全 文 ：·药理实验与临床观察·
大蒜新素预防和治疗鼠巨细胞病毒性肝炎的实验研究
刘志峰, 方　峰,董永绥,李　革

(华中科技大学同济医学院附属同济医院 儿科临床病毒研究室, 湖北 武汉　430030)
摘　要 :目的　探讨大蒜新素在体内对鼠巨细胞病毒 ( murine cy tomegalo virus, M CMV) 感染小鼠的预防及治疗
作用。方法　建立 BALB/ c 小鼠 MCMV 重组病毒 (插入 LacZ 基因) 性肝炎模型, 采用 X-gal 染色测定
-gal 在
肝、肾及肺组织中的表达。70 只雌性 BALB/ c 小鼠随机分为大蒜新素预防+ 治疗组 ( n= 20) , 大蒜新素治疗组
( n= 20) , 更昔洛韦治疗组 〔60 mg / ( kg·d) , n= 10〕,安慰剂组 ( n= 10) 及空白对照组 ( n= 10)。其中前两组又各
均分为低、高剂量组 〔25, 75 mg / ( kg·d)〕,检测血浆丙氨酸转氨酶 ( ALT ) 水平和评估肝组织组织学活动性指数
( HAI) ,并用原位杂交法检测肝组织中 M CM V DNA 水平。结果　大蒜新素预防+ 治疗组及治疗组与安慰剂组相
比较, ALT、肝脏 HAI 评分及 MCMV DNA 杂交的积分光密度均明显降低 (P < 0. 05) , 与更昔洛韦治疗组相比无
显著差异; 大蒜新素预防用药及加大用药剂量并不能显著降低 ALT、肝脏 HAI 评分及 M CM V DNA 积分光密度
水平。结论　大蒜新素能减轻 MCMV 性肝炎模型鼠肝功能损害, 改善肝脏病理变化和降低肝组织内病毒 DNA 负
荷量, 其治疗效果与更昔洛韦无显著差异,大蒜新素预防用药及加大用药剂量不能增加其病毒抑制效应。
关键词: 大蒜新素;鼠巨细胞病毒; 原位杂交
中图分类号: R286. 87　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 06 0529 04
Experimental study on phylactic and therapeutic ability
of allitridin to murine cytomegalovirus hepatitis
LIU Zhi-feng, FANG Feng , DONG Yong-sui, LI Ge
( L abor ato ry of Pediatric Clinical V ir olog y o f A ffiliated Tong ji Hospital, T ongji Medical Co lleg e,
Huazhong Univ ersit y of Science and T echno lo gy , Wuhan 430030, China )
Abstract: Object　To invest igate the phylact ic and therapeut ic abil ity of allitr idin to murine cy-
tomegalov ir us ( MCMV) in vivo. Methods　A MCMV hepat it is model using BABL/ c mice w as established
w ith r ecombinat ion of M CMV RM461 st rain ( LacZ gene carried) . X-gal staining w as used to detect the
express of
-gal in liver, kidney and lung . Seventy female m ice were allocated r andomly into allit ridin phy-
laxy+ therapy group ( n= 20) , allitr idin therapy g roup ( n= 20) , Ganciclov ir therapy group 〔60 mg / ( kg·
d)〕( n= 10) , placebo t reated g roup ( n= 10) and control group ( n= 10) . T he f irst tw o g roups w er e devid-
ed into tw o subg roups: low and high do sage 〔25, 75 mg / ( kg·d)〕subgroups. Drug w as initially used 48
h before virus infection in phylax y+ therapy gr oup, and 48 h af ter virus infect ion in therapy g roup. Af ter
t reated fo r 14 d or 18 d, all mice w ere sacrif iced, alanine am inot ransfer ase ( ALT ) and histolog ical act ivity
index ( HAI) of liver t issue slides w ere recor ded, MCMV DNA load w as also detected by in situ hibirdiza-
tion on liver t issue sl ides. Results　ALT , HAI and integr al photo density o f M CMV DNA o f all all it ridin-
treated g roups w er e signif icantly reduced when comparied w ith placebo group ( P< 0. 05) and no significant
deviat ion comparied w ith Ganciclo vir therapy gr oup; ALT , HAI and MCMV DNA accumulated opt ical
density had not been significant ly reduced by phylax ic using and higher dosage of allitr icin. Conclusion　
Allit ricin can alleviate liver lesion, lighten liver histolo gical patholog y change and reduce MCMV DNA
load of liv er t issue in MCMV hepatit is model , it s ef fect is similar to that of Ganciclovir . T he phylaxic us-
age and higher dosage seem contribute lit t le to allit ridins ant icytomegalovirus act ivity in vivo.
