全 文 ：及监测田间 CMV的发病情况打下基础。
CMV为雀麦花叶病毒科 ( Bromoviridae)黄瓜
花叶病毒属 (Cucumovirus )的典型成员 ,为单链正义
RNA病毒 [6 ] ,其基因组由 3个正链的 RNA分子组
成 ,按相对分子质量由大到小的顺序分别命名为
RNA1, RN A2, RN A3。它具有很广的寄主范围 ,可
以侵染 1 000多种双子叶和单子叶植物 [7 ] , CMV的
分布是世界性的 ,能通过蚜虫以非持久性的方式 ,机
械接种或带毒种子进行传播 ,是农作物以及重要经
济作物上危害最大的病毒之一。 在实践中 CMV的
检测主要是应用酶联检测 ,已经能检测到亚组 ,接种
鉴定 ,电镜检测 ,核酸杂交 , RT-PCR检测都有报
道 [8, 9 ]。依照血清学数据、衣壳蛋白的多肽图谱、核酸
杂交以及核苷酸序列的相似性将 CMV分成了亚组
Ⅰ 和亚组Ⅱ ,我们依照 MARILYN [10 ]提供的方法进
一步分析后 ,将其命名为黄瓜花叶病毒丹参分离物 ,
并归入 IB亚组。因只对此分离物的外壳蛋白基因进
行了部分克隆 ,所以若要进行更进一步的确认 ,还需
重新设计引物 ,进行全序列的克隆分析。
致谢: 中国农业大学生物学院农业生物技术重
点实验室牛胜乌博士、植物保护学院蔡祝南教授在
电镜观察时给予指导。
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RP-HPLC法测定寻骨风中马兜铃酸 A的含量
刘　超 ,陈　蕴 ,赵小磊 ,龚立雄 ,王　林
(河南省中药研究所 ,河南 郑州　 450004)
　　寻骨风为马兜铃科植物绵毛马兜铃 Aris-
tolochia moll issima Hance的全草。寻骨风药材收载
于河南省药材标准 [1 ] ,马兜铃酸 A为其有效活性成
分 [2 ] ,具有抗癌、抗感染、抗早孕及增强吞噬细胞的
活性等药理作用 ,其对肝、肾的毒性剂量为有效剂量
的 1 000倍 [3～ 5 ]。近年来马兜铃酸引起的肾损害“马
兜铃酸肾病” ( AAN )已日益受到临床重视并对用药
情况进行了调查 [ 6 ]。目前马兜铃酸 A的测定方法多
为 HPLC法 ,涉及的药材有青木香、马兜铃及关木
通 [7～ 11 ]等 ,但有关寻骨风中马兜铃酸 A的定量分析
未见报道 ,所以 ,本实验对药材的马兜铃酸 A含量
进行测定研究。
1　仪器、试药及样品
Waters液相色谱仪 , 481紫外检测器 , 510泵
(美国 ) , Echrom 98色谱工作站 (大连依利特 )。色谱
纯甲醇 (上海陆忠 ) ;水为乐百氏纯净水 (广东乐百
氏 ,规格 550 mL,批号: 20020406) ;马兜铃酸 A对
照品 (中国药品生物制品检定所 ,批号: 746- 9002) ;
其他试剂均为分析纯。寻骨风药材购自郑州市及禹
州药市。 由本所药材研究室安维教授鉴定。
2　方法与结果
2. 1　色谱条件: ODS C18色谱柱 ( 4. 6 mm× 200
mm , 5μm) (大连化学物理研究所 ) ;流动相为甲醇-
水-醋酸 ( 65∶ 35∶ 1) ;流速 1. 0 mL /min;柱温 25
·1139·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 12期 2003年 12月
收稿日期: 2003-03-18作者简介:刘　超 ( 1962- ) ,河南郑州人 ,工程师 , 1988年毕业于河南中医学院 ,研究方向为中药新药研制及质量标准研究。
Tel: ( 0371) 6323448　 Fax: ( 0371) 6323880　 E-mail: l c621023@ sina. com
℃ ;检测波长为 315 nm;理论板数按马兜铃酸 A峰
计算应不低于 4 000。该条件下对照品及样品的色谱
峰基本达到基线分离 ,色谱图见图 1。
时间 t /min
1-对照品　 2-样品
1-s tandard su bstance　 2-sample
图 1　HPLC图谱
Fig. 1　HPLC chromatograms
