全 文 ：·药理实验与临床观察·
中药脑脊液药理学研究方法的初建△
——对中药影响星形胶质细胞神经营养作用的观察
天津中医学院中医工程研究所 ( 300193)　　梅建勋 　张伯礼
天津医科大学　　　　　　　　　　　　　陆　融
摘　要　目的: 探求一种合理有效的中药作用于中枢神经系统药效研究的方法。 方法: 利用体外细胞培养的方法 ,
以 3种不同浓度观察血清、中药血清、脑脊液、中药脑脊液对于星形胶质细胞和神经元的影响。结果:苔盼蓝染色和
LDH检测证明正常血清和中药血清在 3种浓度均出现对细胞的毒害作用 ,尤以 100, 200μL为重 ,且在同一浓度
时 ,两组之间没有明显的差异。而正常脑脊液组和中药脑脊液组与空白对照组相比 ,未见明显差异 , M T T检测证明
中药脑脊液组吸光度 ( A)明显高于其余各组。 结论: 利用脑脊液进行中药对中枢神经系统的药效观察明显优于血
清 ,提出“脑脊液药理学”的概念 ;中药可诱导星形胶质细胞产生神经营养作用。
关键词　脑脊液药理学　神经元　星形胶质细胞　神经营养因子
A Preliminary Attempt to Develope the New“ Cerebrospinal Fluid Pharmacology of
Chinese Materia Medica on Neurotrophic Effects of Astrocytes
　　 Tianjin Colleg e o f T raditional Chinese Medicine ( Tianjin 300193)　 M ei Jianxun and Zhang Bo li
　　 Tianjin Univ ersity o f Medica l Sciences　 Lu Rong
Abstract　　 To explo re an ef fectiv e method by which the pha rmacolo gical effects of Chinese ma teria
medica ( CMM ) of the central nerv ous system ( CN S) could be co rrect ly investiga ted. Cerebro spinal f luid
( CSF) and serum were taken 1～ 1. 5 h af ter administration of CMM and added into the ast rocyte cell
cult rue medium. Af ter 48 h, the incubated medium was t ransfer red in propor tion to the neuron cul ture
medium. Typan blue stainning , LDH and MT T test w ere performed to observ e the drug ef fect on the rate
o f neuron surv ival. The serum , but no t the CSF, showed certain deg ree o f cytotoxici ty on the ast rocy te.
M T T test on the neuron surviv al show ed that the A492 nm value o f the CMM group w as high er than tha t of
the other g roups. The ast rocyte medium stimulated by the CSF containing CMM could promote the neuron
axon g row th. Since CSF is bet ter than serum to evaluate the CMM effects on CN S in vi tro, it w as deemed
that the “ Cerebrospinal Fluid pha rmacolo gy of Chinese Ma teria M edica” i s wo rth fo r further study.
Furthermo re, the CMM could induce the neurot rophic ef fects of ast ro cy tes.
Key words　　 cerebrospinal f luid pha rmacolo gy　 neuron　 ast rocy te　 neurot rophic factor
　　自日本学者田代真一等首次提出“血清药理学”
和“血清药化学”的概念以来 ,人们对于中药的评价
系统在观念上产生了更新 ,尽管仍存在很多争议 ,但
应用此种方法对中药进行药理特别是药效研究仍倍
受关注 [1, 2 ]。在中枢神经系统 ,由于血脑屏障的存在 ,
使得神经胶质细胞和神经元的微观生存环境和屏障
以外的其它体细胞有很大差别 ,这促使我们思考 ,
“血清药理学”的方法在中枢神经系统是否也同样适
用?为此 ,我们利用星形胶质细胞和神经元体外培养
的方法 ,观察了血清、中药血清、脑脊液、中药脑脊液
对于星形胶质细胞和神经元的影响。
1　材料与方法
1. 1　星形胶质细胞的体外培养 [3 ]: 出生后 2 d内
