全 文 ：苦豆碱抗病毒作用研究
白求恩医科大学 (长春 13 0 0 2 1) 李 凡 ‘ 石艳春 张绍伦
苦豆碱 (al oP er in e ) 系豆科 槐属 植 物苦 豆 子
SoP 彻ra al oP ec u ro id es L 中的生物碱 , 具有明显的
抗 炎作用 〔‘〕、抗变态反应 〔2 〕、清热 、止痛 、 杀虫〔3 〕、镇
痛 、镇静 、 降温〔们 、抗菌 、抗癌 之” 等作用 , 其抗病毒作
用未见报道 。 我们探讨了苦豆碱体外抗病毒作用及
其机理 。
1 材料
1
.
1 细胞 :人宫颈癌细胞 (H e L a) 、小鼠成纤维细胞
(L 、。)为本室保存 。 人羊膜细胞 (Fl才 )由长春生物制
品研究所提供 。
1
.
2 病 毒 : 水泡性 口 炎 病 毒 (V S V ) , 仙 台病 毒
(s V )
, 柯萨奇 B 组 1一 6 型 (C B I一 。V )病毒 , 风疹病毒
(R V )
, 为本室 保存 。 脊髓灰质炎病毒 I 、 l 、 l 型
(PV I
、 皿 、 l )购于北京生物所 。 腺病毒 皿 型 (A d V
孤 )由本校一院儿科提供 。 埃可病毒 6 (E C H O 。)型由
本校流行病学教研室提供 。 单纯疤疹病毒 I 、 l 型
(H S V I
、
R )
、牛痘病毒 (v V )来 自本校地方病研究
所 。 麻疹病毒(M V )为长春生物所冻干疫苗 。 新型肠
道病毒 71 型 (E 7 l V ) 、柯萨奇 A : 6病毒 (C A I。V ) 由日
本仙台国立医院赠 。
1
.
3 苦豆碱 : 为水溶性白色结晶 , 含量 95 % 以上 ,
m p 73 ℃ 一 75 c , 易溶于水 。由宁夏药物研究所提供 。
1
.
4 培养基 : IM D M 培养基为美国产品 。
1
.
5 仪器 : 国产 4 0 孔微量培养板 , 国产特制 75 1 型
分光光度计等 。
2 方法
2
.
1 细胞的筛选与制备 : 所用的 20 种病毒分别种
于 H el 矛a 、 L 92 。及 F’I 才 细胞 仁测定敏感性 , 细胞按常规
方法传代 。 同时制成 2 x lo 5 / m L 细胞悬液 , 每孔 。‘ 1
m l
矛 ,
2 4 h 形成单层备用 。
2
.
2 病毒毒力测定 : 采用 T C ID S。微量法傲 , 本实验
采用不同病毒的 1 0 0 一2 0 0 T C ID S。 / o · 1 m L 。
2
.
3 初筛 :形成单层的细胞孔弃去培养液 , 加入对
细胞无毒性浓度的苦豆碱作用 24 h , 吸出药液加入
病毒液 , 按一般病毒吸附时间 , 均采用 3 7 C 吸附 l h
吸 出 , 加入含苦豆碱的维持液 , 置 37 C 5 % C O Z恒温
箱培养 48 一 9 6 h , 待病毒对照孔病变达附) 洲 , 细胞
对照 正常时测结果 。
2
.
4 分组实验 : 初筛有意义的病毒分 4 组明进行实
验 , 探讨苦豆碱的具体作用环节 。 I 组 :感染前 24 h
给药 , 吸出药液 , 用 H an k , s 液洗 3 遍 , 加入病毒液 。
l 组 :感染后给药 , 先加病毒液置 37 一C 吸附 l h 洗去
病毒加含药维持液 。 皿组 :药液与病毒同时加入细胞
层 。 w 组 :药液与病毒液混合后置 37 ‘C 吸附 Z h 后加
入细胞层 。 以上均设正常对照及相应病毒对照 。
2. 5 结果测定
2
.
5
.
1 光镜观察细胞致病效应 (C PE ) 。
2
.
5
.