2. 2　供试溶液的制备
2. 2. 1　对照品溶液的制备:精密称取马兜铃酸 A
对照品 2. 5 mg,置 25 mL棕色量瓶中 ,加甲醇至刻
度 ,摇匀 ,即得马兜铃酸 A 0. 1 mg /mL。
2. 2. 2　供试品溶液的制备:取本品细粉约 1 g ,精密
称定 ,置具塞三角瓶中 ,精密加甲醇 25 mL,称定质
量 ,超声处理 30 min,放冷 ,再称定质量 ,加甲醇补
足减失的质量 ,摇匀 ,放置 ,取上清液 ,过 0. 45μ滤
膜 ,即得。
2. 3　线性关系考察:取浓度为 0. 1 mg /mL的马兜
铃酸 A对照品溶液分别进样 2. 5, 5, 7. 5, 10, 12. 5
μL,在前述色谱条件下进行分析 ,记录色谱峰面积 ,
回归方程为: Y= 1 540. 28 X - 8. 463, r= 0. 999 8,
在 0. 25～ 1. 25μg与峰面积线性关系良好。
2. 4　精密度试验: 取马兜铃酸 A对照品溶液 ( 0. 1
mg /mL)和样品溶液分别在仪器上重复进样 6次 ,
进样量分别为 10和 5μL,测定峰面积。 结果: 样品
溶液的 RSD = 2. 57% , 对照品溶液的 RSD=
1. 08% 。
2. 5　稳定性试验: 取马兜铃酸 A对照品溶液 ( 0. 1
mg /mL)和样品溶液按 0, 2, 4, 8, 16, 24, 48 h进样 ,
测定峰面积。结果:样品的 RSD= 1. 30% ,对照品的
RSD= 0. 94% 。
2. 6　重现性试验:称取同一样品 6份 ,依次分别制
得样品溶液 ,进样 5μL,测定峰面积 , RSD=
2. 10% 。
2. 7　回收率试验: 精密称取已知含量 ( 2. 60 mg /g )
的寻骨风药材样品 0. 100 g 5份 ,置 10 mL量瓶中 ,
加马兜铃酸 A对照品 0. 25 mg ,加甲醇近刻度 ,超声
30 min,放冷 ,加甲醇至刻度 ,摇匀 ,取上清液 ,过
0. 45μ滤膜 ,进样 10μL依法测定。结果加样平均回
收率为 104. 08% 。 RSD= 2. 13% 。
2. 8　药材样品含量测定: 精密称取各药材 1. 000 g,
按 2. 2. 2方法处理。 进样 5μL,结果见表 2。
表 1　样品含量 (n= 2)
Table 1　 Contents of sample ( n= 2)
样品来源 测定结果 /% 样品来源 测定结果 /%
神丹药房 0. 106 郑药股份 0. 146
东明药房 0. 102 复春药房 0. 088
禹县药市 0. 265 生力药房 0. 070
东升药房 0. 113 欣康药房 0. 101
千禧药房 0. 198 同心药房 0. 113
　　结果表明 , 10批药材的马兜铃酸 A含量在
0. 07%～ 0. 26% 。
3　讨论
3. 1　测定波长的选定: 将马兜铃酸 A对照品的甲
醇溶液在 200 ～ 400 nm的波长范围内进行紫外扫
描 ,马兜铃酸 A在 315 nm处有最大吸收 ,因此 ,本
品的测定波长选定为 315 nm。
3. 2　流动相的选定: 文献报道的流动相有甲醇 -水-
醋酸 ( 70∶ 29∶ 1) [7 ]、甲醇-水 -冰醋酸 ( 72∶ 28∶
1 ) [ 8]、甲醇-水 -醋酸 ( 60∶ 35∶ 1) [ 9] ,结果在上述流
动相的基础上经过筛选 ,确定本方法的流动相为甲
醇-水 -醋酸 ( 65∶ 35∶ 1) ,分离度达到 1. 5以上。
3. 3　文献报道有多种提取方法 ,经比较 ,超声提取
30 min稍优于回流提取 5 h,且简便、省时。
3. 4　鉴于近年马兜铃酸引起的肾损害 ,有必要对以
马兜铃属植物入药的药材进行马兜铃酸限量检查。
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高效液相色谱法测定叶下珠中槲皮素的含量
田　密 1 ,钟长平 1 ,江铁军 2
( 1. 广州奇星药业有限公司 ,广东 广州　 510310;　 2. 广州陈李济药厂 ,广东 广州　 510290)
