全 文 ：·药材·
发根农杆菌Ri T-DNA对墨旱莲的遗传转化
张汉明1,许铁峰1, 丁如贤1, 李博华2
a
( 1. 第二军医大学药学院 生药学教研室, 上海　200433; 　2. 第二军医大学肿瘤国际合作研究所, 上海　200433)
摘　要: 目的　建立墨旱莲 E clip ta p r ostr ata 的毛状根离体培养系统。方法　分别用发根农杆菌 A4, R1601,
ATCC15834 3 种菌株感染墨旱莲的子叶外植体,获得毛状根,并筛选了优质株系; 测定了毛状根的生长曲线; 利用
高压纸电泳法对毛状根进行T -DNA 转化的检测。结果　首次利用发根农杆菌 A4, R1601, AT CC15834 3 种菌株成
功地从墨旱莲中诱导出毛状根; 经高压纸电泳检测,墨旱莲毛状根中含有甘露碱,表明 Ri质粒的 T-DNA 已整合进
毛状根中。结论　墨旱莲毛状根离体培养的建立为进一步进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。
关键词: 发根农杆菌;毛状根; 墨草莲
中图分类号: R282. 12　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 10 0924 03
Genetic transformation of Eclipta prostrata by Ri T-DNA
ZHANG Han-ming 1, XU T ie-feng 1, DING Ru-x ian1, L I Bo-hua2
　　( 1. Depar tment of Pharmacognosy , School of Pharmacy , Second M ilit ary Medica l Univ ersit y, Shanghai 200433, China ;
2. Internat ional Joint Cancer Institute, Second M ilitar y Medica l Univ ersity, Shanghai 200433, China)
Abstract: Object　T o establish the culture system of hair y r oot o f Ecl ip ta p rostrata ( L . ) L . . Meth-
ods　Hairy ro ot o f E. p rostr ata was obtained from infected cotyledon explants af ter infect ion w ith A -
grobacterium rhiz ogenes st rains A4, R1601 and ATCC15834, elite st rains w ere screened and g row th cur ves
determined. T he t ransformat ion o f Ri T -DNA was examined through high vol tag e paper elect rophoresis.
Results　T he hairy root w as originally obtained from E . p rost rata. T he result of high voltage paper
elct rophoresis confirmed the tr ansformation of T-DNA from Ri plasm id to the hairy root . Conclusion 　
The acquisition of hairy ro ot of E . p rost rata provided fur ther a foundat ion fo r the industr ial pr oduct ion of
act ive drug component .
Key words : A grobacterium rhiz ogenes; hairy roots; E clip ta p rostr ata ( L . ) L .
　　自从发根农杆菌 Ri质粒被人们发现和认识以
来,它在许多领域都显示出极其广泛的应用前景,首
先利用发根农杆菌转化药用植物产生的毛状根建立
离体培养系统,实现次生代谢物质的工业化生产以
解决中药资源的短缺问题越来越受到人们的重视。
相对于常规细胞培养, 毛状根培养系统具有生长快
速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而
且稳定及向培养液释放部分代谢产物等优点[ 1]。另
外, Ri质粒还是植物基因工程理想的载体, 以 Ri质
粒为载体可将抗虫、抗病基因或其它我们感兴趣的
基因转移到植物基因组并得到表达,从而达到改良
植物性状、提高品质的目的。
墨旱莲即菊科鳢肠属植物鳢肠E clip ta p r ostra-
ta ( L . ) L . , 为常用中药,以全草入药,是二至丸、参
鹿补膏、凉血安神片等中成药的原料之一[ 2]。该植物
始载于《唐本草》, 具滋肝补血、凉血止血之功效, 是
1995年版药典品种。墨旱莲主要化学成分有黄酮、
三萜皂苷、噻吩类化合物、香豆草醚类化合物等, 药
理研究表明具有止血、保肝、免疫调节和抗炎、抗诱
变、抗蛇毒作用及对心血管系统的作用,在中医临床
上为凉血、止血要药, 用于牙齿松动、须发早白、吐
血、衄血、尿血、便血、血痢、外伤出血等病症的治
疗[ 3]。
我们利用发根农杆菌 Ri质粒首次成功地从墨
旱莲 E. p r ostrata 中诱导出毛状根,筛选出了各自