Key words : allit ridin; murine cytomegalo virus ( MCMV) ; in situ hibirdizat ion
　 　人巨细 胞病毒 ( human cytomegalovirus, HCMV) 属于疱疹病毒科,为线状双链 DNA 病毒,
·529·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 6 期 2003年 6月

收稿日期: 2002-10-22基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30070928)作者简介:刘志峰( 1970—) ,男,湖北人,华中科技大学同济医学院博士,主要从事小儿感染研究工作。
T el: ( 027) 83663579　E-m ail : liu8917@ 163. com
具有潜伏-活化的生物学特性。CMV 感染在我国相
当普遍,多在婴幼儿期发生,是婴儿期肝脏损害的主
要病因之一, 患儿出现肝大或质地异常, ALT 升高,
可伴有黄疸[ 1]。大蒜为传统的食品,其药用价值早为
人知, 近年来发现大蒜及其制品有抗 CMV 活
性[ 2～ 4]。大蒜新素为大蒜鳞茎提取物,是大蒜主要有
效成分之一, 其分子式为 C6H10S3。本实验旨在进一
步探讨大蒜新素在体内预防和治疗巨细胞病毒感染
的效应。
1　材料与方法
1. 1　病毒: M CMV RM461毒株由美国德克萨斯大
学健康卫生科学中心的 Sally 博士惠赠,在本室自
制的 MEF 传代细胞中传代适应。
1. 2　试剂及药物: 5-溴-4-氯-3-吲哚-D -半乳糖苷
( X-gal) ( Sigma 公司) , 大蒜新素 (大蒜素注射液,
上海禾丰制药公司,批号 010501) ,更昔洛韦 (丽珠
集团湖北科益制药有限公司,批号 000602) ,地高辛
标记及检测试验盒购自美国 Roche 公司,甲基强的
松龙 (比利时法玛西亚普强公司,批号 HH0196)。
1. 3　质 粒: 含 MCMV IE 片 段的 重组 质粒
pSG5mIE1 由美国水牛城 Rosw ell Park 癌症中心
李红博士惠赠。
1. 4　动物: 4～6周龄,雌性 BALB/ c 小鼠 20只,体
重 9～11 g ,购于湖北省医学科学院纯种动物室。饲
养在同济医院动物室洁净层柜内。
1. 5　主要设备: CO 2培养箱 (美国产 Model 2300
型) , 血生化自动化分析仪 (美国产 AU100 型) ,显
微镜图像分析仪 ( HPIAS-1000 医学彩色图像分析
系统)。
2　方法
2. 1　MCMV 性肝炎鼠模型的建立: 给 20 只
BALB/ c 小鼠 im 甲基强的松龙 ( 100 mg/ kg ) 每 4
天 im 1 次,以接种病毒之日为 0 d,在接种病毒前 2 d
开始给药,即于 - 2, 2, 6, 10 d 给药[ 5, 6] ,于免疫抑制
后 2 d (即 0 d 时) 腹腔接种 1×106 PFU 病毒悬液。
2. 2　大蒜新素应用剂量的确定及毒性观察:按人和
小鼠间的剂量换算公式[ 7]计算得小鼠用药的低、高
剂量分别为 25, 75 mg/ ( kg·d) , 更昔洛韦的剂量
为 60 mg/ ( kg·d)。随机选取 5 只小鼠,如前方法
免疫抑制,不给病毒, ip 大蒜新素 75 mg / ( kg·d) ,
共用 18 d 后处死小鼠,取血进行肝功能测定及肝组
织切片 HE 染色以观察大蒜新素的毒性反应。
2. 3　动物分组: 70 只 BA LB/ c 小鼠在免疫抑制
(方法同 2. 1) 的基础上随机分为大蒜新素预防+
治疗高、低剂量组、大蒜新素治疗高、低剂量组、更昔
洛韦治疗组、安慰剂组、空白对照组, 每组 10 只小
鼠。预防+ 治疗组于病毒感染前 48 h 开始用药, 治
疗组于病毒感染 48 h 后开始用药,安慰剂组于病毒
感染 48 h 后开始给予等量生理盐水,空白对照组不
感染病毒,仅与安慰剂组同期给予生理盐水。