Wistar大鼠 (天津药物研究院提供 ) ,无菌条件下断
头处死 ,取脑 ,投入 D-Hank′s平衡盐溶液中 ,去除
中脑、脑脊膜及大血管 ,皮层剪碎成 1～ 2 mm3小
块 ,吸管吹打 1 min, 0. 25%胰蛋白酶 ( t rypsin,
Sigma, D-Hank′s液配成 )消化 10 min, 1 500 r /min
离心 10 min,收集沉淀 , DMEM重悬 , 75μm筛网
过筛 ,滤液 1 500 r /min离心 10 min,收集沉淀 ,以
·523·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 7期
Address: Mei Jianxun , Tianjin College of Tradi ti onal Chines e Medicin e, Tian jin△国家“九· 五”科技攻关项目 ( 96-906-0903)资助
培养液重悬 ,调整细胞至 1. 5× 106个 /毫升 ,接种于
75 cm
2培养瓶 ( Falcon) , 5% CO2、 95%空气 , 37℃ ,
饱和湿度。培养液组成: DMEM ( Gibco ) ,添加 10%
胎 牛血 清 ( Hyclone )、 4 mmo l /L L-谷 氨酰 胺
( Sigma )、 10万 U青霉素、 10万 U链霉素、 15
mmol /L HEPES( Sigma)。 4 h后换液 ,弃掉非贴壁
细胞。 5 d后将培养瓶置于水平摇床 , 160 r /min, 2
h, 37℃ ,换液弃除小胶质细胞 ,恢复 1 h后 ,重新置
于水平摇床 , 160 r /min, 18 h, 37℃ ,换液弃除少突
胶质细胞。免疫组织化学染色证明星形胶质细胞纯
度大于 95% 。 2 d后以胰蛋白酶 ( 0. 1% , 8 min)消
化 ,传代培养。细胞长至近 80%融合时用于实验。
1. 2　脑皮层神经元的原代培养 [4 ]: 无菌条件下 ,取
16 d龄 Wistar大鼠胚胎脑 ,置于含 7. 5 mmol /L葡
萄糖 ( Sigma )的 DMEM中 ,解剖显微镜下 ,去除嗅
球、脑脊膜、海马和基底核 ,将皮质剪碎成 1 mm3小
块 ,吸除 DM EM , 0. 2% 胰蛋白酶 /0. 02% EDT A
消化 1 min, 10% FCS终止消化 , 1 000 r /min离心
10 min,用培养液重悬沉淀 , 75μm筛网过筛 ,调整
细胞密度至 1. 0× 106个 /毫升 ,接种于预先涂有
0. 005% 多聚赖氨酸 ( ploy-L-lysine, Sigma )的培养
板中 , 5% CO2、 95%空气 , 37℃ ,饱和湿度。培养液组
成: DMEM,添加 15% FCS( Hyclone)、 4 mmol /L L-
谷氨酰胺、 10万 U青霉素、 10万 U链霉素、 15
mmol /L HEPES。 30 min后换液 ,弃掉非贴壁细胞。
2 d 后培养液中添加 2× 10- 5 mol /L 阿糖胞苷
( Arac, Sigma ) ,以抑制胶质细胞生长。以后每 3天
换液一半。经神经元特异性烯醇化酶 ( N SE)免疫组
织化学染色鉴定 ,神经元纯度大于 90% 。
1. 3　血清及中药血清的收集: 4 kg重大耳白家兔
(天津药物研究院 ) ,适应性喂养 3 d后 , ig中药水煎
剂 ( 1. 4 g生药 /kg体重 ,主要成分为人参、丹参、麦
冬、黄连等 ,制备成 1. 12 g生药 /mL) , 1 h后 ,中药
血清组与空白血清组同时处理: 清醒状态下 ,于无菌
条件心内采血每只 30 mL, 4 000 r /min离心 15
min,收集血清 , 56℃、 30 min补体灭活后 , - 80℃
冻存备用。
1. 4　脑脊液及中药脑脊液的收集: 灌服中药 (步骤
同 1. 3) 1 h后 ,耳缘动脉注入空气处死 ,然后在无
菌条件下 ,于小脑延髓池穿刺每只采集脑脊液
600～ 800μL, - 80℃冻存备用。
1. 5　对星形胶质细胞生存能力的影响: 24孔培养
板接种星形胶质细胞 ,空白血清组、中药血清组、空
白脑脊液组和中药脑脊液组又分成 3个浓度组 ,每
组 8孔 ,每孔分别加入正常血清、中药血清、正常脑
脊液和中药脑脊液 50, 100, 200μL,最后补加
DMEM /F12( Gibco )至 1 mL, 48 h后 ,①收集培养
液 ,应用 LDH检测试剂盒 ( LDH-L, 99031,北京中
生生物工程高技术公司 )和 Unifast Analy zer
( Italy ) 测定乳酸脱氢酶含量 ;②细胞用 PBS缓冲
液轻洗 2次 ,每孔滴 PBS缓冲液配制的 0. 4% 苔盼
蓝 ( Sigma )溶液 200μL, 3 min左右倒置相差显微
镜 ( Nikon)下观察 ,随机计数 400个相邻细胞中蓝
染 (死亡细胞 )和未蓝染 (存活细胞 )的细胞个数 ,计
算细胞死亡百分比。
1. 6　中药对星形胶质细胞神经营养作用的影响: 75
cm
2培养瓶 ( Costa r)接种星形胶质细胞分别加入正
常血清、中药血清、正常脑脊液和中药脑脊液 4 mL,
补加 DM EM /F12至 20 mL, 48 h后收集培养液 ,
称为正常血清胶质液、中药血清胶质液、正常脑脊液
胶质液和中药脑脊液胶质液。 96 孔酶标板