的生长快速的优质株系, 建立了毛状根离体培养系
统, 为利用毛状根进行次生代谢物质的生产打下了
基础。
1　材料和方法
1. 1　发根农杆菌的活化: 将 3种发根农杆菌菌株
·924· 中草药　Chinese T raditiona l and Herbal D rugs　2001 年第 32 卷第 10期
a 收稿日期: 2000-12-13作者简介:张汉明,男, 1967年毕业于上海医科大学药学院,现为第二军医大学药学院生药学教研室教授,博士生导师。
A4, R1601, ATCC15834于- 20 ℃保存在灭菌甘
油中, 临用前于 YEB 固体培养基、25 ℃活化 3 次,
然后转至 YEB培养液( R1601的培养液中加入 200
mg / L 卡那霉素)于黑暗、25 ℃、100 r / min 振荡培
养, 12 h后用于感染外植体 [ 4]。
1. 2　实验材料: 墨旱莲种子采自南京紫金山,用清
水洗净后,在 75%乙醇中浸泡 1 min,用清水冲净乙
醇, 再用 0. 1% HgCl2 消毒 10 min, 无菌水冲洗 5
次,置于 MS培养基上, 5 d后萌发。取生长3 d 左右
的无菌苗的子叶作为外植体。
1. 3　外植体的转化:将上述外植体于 MS 培养基上
预培养 24 h 分别浸入处于对数生长期的发根农杆
菌 A4, R1601, AT CC15834菌液中,在黑暗条件下
120 r / min振摇 10 min,取出, 用无菌滤纸吸干多余
的菌液, 置于 MS 培养基上共培养 24 h 后移至含
300 mg / L 头孢噻肟钠的 MS固体培养基上培养, 25
℃,光照 12 h/ d, 光强度 2 000 lx, 并以未经感染的
子叶作对照。
1. 4　毛状根的除菌:将感染后长出的毛状根剪下移
到新的含 300 mg / L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基
上培养,每 5天转接 1次, 转接 3次以后, 将培养瓶
放入 39. 5 ℃的恒温箱中除菌, 48 h 后取出移到不
含抗生素的 MS培养基上。
1. 5　毛状根优质株系的筛选:将 MS 培养基上的毛
状根逐一分开,挑取 2 cm 左右者移入 1/ 2 M S 培养
液中, 35 mL 培养液/ 50 mL 三角锥瓶,每瓶一根, 20
d后观察生长情况,挑选生长迅速的进行继代培养。
1. 6　毛状根生长曲线的测定:取毛状根的优质株系
在 1/ 2 MS 培养液中进行测定, 35 mL 培养液/ 50
mL 三角锥瓶, 共 30瓶, 每 4 天测 1次鲜质量与干
质量,每次测 3瓶,以平均质量为指标绘制生长曲
线。鲜质量系用布氏漏斗抽滤至无水滴下时测得,干
质量系 60 ℃烘 12 h 后测得。
1. 7　甘露碱的检测: 取墨旱莲毛状根 100 mg, 按
Morgan 等[ 5]的方法进行高压纸电泳分析, 以试管苗
的正常根为阴性对照, 甘露碱标准品( 1 mg / mL )为
阳性对照。
2　结　果
2. 1　毛状根的获得:经发根农杆菌感染, 墨旱莲子
叶 10 d 后有根长出, 大多数具有典型的毛状根特
征:具大量根毛,分支多,向上、贴瓶壁向上或沿培养
基水平生长, 失去向地性。与一般毛状根不同的是墨
旱莲毛状根为绿色(图 1-A )。对照组子叶出根率低
且向下长入培养基中。20 d后统计出根率, 结果见
表 1,可见 R1601菌株诱导率较其它两种菌株高。
表 1　3 种发根农杆菌对墨旱莲子叶外植体感染的诱导率
发根农杆菌 外植体数 生根的外植体数 诱导率( % )
A4 30 5 16. 7
R1601 30 7 23. 3
AT CC15834 30 4 13. 3
对照 30 2 7. 0
2. 2　毛状根快速生长的优质株系的筛选: 在 1/ 2
M S 培养液中培养 20 d后,观察各瓶中毛状根生长
状况,选出分枝多、生长快速的毛状根的优质株系:
ER6株, 来源于 1601菌株。
2. 3　毛状根生长速率测定: 结果见表 2, 表明墨旱
莲毛状根的质量随时间的延长而快速增加, 18 d 时
达到最大质量, 增长 52. 5倍, 以后逐步下降。
表 2　墨旱莲毛状根生长速率测定
培养时间( d) 鲜重( g) 干重( g) 　　增长倍数
0 0. 41±0. 012 0. 036±0. 003 7 - 　
3 0. 56±0. 02 0. 046±0. 006 5 1. 28
6 1. 02±0. 07 0. 086±0. 013 2. 39
9 1. 84±0. 09 0. 172±0. 024 4. 78
12 4. 38±0. 17 0. 388±0. 022 10. 56
15 11. 35±0. 48 1. 039±0. 050 28. 89
18 22. 51±0. 74 1. 892±0. 046 52. 50
21 21. 50±0. 80 1. 868±0. 074 51. 94
24 21. 50±0. 49 1. 861±0. 042 51. 67
2. 4　毛状根中甘露碱的检测:高压纸电泳检测结果
表明墨旱莲毛状根中含有甘露碱,说明毛状根中确
已含有农杆菌 Ri质粒转入的 T -DNA。对照正常根
的高压纸电泳图谱无甘露碱斑点。
3　讨　论
发根农杆菌感染植物的方法通常有 3种 [ 1] : 即
外植体共培养接种法、原生质体共培养转化法和活
体接种法。其中外植体共培养接种法应用最广,如常
振战转化掌叶大黄[ 6]、费厚满转化绞股蓝[ 7]、刘伟华
转化黄瓜[ 8]都采用此法。本实验以子叶为外植体, 采
用外植体共培养接种法首次成功地在墨旱莲上诱导