2. 4　标本收集:在治疗组完成 14 d 疗程后同时处
死全部小鼠,眼眶静脉取血,肝素抗凝, 离心取血浆,
于 - 20 ℃ 保存备用。同时取肝脏右叶冰冻切片及
石蜡包埋切片。
2. 5　观察指标
2. 5. 1　一般情况:每天测量小鼠体重, 观察其体毛、
食欲、活动变化情况,进行详细记录。
2. 5. 2　小鼠组织中 MCMV 感染情况:小鼠肝、肾、
肺组织冰冻切片进行 X-gal 染色,显微镜下观察到
淡蓝色细胞斑点即为 RM461 病毒感染细胞。计每
低倍视野染色斑点个数。
2. 5. 3　肝功能测定及肝组织病理检查:取上述血浆
标本用 AU100自动生化分析仪测定 ALT 水平, 肝
组织切片经 HE 染色,显微镜下观察肝脏病理改变,
记录 Knodell 肝组织病变活动性积分 ( HAI) [ 8, 9]。
2. 5. 4　肝组织切片中 MCMV IE 基因的原位杂交
检测: 按冯作化等[ 10] 所述原位杂交的方法, 以
MCMV IE 片段作为探针, 运用地高辛标记及检测
试剂盒对肝组织切片进行 MCMV DNA 原位杂交
检测,核固红复染,设不加探针为阴性对照。用显微
镜图像分析仪对切片进行图像分析, 所有切片均在
同一放大倍数 (×200) 及同一光强度下分析,每张
切片随机分析 10 个视野, 分别测肝组织阳性细胞
积分光密度,取平均值。
2. 6　统计学处理: 实验数据均用 x±s 表示, 多组间
用方差分析和 q 检验,两组比较用 t 检验,用相关系
数检测指标间的相关性, 皆以 SAS 统计软件处理。
3　结果
3. 1　一般情况:安慰剂组小鼠出现体重不增, 毛稀
松、生长迟缓、食欲差、活动少等表现,大蒜新素各组
和更昔洛韦治疗组小鼠一般情况良好, 未发现以上
异常情况。
3. 2　毒性观察: 取 5 只小鼠仅给大蒜新素 75
mg/ ( kg·d) , 共用 18 d,肝切片 HE 染色未见明显
病理变化,血浆 ALT 平均值 42. 00±13. 00, 与空白
对照组 40. 70±12. 02 相比无显著差异。
3. 3　小鼠组织中 MCMV 感染情况:肝、肺、肾组织
冰冻切片 X-gal 染色可见淡蓝色斑点, 其中以肝脏
·530· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 6 期 2003年 6月
切片 X-gal 染色淡蓝色斑点为多。
3. 4　各组 HAI 评分、ALT 及肝组织内 MCMV
DNA 水平比较:大蒜新素各预防+ 治疗组、治疗组
及更昔洛韦治疗组 HAI 评分、ALT 及肝组织内
MCMV DNA 水平与安慰剂组相比均明显降低
( P< 0. 05) ;大蒜新素各预防+ 治疗组、治疗组 HAI
评分、ALT 及肝组织内 MCMV DNA 水平与更昔
洛韦治疗组之间比较无显著差异;在大蒜新素各预
防+ 治疗组及治疗组之间 HAI 评分、ALT 及肝组
织内 MCMV DNA 水平亦无显著差异,见表 1。
表 1　各组 HAI 值、ALT 含量及肝组织内 MCMV DNA 积分光密度比较 ( x±s)
Table 1　Comparison of HAI, ALT and MCMV DNA integral photodensity in liver tissues among all groups ( x±s)
组　别　　 剂　量
/ (m g·kg- 1)
ALT
/ ( U·L- 1)　范围 HAI 积分光密度
大蒜新素预防+ 治疗 75 53. 3±17. 94　( 36～85) △ 　　　2. 8±1. 93* △ 　　118. 84± 44. 82* △
25 61. 8±12. 73　( 45～86) △ 3. 2±1. 99* △ 134. 84± 44. 51* △
大蒜新素治疗 75 61. 0±13. 87　( 45～91) △ 3. 2±1. 62* △ 131. 54± 94. 60* △
25 62. 4±13. 38　( 50～81) △ 3. 5±1. 65* △ 137. 92± 66. 45* △