( Falcon)接种神经元 ,每孔体积 100μL,在第一次
加阿糖胞苷时 ,加入正常胶质培养液和上述 4种液
体各 5, 10, 20μL,最后加培养液补至 1 m L,每个浓
度组各 8孔 ,每次换液时重复上述操作 ,第 10天时 ,
①倒置显微镜下观察摄片 ;② M TT检测: 每孔加入
M TT 溶液 ( Sigma, 5 mg /mL PBS) 10μL,继续孵
育 4 h, 1 000 r /min离心 5 min,弃掉上清 ,每孔加入
DMSO( Sigma ) 100μL,振荡 10 min,使结晶物充分
溶解 ,在酶联免疫检测仪 ( SPECTRA)上测定各孔
之吸光度 ( A492nm )。
2　结果
2. 1　对星形胶质细胞生存能力的影响:正常血清和
中药血清在 3种浓度均出现对细胞的毒害作用 ,尤
以 100, 200μL为重 ,且在同一浓度时 ,两组之间没
有明显的差异。 而正常脑脊液组和中药脑脊液组与
空白对照组相比 ,未见明显差异 ,提示脑脊液和中药
脑脊液对星形胶质细胞没有毒害作用。 苔盼蓝染色
和 LDH检测结果具有比较一致的规律性。 见图 1
和表 1, 2。
2. 2　中药对星形胶质细胞神经营养作用的影响: 体
外培养皮层神经元在第 3天时长出突起并联成网
状 ,第 10天时无论是细胞的数量还是突起的长度或
数量都明显减少 ,而在加入中药胶质液后 ,上述情况
得以明显改善 (图 2)。 MT T的检测结果 (表 3)也支
持上述结论。
3　讨论
实验结果可以得出结论: ①对于星形胶质细胞 ,
·524· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 7期
　 A-星形胶质细胞伸出突起 ;　 B-星形胶质细胞长至融合 ;
C-加入中药脑脊液后 ,细胞未见明显变化 ;　 D-加入正常
血清 ( 200μL)后 ,死亡细胞 (蓝染 )明显增多
图 1　中药脑脊液和正常血清对星型胶质细胞的影响
表 1　各组星形胶质细胞死亡率 (% )
组别 剂量 (μL) 例数 死亡率 ( x± s )
空白对照 - 8 0. 2± 0. 2
正常血清 50 8 3. 9± 0. 7*
100 8 15. 0± 1. 3*
200 8 16. 0± 1. 4*
中药血清 50 8 3. 4± 0. 7*
100 8 15. 2± 1. 1*
200 8 16. 2± 1. 6*
正常脑脊液 50 8 0. 2± 0. 2
100 8 0. 3± 0. 3
200 8 0. 3± 0. 3
中药脑脊液 50 8 0. 3± 0. 2
100 8 0. 3± 0. 4
200 8 0. 3± 0. 3
　　与空白对照组比较: * P < 0. 05
表 2　各组 LDH含量 (U)之比较
组别 剂量 (μL) 例数 LDH( x± s)
空白对照 - 8 10± 3. 7
正常血清 50 8 31. 63± 4. 41*
100 8 135. 50± 11. 50*
200 8 151. 00± 11. 95*
中药血清 50 8 34. 00± 3. 07*
100 8 133. 75± 12. 44*
200 8 152. 75± 8. 20*
正常脑脊液 50 8 12. 00± 6. 05
100 8 12. 00± 6. 05
200 8 12. 00± 6. 05
中药脑脊液 50 8 11. 00± 5. 95
100 8 10. 00± 3. 70
200 8 12. 00± 6. 04
　　与空白对照组比较: * P < 0. 05
A-第 3天时神经元长出突起 ;　 B-神经元联结成网状 ;
C-第 10天时 ,加中药胶质液组 ,神经元生长旺盛 ;
D-第 10天时空白对照组神经元数量和突起数量减少
图 2　中药对神经元生长的影响
表 3　各组吸光度 (A492nm)值比较 (x± s)
　　组　别 例数 不同浓度 A492nm
50μL　 100μL　 200μL　
空白对照组 8 0. 28± 0. 16 0. 35± 0. 03 0. 43± 0. 03
正常血清组 8 0. 20± 0. 05* 0. 22± 0. 02* 0. 19± 0. 03*
中药血清组 8 0. 20± 0. 62* 0. 20± 0. 04* 0. 21± 0. 02*
正常血清组 8 0. 30± 0. 39 0. 37± 0. 03 0. 46± 0. 04
中药脑脊液组 8 0. 36± 0. 19* 0. 62± 0. 02* 0. 87± 0. 03*
　　　　与空白对照组比较: * P < 0. 05
血清与脑脊液相比 ,出现明显的毒害作用 ;②对于这
种毒害 ,正常血清与中药血清之间没有明显的差别 ;
③中药脑脊液相对于中药血清 ,可明显诱导出星形
胶质细胞的神经营养作用。 对于血脑屏障以内的细
胞诸如胶质细胞和神经元 ,如果采用血清药理学的
实验方法 ,那么血清本身的毒害作用将遮盖药效作
用 ,严重影响实验结果的可靠性。 而如果采用脑脊
液 ,则可以避免上述缺陷 ,同时由于脑脊液中真正含
有通透血脑屏障的成分 ,增加了实验结果的可信度。
按照“血清药理学”的称谓 ,我们称这种方法为“脑脊
液药理学”。
对于中风 ,现在认为在有效的时间窗内 ,半暗带
神经元可以得到保护 ,在凋亡的发生机制中 ,神经营
养因子的作用是不容忽视的环节 ,在临床治疗中 ,神
经营养因子脑室注射和转基因技术由于操作复杂和
