全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第11期2005年11月· 679·
成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分裂的关系
姚晓黎，张成。，卢锡林，陈松林，冯善伟，李群
(中山大学附属第一医院神经科，广东广州 510080)
摘要：目的探讨成人骨髓问质干细胞(hMSC)向神经元样细胞分化过程中分化与细胞分裂的关系。方法从
成人骨髓中分离骨髓闻质于细胞(MSC)，培养扩增。用参芪液诱导MSC分化为神经元样细胞，经免疫组化鉴定其
神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。诱导后进行神经元样细胞计数，
掺人Brdu测定，计算标记系数。采用双标记间接免疫荧光法检测神经元样细胞特异性表面标记(NSE、NF)与细
胞分裂的标记Brdu的关系。抑制DNA合成，计算Brdu、NSE和NF阳性细胞数。结果MSC经参芪液诱导后，
可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性，GFAP阴性。MSC诱导分化后的细胞总
数增加，诱导分化后12h内细胞增殖较快。30％以上分化的神经元样细胞在表达NSE和NF的同时可见Brdu标
记，而另一部分分化的神经元则无Brdu标记。抑制DNA合成，并不会阻止神经元的分化，仍有70％的分化神经
元表达神经元特异性标记蛋白NSE。结论MSC诱导分化的部分神经元样细胞可进行细胞分裂，但抑制细胞分裂
不影响神经元分化。
美t词：骨髓阃质干细胞；神经元l细胞分裂f参芪液
中田分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)11—1679—04
Relationshipbetweenmitosisandifferentiationfromhamanmesenchymal
stemcellintoneuron—likecell
YAoXiao一1i。ZHANGCheng，LUXi—Iin，CHENSong一1in，FENGShan—wei，LIQun
(DepartmentofN urology，TheFirstAffiliatedHospital，SUNYat—senUniversity，Guangzhou510080,China)
Abstract：ObjectiveTostudytherelationshipbetweenmitosisandifferentiationintheprocessof
inductionfromhumanmesenchymalstemcells(hMSC)intoneuron—likecells．MethodsMesenchymal
stemcells(MSC)wereseparat dfromhumanmarrow，cultured，andexpandeinculturemedium．After
MSCwasinducedtodifferentiateintoneuron—likecellswithShenqiLiquid，expressionofneuron—specific
enolase(NSE)，neurofilament(NF)，andglialfibrillaryacidicprotein(GFAP)weredetectedbyimmuno—
cytochemistry．respectively．Totaleellcountbeforeandafterdifferentiationwerecalculated，theBrdu1a—
belingindex(LI：theratioofBrdu—labeledtototalcells)wasme ured．Usingdoublelabelindirectim—
munofluorescence，ther lationshipbetweenn uron—likecellsandmitosiswasilluminated．ResultsMSC
exhibitedneuronalphenotypeaftert eatedwithinducers，ShenqiLiquid．TheexpressionsofNSEandNF
intheneuron—likecellswerepositive，butGFAPwasnotfound．Thenumberoftotalcellswasincreased，
