 229 0. 220 0. 238
k3 0. 256 0. 224 0. 276
R 0. 053 0. 022 0. 102
2. 3　改性剂的选择
2. 3. 1　归一化法选择改性剂:以正交试验优选出的
参数为萃取条件, 用甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、氯
仿为改性剂以及不加改性剂(对照)分别进行萃取试
验。采用 HPLC-MS 方法以扫描方式(m/ z 范围为
50～700)测定萃取产物的总离子色谱图( T IC)峰面
积和 5F 的选择监测离子色谱 ( M IC )峰面积 (m/ z
331) , 以选择监测离子峰面积及其在总离子流图峰
面积百分比(归一化法)对所选改性剂的萃取率和选
择性进行比较。
2. 3. 2　实验条件:超临界流体萃取按 2. 1. 3流程进
行; HPLC-M S 的色谱条件为: 梯度洗脱, 0%～
100%流动相 B ( 0～8 min)、100%流动相 B ( 8～25
min) ; 流动相 A 为 2 mmol / L NH4AC水溶液、流动
相 B为 CH3CN,余同 2. 1. 1。质谱条件为: 负离子扫
描方式, m/ z 范围 50～700,余同 2. 1. 2。结果见表
3, 以甲醇为改性剂的萃取产物总离子流见图 2。实
验表明:以甲醇为改性剂的萃取率和选择性最佳,不
加改性剂萃取效率最低。
表 3　归一化法的结果
Table 3　Results of normalization method
改性剂　 5F 峰面积/ (×107) 归一化/ %
甲醇　　 3. 93 4. 88
乙醇　　 1. 75 2. 99
丙酮　　 1. 32 2. 51
醋酸乙酯 1. 88 2. 28
氯仿　　 2. 04 2. 48
对照　　 0. 33 0. 66
2. 4　超临界 CO 2 萃取法与索氏提取的提取效率对
比:称取半边旗样品 5. 00 g, 平行 4份,以甲醇为溶
* -5F
图 2　以甲醇为改性剂的萃取产物总离子色
谱(TIC)图和选择监测离子色谱(MIC)图
Fig. 2　TIC and MIC of extract
with methanol as modif ier
剂,在 80℃水浴中索氏提取8 h。提取液以甲醇定容
至 100 mL,按 2. 1项下的 HPLC-M S测定方法测定
提取液中 5F 的含量, 结果提取率为 0. 120%。称取
半边旗样品 0. 500 g ,平行 4份,采用优选出的超临
界 CO 2流体萃取条件, 按 2. 1. 3项下流程对相同的
半边旗样品进行超临界萃取, 按 2. 1 项下的 HPLC-
M S 测定方法测定提取液中 5F 的含量,结果提取率
为 0. 117%。实验表明,超临界 CO 2萃取法 18 m in
的提取率已达索氏提取法的 97. 2% ,充分展示了超
临界 CO 2萃取法的高效率。
3　讨论
3. 1　影响萃取的主要因素: 超临界 CO 2 萃取方法
既是一种高效的样品提取方法,也是一种分离富集
的方法 [ 3]。实验表明,改性剂是影响萃取的关键因
素,采用超临界 CO2 与改性剂组成的流体萃取半边
旗中二萜类化合物性能较单纯的超临界 CO 2 萃取
剂的性能大为提高; 但在加入提高萃取效率的同时,
萃取的选择性也会发生改变, 增加共存组份, 对后续
的色谱分离和检测带来负面影响。改性剂的选取必
须同时考察其对萃取率和萃取选择性的影响。压力
和温度对萃取也有较大的影响。压力增加可增加
CO 2的极性,也增加 CO 2密度、降低其传质性能。实
验中萃取产物中的 5F 含量随压力增高而有所下
降,说明传质性能在本实验中的影响更大。
3. 2　HPLC-M S 分析方法的优点:采用 HPLC-M S
联用方法分析天然产物组份, 既能发挥高效液相色
谱和质谱的协同分离功能, 又具有质谱检测器的广
泛响应性和高灵敏度, 能快速准确地检测目标成
分[ 4] ,与 UV 检测器相比, 不需精细的色谱分离, 在
保证选择性的同时, 可缩短分析时间,灵敏度大为提
高。
　　采用 HPLC-MS 方法以扫描方式获得的萃取产
·147·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 2 期 2004年 2月
物总离子流( T IC)峰面积包含萃取产物总量及其极
性分布信息, 在测量条件相同及产物共存组份数量
和比例变化不大的情况下,选择离子峰面积在总离
子流峰面积的百分比(归一化法)能在一定程度上反
映目标产物在总萃取产物中的含量相对关系。本实
验利用这一特性对所选改性剂的萃取和选择性进行
了对比和选择,简捷而直观。
References:
[1]　M aurakami T , T anak a N. Occurrence, s t ructure an d taxo-
nomic impl icat ions of fern con st ituen ts [ J ] . Pr og Chem Org
N at P rod , 1988, 54: 301-310.