更昔洛韦治疗 60 62. 0±12. 68　( 39～81) △ 2. 6±1. 51* △ 134. 62± 60. 83* △
安慰剂 - 97. 0±44. 98　( 58～201) * * 6. 7±2. 83* * 220. 86±108. 00* *
空白对照 - 40. 7±12. 02　( 24～58) 0 0
　　　　与空白对照组比较: * P< 0. 05　* * P< 0. 01; 与安慰剂组比较: △P< 0. 05
　　　　 * P < 0. 05　* * P < 0. 01 v s cont rol group; △P < 0. 05 v s placebo group
4　讨论
　　CMV 是胎儿、新生儿及免疫功能不全者 (如器
官移植者、恶性肿瘤放、化疗后及 HIV 患者等) 的
重要致病因子。但由于 CMV 病毒具有严格的种特
异性, 不可能在动物模型上研究抗 HCMV 药物的
疗效。而 MCMV 和 HCMV 在基因及核酸水平有很
多相似性, 在 HCMV 中存在的人类基因类似物在
MCMV 中亦同时存在 [ 11]。MCMV 感染和 HCMV
感染亦非常相似,在免疫功能不全小鼠可致急性感
染或死亡,在免疫功能正常小鼠易造成慢性感染,且
在急性感染小鼠组织中 MCMV 维持较高水平,这
对于观察药物抑制 MCMV 作用提供了良好的模
型。MCMV 鼠感染模型已多次运用于抗病毒药物
的研究 [ 12～14]。在本实验中,我们利用免疫抑制小鼠
成功地制造出 MCMV 性肝炎小鼠模型。
大蒜新素在体内的抗 CMV 作用已被多次实验
证实,对于大蒜新素在体内的抗 CMV 作用,国内有
一些探索[ 2～4] ,但由于上述研究观察指标有限或没
有设置其他药物对照, 其结果缺乏说服力。本实验通
过观察大蒜新素对 MCMV 肝炎小鼠肝功能、肝组
织病变及肝组织内病毒 DNA 负荷量的影响,并以
具有良好抗 CMV 效应的更昔洛韦作为对照,进一
步探讨大蒜新素在整体水平预防和治疗巨细胞病毒
感染的效应。结果显示, 大蒜新素在 MCMV 性肝炎
小鼠模型中, 可显著改善小鼠肝功能及肝脏组织病
变,降低肝组织中 MCMV DNA 负荷量, 其治疗效
应和更昔洛韦相比无显著差异, 证实大蒜新素在体
内具有和更昔洛韦相似的抗 CMV 作用。但高剂量
药物效应并不优于低剂量, 增加预防用药亦不优于
感染后开始用药。由于小鼠静脉用药困难,本实验采
用了 ip 这一非正常途径用药,加之大蒜新素局部刺
激性大, 在一定程度上可能影响了大蒜新素的生物
利用;本实验使用大蒜新素 2 周未能清除小鼠体内
病毒,长期用药能否清除有待进一步观察。
大蒜新素的副作用包括致实验动物血红蛋白合
成减少、溶血及贫血[ 15]。Alnaqeeb [ 16]等发现小剂量
大蒜提取液 [ 50 mg / ( kg·d) ] 不会导致大鼠肝脏
及肺明显的病理变化,而超大剂量大蒜提取液 [ 500
mg/ ( kg·d) ] 可导致大鼠肝脏及肺组织发生明显
的病理变化。大蒜提取液为大蒜鳞茎的粗提液,其成
分复杂,对机体影响大,而大蒜新素为大蒜的有效成
分,药效提高,对机体影响减小。本实验所用高剂量
大蒜新素 [ 75 mg / ( kg·d) ] 为 Alnaqeeb 等所用大
蒜提取液小剂量的 1. 5倍,用药 18 d未发现肝脏有
明显病理变化。提示大蒜新素低剂量和高剂量应用
于小鼠都是安全的。
和目前临床应用的抗 CMV 药物相比, 大蒜新
素有副作用小、价格便宜的优点,特别对小儿更易耐
受,显示出良好的临床应用前景。
References:
[ 1]　Fang F, Don g Y S , Wei Q, et al . A pr ospect ive s tu dy of liv-
er impairment caused by cytom egalovirus in infan cy [ J ] . Chin
J Ped iat r (中华儿科杂志) , 1995, 33( 6) : 350.