出了毛状根,诱导率较高,毛状根生长良好。
农杆菌诱导获得的毛状根中共生有大量农杆
菌,必须除去农杆菌以使毛状根大量、快速生长。本
文采用抗生素除菌和温度法相结合,除菌效果较好,
即将共生有农杆菌的毛状根在含 300 mg/ L 头孢噻
肟钠的 MS 培养基上经过 3次继代培养,农杆菌的
生长受到了抑制,而毛状根的生长状态较为良好, 这
时将培养瓶放入39. 5℃的恒温箱中除菌 48 h,这种
方法简单有效, 对毛状根的生长影响不大。
由于一条毛状根起源于一个细胞, 所以我们把
获得的毛状根逐一分开, 进行单克隆培养,这样的培
·925·中草药　Chinese T raditiona l and Herbal D rugs　2001 年第 32 卷第 10期
养物性能稳定,有利于提供稳定的次生代谢产物。
由墨旱莲获得的毛状根为绿色,该毛状根在 12
h/ d 光照,光照强度 2 000 lx 条件下较黑暗中生长
迅速,光照下第 18天时重量增加 52倍,而黑暗条件
下仅增重 34倍, 并且颜色也不相同,光照下生长的
呈黑绿色(图 1-A ) ,在黑暗条件下生长的为淡绿色
(图 2-B)。据报道,毛花洋地黄及鬼针草属、万寿菊
属的植物诱导出的毛状根在光下培养变成绿色毛状
根,其次生代谢产物的合成能力显著增加 [ 9, 10] , 其机
制尚不清楚。墨旱莲的次生代谢产物合成能力如何
A-光照条件下　B-黑暗条件下
图 1　墨旱莲毛状根
也需要进一步的研究。
致谢:墨旱莲种子经我室郑汉臣教授鉴定,谨此
致谢。
参考文献:
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by enzym e-l inked immun osorben t as say [ J ] . J Nat Prod,
1990, 53( 6) : 1498-1506.
当归药材道地性的 RAPD分析
高文远1,秦恩强2,肖小河2* ,余惠 2, 高光跃1, 陈四保1, 赵扬景1 ,杨世林1
a
( 1. 中国医学科学院 药用植物研究所,北京　100094; 　2. 中国人民解放军 302 医院, 北京　100039)
摘　要: 目的　从 DNA 分子水平上探讨当归药材道地性的生物学基础。方法　对来自不同产地的18 个当归样品,
提取其基因组 DNA, 并进行 RAPD 分析。对筛选出的 10 个引物的 RAPD 结果进行聚类分析, 得出 18 个当归样品
的聚合树状图。结果　显示地理分布距离越小, 当归的遗传差异越小;反之,越大。但生态环境特别是小生境对当归
遗传差异的作用亦不可忽视。结论　为我们从分子生物学角度研究当归药材道地性提供了新的启示。
关键词: 当归;道地性; RAPD
中图分类号: R282. 7　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 10 0926 04
Analysis on Genuineness of Angelica sinensis by RAPD
GAO Wen-yuan1, Q IN En-qiang2, XIAO X iao-he2, YU Hui-ming2, GAO Guang-yao 1, CHEN Si-bao 1,
ZHAO Yang-jing 1, YANG Shi-lin1
　　( 1. Institut e o f Medicinal P lant Development , Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100094, China; 2. Hospi-
tal 302 of PLA , Beijing 100039, China)
Abstract: Object　T o invest igate the genuineness of A ngelica sinensis ( Oliv. ) Diels f rom the level of
molecular bio logy . Methods　T he genomic DNAs o f 18 samples of A . sinensis collected fr om dif ferent lo-
calit ies w ere isolated and analy sed by RAPD. Based on the cluster analy sis of their RAPD strips, the
molecular phy logenet ic t ree of 18 A . sinensis samples w as descr ibed. Results 　The r usults indicated that
the smaller the geographic distance betw een tw o A . sinensis samples, the smaller their g enetic differ ence;
w hile the genet ic dif ference became greater as their g eographic distance increases. How ever it should not
·926· 中草药　Chinese T raditiona l and Herbal D rugs　2001 年第 32 卷第 10期
a 收稿日期: 2001-05-09基金项目:国家自然科学基金重点项目(编号 39730500)
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