[2]　Liang N C, Cui L. Ext ract s f rom Pteris semip innata L. and
their combin ed drugs [ P] . CN: 1138998, 2002-04-03.
[3]　Zhang J C. E xt raction by S up er crit ical Fluid (超临界流体萃
取) [ M ] . Beijing : Ch emical Indus t ry Press , 2000.
[4]　Zhou S L, Hamburger M . Applicat ion of l iquid chroma- to-
graph-atmospheirc pressu re ion izat ion mas s spect rometry in
natural product analysi s: Evaluation and opt imizat ion of elec-
t rospray an d heated nebu lizer inter faces [ J ] . J Ch romatog r A ,
1996, 755: 189-204.
制备高效液相色谱分离纯化茶氨酸对照品
肖伟涛,朱小兰,陈　波* ,姚守拙X
(湖南师范大学化学研究所, 湖南 长沙　410081)
摘　要: 目的　研究制备型高效液相色谱分离纯化茶氨酸对照品的方法。方法　原料水提后的水相用被水饱和的
氯仿萃取, 水相蒸发浓缩后离心,上清液进行 HPLC 分离制备,收集液冷冻干燥, 粗产品用甲醇清洗即得。结果　该
法所得产品用外标法定量, 纯度大于 98% ,制备收率大于 60%。结论　本法生产周期短,产品质量高, 方法简便,生
产费用低, 茶氨酸产品可用作分析方法的对照品。
关键词: 茶氨酸;对照品; 制备高效液相色谱
中图分类号: R284. 2; R286. 02　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 02 0148 03
Preparation and purification of theanine reference substance by preparative HPLC
XIAO Wei-tao, ZHU Xiao-lan, CHEN Bo , YAO Shou-zhuo
( Instit ute o f Chemistr y, Hunan No rmal Univer sity , Chang sha 410081, China)
Abstract: Object　T o establish an isolat ion method o f theanine reference substance by prepar at ive
HPLC. Methods　After raw material ex t racted by water, the water phase w as ex t racted by chloro form
saturated w ith water, then concentr ated on a thermostat . Af ter centr ifuged, supernatant w as isolated and
purif ied by prepar at ive HPLC. Fract ion w as f rozen and dr ied by Flex i-Drier. Crude product w as rinsed by
methanol. T he purity of product w as determined by analyt ical HPLC. Results　The purity of product is
higher than 98% and theanine yield from raw material by this method exceeds 60%. Conclusion 　T he de-
veloped method is simple, rapid, and at low pr oduct ion cost . The pr oduct ow ns the quality o f refer ence
substance.
Key words : theanine; reference substance; preparat iv e HPLC
　　茶氨酸( N -乙基-C-L -谷氨酰胺)是影响茶叶品
质的重要组成部分 [ 1]。茶氨酸是茶叶氨基酸中一种
非蛋白氨基酸, 约占茶叶中游离氨基酸的 40%以
上,占茶叶干重的 1%～2% [ 2] , 并使茶汤鲜爽、有焦
糖味[ 3]。药理学研究表明茶氨酸能拮抗咖啡碱引起
的神经系统的兴奋作用和降血压 [ 4, 5]。随着茶氨酸的
保健功效逐渐为人们所认识, 对茶氨酸的需求量不
断上升。目前关于茶氨酸对照品的合成、分离方法的
研究报道甚少。茶氨酸可采用化学合成、微生物发酵
法合成[ 6, 7]。现仅日本有少量的茶氨酸对照品,且价
格较贵,限制了对其进一步的研究与应用。本实验采
用制备高效液相色谱技术,对 25%茶叶提取物中茶
氨酸进行制备、分离纯化。
1　制备与分离
1. 1　仪器与试剂: Waters Prep LC4000高效液相
制备色谱仪, Waters 2487 Dual KAbsorbance 紫外
检测器, 10 mL 定量环, Waters M illennium 32色谱工
作站, JCX—250W 超声波清洗器(山东济宁电子仪
·148· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 2 期 2004年 2月
X 收稿日期: 2003-05-16基金项目:国家“十五”攻关资助项目( 2001BA746C, 2001BA804A21)
* 通讯作者　E-mail: dr-ch enpo@ vip. s ina. com　Fax: ( 0731) 8865515