2 染色摄 入法撇根据 C PE 有脱落特征 , 采用
存留细胞结晶紫染色 , 使用分光光度计从波长 54 。
n n ‘测 O D 值 。
2. 5
·
3 苦豆碱对组织培养细胞保护率计算
保护宽 (% )一噬留磊漂豁纂~ 丫 ‘。。%3 结果
3
.
1 苦豆碱对组织培养细胞的毒性测定 : 实验结果
表明 1 : 32 以上稀释的苦豆碱对 H e L a , L 92 9 、FI 一 细
胞均无毒性作用 。
3
.
2 苦豆碱保护浓度的测定 : 选用药液与病毒液同
时力}I入细胞层的方法测定了 1 : 3 2 、一 6 4 、 1 : 1 2 5 、
1
:
25 6 等 透个稀释度的苦豆碱抗病毒作用 。 结果 1
:
3 2
、
1 : 6 4 稀释度的苦豆碱有明显的抗病毒效应
(尸 < 0 . ()1 ) 。 根据毒性测定结果 , 本实验用 1 , 40 稀
释苦豆碱 , 其含量为 40 m g / L 。
3
.
3 初筛结果 : 利用光镜观察 C PE , 结果表明苦豆
碱可以不同程度地抑制 E ; , V 、C A , 。V 两种病毒对组
织细胞的 C P E , 而对 PV I 、 I 、 l 和 C B 卜 6 V 个型等
两种病毒的不同型别具有明显的抑制作用 , 见表 1 。
‘ 李 凡 女 , 1 9 8 2 年白求恩医科大学医疗专业毕业 。现任白求恩医大微生物学教研室副教授 , 医学硕士 。曾在 1 9 9 5 年获欧共体博士后奖学金 , 留学于马德里大学分子生物中心 。 一直从事病毒及免疫学方面的工作 曾获得过国家自然科学基金及 国家中医药管理局等课题多项 。 发表科研论文 20 余篇 , 曾获省级奖及校级奖多项 。
《中草药 》1 9 9 8 年第 29 卷第 4 期 , 2 5 3 .
表 1 苦豆碱对病毒致 C PE 的影响
—一一— 厂 11面西衍瘾 一病毒对照 实验 . 一~茹施漪嫩 病毒对照 实醚”C B I V 一 洲 一 P V I 一 权什 一C B : V 一 姗 一 PV n 一 洲 一
CB V 一 洲 一 P V I 一 姗 一
CB
;
V 一 洲 一 E 7 , V 一 阳 +
C B
:
V 一 洲 一 CA I 。V 一 洲 +
CB V 一 姗 一 A d V I 一 姗 姗
V S V 一 姗 洲 H S V I 一 洲 姗
S V 一 洲 +++ H S V I 一 姗 洲
R V 一 洲 姗 E CH O 6V 一 洲 +十
V V 一 姗 洲 M V 一 洲 姗
注 : 一 表示无细胞病变 , + ++什干洲 表示不同程度的细胞病变
3. 4 分组结果
3
.
4
.
1 结晶紫染色测定结果 :在镜下观察 C P E 基
础上 , 用结晶紫染色测 O D 值 , 以便客观地反映加药
与不加药之差别 。 I 组 : 实验目的是观察药物能否进
入细胞或吸附细胞表面以阻止病毒的吸附和进入 。
结果表明 , 此法对 p V I 、 互 、 l , e B卜 。v 型 , E : : v ,
C A 1 6 V 有意义 (p < 0 . 0 1 ) 。 n 组 : 实验 目的是观察药
物能否对细胞 内的病毒起作用 , 抑制其生物合成及
成熟释放 。 此法对 P V I 、 互 、 皿 , e B卜 。v 型 , E 71 v ,
CA
I。V 均有不同程度的作用 (尸< 。. 05 ) 。 l 、 w 组 :
为药物与病毒在不同条件下作用观察药物对病毒的
直接灭活作用 , 结果表明 , 此法对上述病毒均有作
用 。 说明无论是药物与病毒同时加入细胞层或是药
物与病毒先作用 Z h 然后加入细胞层 , 苦豆碱均能
发挥其抗病毒效应 。
3
.
4
.
2 苦豆碱对细胞的保护率计算 : 结果表明 , 苦
豆碱对细胞的保护率最高可达 94 . 1 % , 见表 2 。
表 2 苦豆碱对组织培养细胞的保护率比较 (% )
1 I I W
CB I V 3 8
.