especiallyduringthefirst12hofinduction．0ver30％neuronexpressedNSEandNFincorporatedBrdu，
whileanotherpartofneuronn tincorporatedBrdu．InhibitingtheDNAsynthesis，hMSCstilldifferentiat—
edintoneuron—likecellsandover70％expressedneuronspecificgeneproductssuchasNSEandNF．Con—
elusionSomen uron～likecellsafterinductionwouldundergomitosis，hutin ibitingheDNAsynthesis
doesnotinfluencethen urogenesis．
Keywords：mesenchymalstemeell(MSC)；neurons#mitosis；ShenqiLiquid
传统上认为，细胞分化需从多能干细胞分化为
定向祖细胞、定向前体细胞，直至最终的系细胞。而
近来研究却提出不同的说法，认为多能干细胞、定向
祖细胞、定向前体细胞三者之间没有明确的界限，并
提出转分化和去分化等观点‘““。在参芪扶正注射液
(参芪液)体外诱导分化为神经元样细胞的前提下，
本研究拟初步说明骨髓间质干细胞(mesenchymal
stemcells，MSC)与分化后的神经元样细胞的关
特∞随一耕㈣料州球氖m㈣㈣酬～硼卧微蝴馘斟缎槲黧量～嚣攀～黪锵瓣
万方数据
·1680· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第11期2005年11月
系，是直接转化还是通过细胞分裂、神经元样细胞的
特异性标记的表达与细胞分裂的关系如何、在分裂
前表达还是分裂后表达、抑制细胞分裂是否抑制神
经元样细胞的特异性标记的表达等问题。
1材料
1．1成人肋骨：来源于非血液系统疾病的胸外科手
术中摘取的肋骨。
1．2主要试剂：胎牛血清(FCS，Hyclone公司)、
DMEM(Gibcobrl公司)、Ficoll—paque分离液
(Pharmaeia公司)、碱性成纤维细胞生长因子
(bFGF，PeproTech公司)、小鼠抗人神经元烯醇化
酶(NSE，Maxim公司)、胶质纤维酸性蛋白
(GFAP，Maxim公司)、小鼠抗人神经微丝蛋白单
抗(NFH，NeoMarkers公司)、超敏SP(鼠)试剂
盒(MBI公司)、DAB显色试剂盒(DAKO公司)、
溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu，Sigma公司)、SABC—
Cy3免疫荧光检测试剂盒和SABC—FITC免疫荧光
检测试剂盒(Boster公司)、参芪液(250mL，含党
参和黄芪生药各10g，购自广东丽珠集团利民制
药厂)。
2方法
2．1 MSC的分离培养与鉴定按文献方法01进行。
2．2体外诱导MSC定向分化为神经元样细胞“]：
传至第5代的MSC按4×108／L密度接种于有盖
玻片的六孔板内制备细胞爬片。细胞用含bFGF
(10ng／mL)的DMEM(20％FCS)预诱导24h，
更换培养液，PBS洗涤3次，再加入稀释200倍参
芪液的无血清DMEM诱导5h。对照组不加任何诱
导剂。每组包括18个细胞爬片。
2．3神经元样细胞的鉴定：按DAB显色试剂盒方
法染色。参芪液诱导的细胞免疫组化染色后光镜下
随机选取lo个非重叠视野(×100)，计算NSE和
NFH阳性细胞占总细胞数的比例，结果用z土S
表示。
2．4 Brdu掺人法检测标记指数：Brdu特异掺入S
期细胞，通常测定其标记指数(1abeledindex，LI)，
即s期细胞占细胞周期的百分数，进行Brdu阳性
比例的测定。配置Brdu10mmol／L，备用。取适量
Brdu掺入培养细胞中，终浓度为10gmol／L。按照
下述方法进行免疫荧光检测。随机选取10个非重
叠视野(×100)，计算Brdu阳性细胞占总细胞数的
比例，结果用z士s表示。
2．5双标记间接免疫荧光方法检测神经元样细胞
特异性表面标记：细胞用4％多聚甲醛固定30
min；5％正常羊血清封闭10min；分别加入小鼠抗
人神经元烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白
(GFAP)单克隆抗体(1111用型)、小鼠抗人神经微丝
蛋白单抗(NFH，1：100稀释)，室温孵育1h或4
℃过夜；加入羊抗小鼠一CY3或FITC，黑暗中反应
1 h；荧光显微镜下观察，摄影。双标法在上述基础，