[ 2]　Guo N L , Lu D P, Woods G L , et al . Dem onst ration of the
ant i-viral act ivity of gar lic ext ract again st h uman cy-
tomeg aloviru s in v i tro [ J ] . Chin Med J ( E ngl ) (中华医学杂
志英文版) , 1993, 106( 2) : 93-96.
[ 3]　M eng Y S , Lu D P, Guo N L, et al. Ant i-hum an cytome-
galovirus ef fect of all itridin and it s use in bone marrow t ran s-
plantation [ J] . Chin J H emato (中华血液学杂志) , 1992, 13
·531·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 6 期 2003年 6月
( 12) : 627-629.
[ 4]　Fang F, Dong Y S , Li H, et al. T reatment of hepatit is cau-
sed by cytomegalovirus w ith Al lit ridin In jection : an experi-
mental stud y [ J ] . A cta Univ Med T ongj i (同济医科大学学
报) , 1999, 19: 271-275.
[ 5]　Duan Y, Hernandez R, Pang L, et al . S pread of mu rine cy-
tomegalovirus to inner ocular st ructures following disrup tion
of the b lood-ret ina barrier in imm unosupp res sed BALB/ c
mice [ J] . I nv est Op hthalmol Vi s S ci, 1996, 37( 5) : 935-940.
[ 6]　Ather ton S S , New ell C K, Kanter M Y, et al . T cell deple-
tion in creases sus cept ibilit y to murine cytomegalovirus ret ini-
ti s [ J ] . I nv est Op hth almol Vi s S ci, 1992, 33 ( 12 ) : 3353-
3360.
[ 7]　Xu S, Bian R L, Ch en X, et al . Methodology in P harmaco-
l og ical E xp eriment s ( 药理实验方法学 ) [ M ] . Beijing :
Peoples M edical Publ ishin g House, 1991.
[ 8]　Knodel l R G, Ishak K G, Black W C , et al. Formu lat ion and
app licat ion of a numerical scoring system for as ses sing his to-
logical act ivity in asymptomat ic ch ronic act ive hepat it is [ J ] .
H epatology, 1981, 1: 431-435.
[ 9]　Desmet V J, Gerber M , Hoofnagle J H, et al . Clas sif icat ion
of ch ronic hepat it is: diagnosis , grading and s taging [ J ] .
H epatology, 1994, 19: 1513-1520.
[ 10]　Feng Z H, Hu ang Fu Y M, B asic E xp erimental Tech niques in
M olecular B iology ( 分子生物学基本实验技术 ) [ M ] .
Wuhan: T on gji Medical Un ivers ity Publis hing House, 2000.
[ 11]　Rawl inson W D, Farrel l H E, Barr ell B G. Analysis of the
complete DNA sequ ence of murin e cytomeg aloviru s [ J ] . J
V ir ol , 1996, 70 ( 12) : 8833-8849.
[ 12]　Overal l J C J , Kern E R, Glas gow L A. Ef fect ive ant iviral
chemotherapy in cytomegalovirus infect ion of mice [ J] . J I n-
f ec t Dis, 1976, 133: A237-A244.