4 0 6 0
.
3 0 4 5
.
1 0 5 0
.
10
CB Z V 4 0
.
5 0 5 7
.
8 0 6 0
.
2 0 7 0
.
2 0
CB 3 V 3 2
.
3 0 8 3
.
3 0 8 5
.
5 0 8 3
.
0 0
CB
4
V 3 5
.
7 0 8 0
.
6 0 8 9
.
3 0 73
.
3 0
CB S V 4 2
.
5 0 8 6
.
6 0 8 7
.
5 0 7 5
.
5 0
CB o V 3 0
.
0 0 6 2
.
2 0 6 0
.
0 0 8 0
.
0 0
P V 1 1 1
.
3 0 4 0
.
5 0 6 0
.
70 80
.
5 0
P V 1 2 3
.
7 0 4 8
.
8 0 7 0
.
70 6 0
.
6 0
PV 1 3 0
.
6 0 6 0
.
9 0 9 4
.
10 8 0
.
5 0
E v1 V 1 2
.
3 0 2 0
.
2 0 5 5
.
5 0 5 0
.
0 0
CA : 。V 1 0
·
2 0 1月: 了10 1 . 5 0 2 0 6 2 · 2 0
3
.
5 药物对病毒毒力的影响 : 将苦豆碱与 C B 3 V 、
PV 工 、E 7 1 V 、 C A 1 6V 分别在 3 7 C下作用 Z h , 测定病
毒的 T C ID 。。(滴度以 lg T C ID S。 / 0 . 1 m L 表示 ) 。 结果
病毒对照组分别为 4 . 5 、 5 、 4 . 75 、 4 . 5 , 实验组分别为
2
·
5
、
2
、
2
·
2 5
、
2
, 经此作用病毒滴度明显下降 , 抑制对
数分别为 2 . 0 、 3 、 2 . 5 、 2 . 5, 进一步证明了苦豆碱对
C B 3V
、
PV I
、
E
7 1 V
、
C A l o V 有直接灭活作用 。
4 讨论
苦豆碱是近年来从祖国医药宝藏中挖掘出的具
有多种功效的有发展前景的新药 。 为了进一步探讨
其抗炎作用机理 , 我们对其进行了抗病毒研究 , 结果
证 明具有明显的抗肠道病毒作用 , 对 C B 3v 、 P v l 、
E 7 1V
、
C A , 6 V 的抑制对数可达 2 . 0 一 3 . 0 , 对细胞的
保护率最高可达 94 . 1 % 。 经体外定量实验证明将苦
豆碱稀释至 1 : 64 倍时 (15 . 62 m g / L )仍具有抗病
毒作用 。通过对其抗病毒作用环节的检测 , 我们发现
苦豆碱不仅有直接灭活病毒的作用 , 而且对吸附于
细胞表面和进入细胞内的病毒都有抑制作用 。
苦豆子主要产于我国西北地区 , 分布广产量大 ,
其各种生物碱有多种生理活性 。 通过我们的研究为
进一步开发利用苦豆碱 , 一寻找新的抗病毒中药提供
了科学依据 。
参 考 文 献
1 张宝垣 , 等 . 中国药理学会编 . 药理学进展 (抗炎免疫
分册 ) . 北京 : 人民卫生出版社 , 1 9 8 3 . 1 41
2 周重楚 , 等 . 中国药理学报 , 1 9 8 9 , 1 0 (4 ) : 3 6 0
3 江苏新医学院编 . 中药大辞典 . 上册 . 上海 : 上海人民
出版社 , 19 7 7 . 12 9 3
4 袁惠南 , 等 , 宁夏医学杂志 , 19 9 6 , (4 ) : 19 3
5 李炳生 , 等 . 中草药通讯 , 1 9 7 9 , 10 (9 ) : 2 6
6 杜平主编 . 医学实验病毒学 . 上海 : 上海人 民出版社 ,
1 9 8 2
.
1 2 6
常雅萍 , 等 . 中国中药杂志 , 19 8 9 , 1 4 (4 ) : 2 3 6
(1 9 9 7
一
0 8
一
0 8 收稿 )
欢 迎 投 稿 欢 迎 征 订
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2 5 4
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