加入2mol／L盐酸固定1h；加入Brdu单抗，室温
孵育1h或4℃过夜；加入羊抗小鼠一FITC或
CY3，黑暗中反应1h，以上步骤均需PBS洗涤5
rain×3次；共聚焦显微镜(ZEISSLSM510
META，德国)观察，摄影。
2．6抑制细胞DNA合成：在培养细胞中加入终质
量浓度为10pg／mL阿糖胞苷进行神经诱导分化
24h，按上述方法进行双标记间接免疫荧光方法。随
机选取10个非重叠视野(×100)，计算Brdu阳性
细胞占总细胞数的比例，结果用z±s表示。
3结果
3．1 MSC的分离、纯化、扩增与体外向神经元样细
胞的诱导分化：经骨髓单核细胞分离纯化的MSC，
形态呈梭形。随着MSC的迅速增殖，约10d可见
细胞的排列有一定的方向性，呈旋涡状。20d细胞
接近融合，经胰酶消化后，可获得5×105～6×105个
MSC。体外扩增15代，细胞数可达3×10”～4×
10”个，扩增约1×106倍。经参芪液诱导后，MSC形
态发生变化，呈典型的核周体形态，突起伸出(轴
突)，并在轴突末端出现一级和二级分支，类似树突。
3．2神经元样细胞的形态及其细胞分裂现象：使用
相差显微镜和荧光显微镜来记录在神经元诱导分化
后24h内的改变。在加入诱导剂前和加入后24h
分别进行细胞计数(包括未分化和已分化的MSC
细胞)，MSC形态发生变化，细胞变圆，伸出突起，呈
神经元的外形。随着诱导分化时间的延长，总的细胞
数在增加，在分化后24h，细胞数提高超过65％。在
诱导前，Brdu阳性细胞比例约45％，2h后略有下
降约为33％，12h后约为28％，24h后急剧下降约
为5％。
3．3神经元特异性基因产物表达与细胞分裂：为了
懈在诱导后24h的细胞分裂，用神经元特异性标记
蛋白NSE和NF的抗体来标记MSC诱导后的细
胞，同时检测Brdu。结果显示Brdu在未分化MSC
的表达，用FITC为荧光染料，荧光显微镜下可见细
胞核呈绿色。MSC在诱导后24h内掺人Brdu，用
连有CY3的NSE抗体标记神经元样细胞，间接免
疫荧光双标法显示MSC分化成神经元样细胞，有
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第u期2005年11月-1681·
树突和轴突，并且NSE阳性，即神经元样细胞呈现
红色荧光。在分裂中期，可见Brdu掺入。部分细胞
NSE阳性同时可见Brdu标记，即神经元样细胞呈
现红色荧光伴有绿色细胞核，也可见部分NSE阳
性细胞无Brdu标记。图1表示NSE阳性和Brdu
标记细胞之同的定量关系。可见分化和未分化细胞
Brdu标记比例基本一致；而分化后的细胞NSE阳
性比例约52％，明显高于未分化细胞；分化后的细
胞NSE阳性同时有Brdu标记的细胞比例约32％，
也明显高于未分化细胞；同时约有20％NSE阳性
的神经元样细胞元Brdu标记，即没有进行细胞分
裂。此结果意味着神经元特异性标记蛋白NSE的
表达，可发生在细胞分裂之前、之后或伴随细胞分裂
发生。为了进一步验证上述结果，在MSC诱导后8
h内快速掺入Brdu2h，之后进行固定等免疫荧光
等检测步骤。用连有CY3的NF抗体标记神经元样
细胞，间接免疫荧光双标法显示MSC分化成神经
元样细胞，有树突和轴突，由于NF阳性，即神经元
样细胞呈现红色荧光。在分裂中期，合并Brdu掺
入，即神经元样细胞呈现红色荧光伴有绿色细胞核。
结果与采用NSE标记相似。
油1血占．量
NSE阳性表达 Brdu掺入标记NSE阳性爱达+
Brdu掺^标记
圈1 MSC分化前后NSE阳性表达和Brdu掺入结果
Fig．1ResultsofNSEpositiveexpressionand
BrduincorporaHonInMSCbeforeanO
afterdifferentiation
3．4抑制细胞DNA合成后与神经元样细胞分化
的关系：为进一步说明神经元样细胞分化与细胞分
裂的关系，使用阿糖胞苷(DNA合成抑制剂)来检
测分化过程。结果用cY3作为荧光染料，间接免疫
荧光双标法显示神经元样细胞呈现红色荧光，而细
胞核没有出现绿色荧光，说明没有Brdu标记，因为
阿糖胞苷抑制了细胞分裂。图2可见加入阿糖胞苷
后。细胞分裂受抑制，细胞数明显减少。图3表明在
加入阿糖胞苷后，Brdu标记细胞比例几乎为零，因
为阿糖胞苷强烈抑制DNA合成，从而抑制了Brdu
的摄取。而NSE阳性细胞比例没有明显改变。
4讨论
本实验结果显示MSC和神经元样细胞的细胞
2
×
一
鼎
羽
罂
器
阿糖胞昔处理前阿糖胞苷处理后
豳2阿糖胞苷处理前后MSC细胞总数的变化
Fig．2ChangeoftotalnumberofMSCpre-and