[13]　Bolger G, Lapeyre N , Rheaume M, et al. Acu te murine cy-
tomeg aloviru s infection : a model for determining ant iviral ac-
t ivity against CMV in duced h epat it is [ J] . A nt iv iral Res,
1999, 44( 3) : 155-165.
[ 14]　Smee D F, Reis t E J. Potent ant i-mu rine cytomegalovirus ac-
t ivity and reduced neph rotoxicity of ganciclovir cycl ic ph os-
ph onate [ J ] . A ntimicr ob A gent s Chemother , 1996, 40 ( 8) :
1964-1966.
[ 15]　Fan D H, Wang Y L. Chinese Drug s E ncy clop ed ia ( Western
Med icine) (中国药物大全西药卷 ) [ M ] . 2nd ed, Beijing:
People s Medical Pub lish ing H ou se, 1998.
[ 16]　Alnaqeeb M A, T homson M , Bordia T , et al . Histopatholo-
gical ef fects of garl ic on liver and lung of r at s [ J ] . T ox icol
L ett , 1996, 85( 3) : 157-164.
土槿乙酸对人黑素瘤细胞增殖抑制作用研究
姜孟臣, 陈　虹,张　敏,陈　莉

(武警医学院 药学教研室,天津　300162)
摘　要: 目的　研究土槿乙酸 ( PAB) 对人黑素瘤细胞 ( L iBr ) 生长的抑制效应,并探讨其作用机制。方法　用不同
浓度的 PAB 加入体外培养 L iBr 细胞中, 观察加药后细胞生长数量及其形态的变化; 用 M TT 法检测 PAB 的细胞
毒作用; 用 Hoechest 33342 和 P I 双荧光染色法检测细胞凋亡。用免疫细胞化学方法, 观察 L iBr 细胞基因表达的变
化。结果　PAB 明显抑制 L iBr 细胞生长; IC50值为 2. 5×10- 5 mo l/ L ;其抑制率与药物浓度呈剂量依赖关系 ;凋亡
细胞的比例与药物浓度及作用时间呈正相关。免疫细胞化学检测显示 p21WAF1表达增强。结论　PAB 能有效抑制
L iBr 细胞的增殖。
关键词: 土槿乙酸; L iBr 细胞; 细胞增殖
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 06 0532 03
Effect of pseudolaric acid B on proliferation of human LiBr cell line in vitro
JIANG Meng-chen, CHEN Hong , ZHANG M in, CHEN Li
( Depart ment of Pha rmacy , Medical Co lleg e of Chinese Peoples A rmed Police For ces, T ianjin 300162, China)
Abstract: Object　T o study the inhibitory effects and mechanism o f pseudo lar ic acid B ( PAB) on the
gr ow th of LiBr cell line. Methods　PAB in differ ent concentrat ions w as added into the medium in which
LiBr cells w er e cultured. T he changes of cell morphology w ere observed by phase contrast m icroscope. Cy-
to toxicity o f PAB was detected by MT T . The number of apoptot ic cell w as calculated by double f luores-
cent staining . The lev el o f p21WAF1 protein w as measured w ith immunocytochemist ry . Results　The growth
of L iBr cell line w as r emar kably inhibited by PAB. The IC50 values o f PAB for L iBr cells w as 2. 5×10- 5
mol/ L . The inhibito ry rate and the apopto tic cel l r ate were related w ith the medicine concentration. T he
level of p21WAF1 protein in LiBr cel ls tr eated w ith PAB was obviously increased. Conclusion　PAB can ef-
fect ively inhibit the proliferat ion o f LiBr cell line.
Key words : pseudolaric acid B ( PAB) ; L iBr cell line; cell prol iferation
·532· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 6 期 2003年 6月
收稿日期: 2002-10-14基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30171108) ; 天津市自然科学基金重点课题 ( 003805211)作者简介:姜孟臣( 1962—) , 男,内蒙古赤峰市人,学士,毕业于内蒙古医学院,硕士学位在读,现在武警医学院药学教研室工作,研究方向:抗肿瘤药物作用机制研究。