　　叶下珠为大戟科叶下珠属植物叶下珠 Phyllan-
thus urinaria L. 的干燥全草 ,具有清热、解毒、明目
等功效 ,主要用于治疗腹泻下痢、尿路感染、肝炎等
病症 [1, 2 ]。药理研究表明具有很强的抑制乙肝表面抗
原 ( HBsAg )的活性 ,保护大鼠肝细胞 CCl4损伤 [3 ]等
作用。叶下珠含黄酮类、木脂素类、生物碱类、鞣质等
多种成分 [ 4～ 8] ,其中黄酮类化合物具有较明显抗病
毒活性 [9 ]。槲皮素是叶下珠中黄酮类化合物的主要
成分之一 ,具有抗自由基、抗氧化、抗癌防癌、抗菌、
抗病毒等多种生物活性及药理作用 [ 10]。目前尚未见
叶下珠中化学成分含量测定的报道 ,本实验建立了
测定叶下珠中槲皮素含量的方法 ,以控制叶下珠药
材的质量。
1　实验材料
Ag lent 1100型高效液相色谱仪 (美国安捷伦 )、
AG- 204电子天平 (瑞士 Mett ler Toledo ) ;甲醇为
色谱纯 ;水为去离子双蒸水 ;其他试剂为分析纯。槲
皮素对照品 (中国药品生物制品检定所 ) ;叶下珠经
广州中医药大学丁平副教授鉴定为大戟科叶下珠属
植物叶下珠 P . urinaria L. 的全草。
2　方法与结果
2. 1　色谱条件: 色谱柱: Hypersi l ODS柱 ( 4. 0
mm× 250 mm, 5. 0μm);流动相:甲醇-0. 4%磷酸溶
液 ( 1∶ 1) ,流速: 1. 0 mL /min;柱温: 40℃ ;检测波
长: 360 nm;进样量: 20μL。 HPLC图谱见图 1。
2. 2　对照品溶液的制备: 精密称定槲皮素对照品
2. 0 mg ,置 10 mL量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻
度 ,制成含槲皮素 0. 2 mg /mL的对照品溶液。
2. 3　供试品溶液的制备:取叶下珠粉末 2. 5 g ,精密
称定 ,置索氏提取器中 ,加甲醇适量和 0. 4%硫酸溶
时间 t /min
a-槲皮素　 a-quercetin
图 1　槲皮素对照品 ( A)和叶下珠供试品 (B)的 HPLC图谱
Fig. 1　HPLC chromatograms of quercetin ( A)
and sample of P . urinaria (B)
液 20 mL,水浴加热提取至无色 ( 6 h) ,提取液挥至
约 30 mL,放冷 ,转移至 50 m L容量瓶中 ,加甲醇至
刻度 ,摇匀 ,用 0. 4μm微孔滤膜滤过 ,取续滤液作
供试品溶液。
2. 4　标准曲线: 精密吸取对照品溶液 1, 2, 4, 6, 8
μL,进样 ,测定槲皮素的吸收峰峰面积 ,以进样量为
横坐标 ,吸收峰峰面积为纵坐标作图 ,得回归方程
为: Y = 5. 1+ 3 723. 3X , r = 0. 999 9,线性范围为
0. 2～ 1. 6μg。
2. 5　精密度试验:同一供试品溶液 ,取相同体积 ,重
复进样 6次 ,按上述条件进行测定 ,其相对保留时间
稳定 ,峰面积 RSD= 0. 28%。
2. 6　重现性试验:同一批样品 ,按供试品溶液制备
方法平行制备 5份 ,按上述条件进行测定 ,其相对保
留时间稳定 ,峰面积 RSD= 1. 79% 。
2. 7　稳定性试验:在室温条件下 ,将本品按测定方
法处理后 ,每隔 1 h测定一次 ,得峰面积的 RSD=
1. 26% (n= 5)。结果表明在 4 h内溶液的含量基本
保持不变。
2. 8　回收率试验: 取已知含量的叶下珠粉末 1 g ,精
密称定 ,加入一定量的槲皮素对照品 ,按供试品溶液
·1141·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 12期 2003年 12月
收稿日期: 2003-04-12作者简介:田　密 ( 1976- ) ,女 ,四川省江安县人 ,助理工程师 ,学士 (双专业 )学位 , 1999年毕业于广州中医药大学中药学院 ,现在广州奇星药业有限公司 ,主要从事中药药学工作。 　 Tel: 84206877