post‘treatmentbyarabinosylcytosine
《1芝
秘
嚣2：
1一阿糖胞苷处理前
f‘二二●●
田3阿糖胞苷处理前后MSC细胞中NSE阳性表达
和Brdu掺入细胞比倒变化
Fig．3ChangeofNSEpositiveexpressionandBrdu
incorporationinMSCpre—andpost—treatment
byarahinosylcytoslne
分裂都很活跃。从MSC分化为神经元样细胞过程，
在24h提高细胞数60％。而掺入Brdu后，LI在分
化早期较高，随着分化时问的延长，LI从40％下降
至5％左右。表明在诱导分化后的12h内，细胞的
增殖能力比较强，随着分化时间的延长，增殖能力有
所降低，可能与神经元样细胞日趋成熟有关。意味着
细胞分裂与细胞分化可以同时发生，神经元特异性
标志的表达并不会阻止细胞分裂，这与Black等[5“]
研究交感神经元分裂与分化的结果一致。
分化后的神经元样细胞不仅形态相似，而且表
达神经元特异性基因：如NSE、NF，同时还联合表
达细胞分裂S期标志Brdu。提示神经元多基因的表
达和神经元形成的同时也伴随细胞分裂。推测MSC
定向分化为神经元样细胞不是严格意义上细胞分裂
后的现象。而且这个分化过程也不是按照简单的干
细胞模式：不对称分裂分化，使其中一个子代细胞不
可逆转分化为功能专一的终末细胞而形成具有自我
更新的有功能的细胞。如向神经分化的前体细胞o]。
以阿糖胞苷来证实神经元分化不需要细胞分
裂。阿糖胞苷不仅可以抑制Brdu的表达，而且还阻
止细胞增殖和细胞数的增加，但是并不阻断神经元
特异性基因的表达。因此，神经元的形成和基因的表
达并不一定需要细胞分裂。
本实验结果显示MSC定向诱导分化为神经元
样细胞，并表达神经元特异性基因NSE、NF，可以
万方数据
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在细胞分裂存在时发生，也可以不需要细胞分裂。这
可以初步说明干细胞、多能干祖细胞和定向分化前
体细胞之间的关系。在没有细胞分裂的前提下，神经
元分化的发生意味着至少有一部分神经元直接来自
有功能的前体细胞，而不是干细胞，因为干细胞需要
经过细胞分裂才能分化。这个结论与既往的观点不
同“1。他们认为干细胞需要经过细胞分裂分化成多
能干祖细胞，才可以进行神经元分化。而且，研究表
明神经元诱导剂至少直接作用于一部分“已经准备
好”的MSC引起神经元的分化。这与上述的结果一
致。未分化MSC表达所有胚层的基因，包括内胚
层、中胚层、外胚层和生殖层。在这个模式中，分化即
是优先数量调节在多分化潜能的MSC已表达的基
因。肾的间质干细胞可以表达神经微丝蛋白的轻链
(NF—L)，一种神经外胚层的标记，说明多分化和多
潜能的间质干细胞不只局限在骨髓口]。
本实验结果表明MSC定向诱导分化为神经元
样细胞，不需要通过干细胞分裂的途径，逸与Shen
等““研究一致，在胰腺细胞转分化为肝细胞的过
程，只需要环境中的地塞米松，而不需要细胞分裂和
体细胞的突变。尽管这样，本研究中部分神经元样细
胞在分化前后联合表达细胞分裂s期标志Brdu，与
既往的干细胞分化途径一致。通过本实验可以暂时
得出结论，MSC分化可以通过细胞分裂或非细胞分
裂途径，MSC有干细胞和前体细胞的功能，即MSC
具有多分化潜能。近年越来越多的研究表明，骨髓造
血干细胞可逆地、持续地改变表型，影响细胞周期相
关染色体的改变，最终允许分化转录因子进入。这个
过程与本研究一致。多分化潜能的MSC具有干细
胞和前体细胞的功能，可使神经元的分化通过分裂
和非分裂途径。因此，干细胞、祖细胞和前体细胞的
功能是可逆的，很难严格区分““。
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万方数据
成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分
裂的关系
作者： 姚晓黎， 张成， 卢锡林， 陈松林， 冯善伟， 李群， YAO Xiao-li， ZHANG Cheng，
LU Xi-lin， CHEN Song-lin， FENG Shan-wei， LI Qun
作者单位： 中山大学附属第一医院,神经科,广东,广州,510080
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(11)
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