价格昂贵在目前仍没有被广泛采用 ,作为神经元“伙
伴”的胶质细胞 ,其营养作用在体外实验中已被证明
可被某些因素诱导 [5, 6 ]。本实验证明 ,中药同样可诱
导星形胶质细胞的神经营养作用 ,这为中风后神经
元的保护治疗提示了一种思路 ,同时由于其易于操
作 ,因此将具有良好的应用前景。
参 考 文 献
·525·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 7期
1　贺玉琢 . 国外医学 -中医中药分册 , 1999, 20( 5): 3
2　张志军 . 国外医学 -中医中药分册 , 1999, 20( 4): 11
3　 Aleksandra P G, Donald B, Etsuro U. Brain Res, 1997, 754: 65
4　 Jean-Ch ri stophe C, Yibing L, Li ta R, et al . Brain Res , 1998,
784: 25
5　 Irina S, Phi lipp W , Mat thias S, et al . Eur J Pharmacol , 1996,
315: 19
6　 Yasuhi ro A, Ri ts uko K S, Chika N. Brain Res , 1998, 809: 115
( 1999-09-16收稿 )
荷叶大豆及其合剂调脂活性部位的研究
中国医学科学院　
中国协和医科大学 药用植物研究所 (北京 100094)　　杜力军 　孙　虹　李　敏　金　文　徐丽珍
摘　要　目的: 通过体内外实验探讨荷叶大豆调脂的活性部位及其作用特点。方法: 以急性高脂血症小鼠为整体模
型观察药物对血清胆固醇及甘油三酯的影响。体外给药观察药物对肝细胞合成胆固醇的影响。结果:荷叶大豆的水
提取部分及其生物碱和黄酮均有调脂作用。大豆黄酮对体外肝细胞合成胆固醇有抑制的趋势。结论:荷叶和大豆均
有调脂作用 ,其主要活性部位在黄酮和生物碱 ,其作用特点在于促进胆固醇的代谢方面。
关键词　荷叶　大豆　调血脂
Studies on the Active Components in the Leaf of Nelumbo nucifera and Black Soybean
and Their Mixture with Blood Lipid Regulating Effect
　　 Institute o f Medicina l Plant Developments, Chinese Academ y of Medical Sciences and Peking Union Medica l Colleg e
( Beijing 100094)　 Du Lijun, Sun Hong, Li M in, Jin Wen and Xu Lizhen
Abstract　　 To study the effect of the leaf o f Nelumbo necif era Gaer tn. and black soybean (Glycine soja Sieb. et Zucc. )
on blo od lipid lev el, in orde r to identify th e activ e Components of the tw o herbs by experiments in vivo and in v itro. By
determining the change of serum , cholestero l ( TC) and triglyce ride ( TG) o f acute h yperlipemic mouse model after drug
administr ation. By culturing liv er cells with the test drugs to assess the effect on TC synth esis. The aqueous ex t racts of bo th
test drug s and their alkaloid and flav onoid contents could lowe r serum TC and TG levels o f hype rlipemic mice and inhibit the
synthesis o f TC by live r cells in v itro. Bo th lo tus lea f and soybean could lowe r blood lipid lev els due to their w ate r so lublc
activ e Component o f flav onoids and a lkaloids.
key words　　 th e leaf o f Nelumbo necif era Gaer tn.　 black soybean　 blood lipid
　　传统医学认为荷叶具有清暑利湿 ,升发清阳 ,止
血的作用。近年的研究表明 ,荷叶内的黄酮具有调血
脂活性。临床用荷叶水煎剂口服有一定的调脂作
用 [1 ]。大豆古代即有入药的记载 ,且多以黑豆入药。
如李时珍在《本草纲目》中指出: 大豆有黑黄褐青斑
数色 ,黑者名乌豆 ,可入药及充食 ,作豉。 黄者可作
腐 ,榨油 ,造酱。余但可作腐及炒食而已。 又黑大豆
具有“制诸风热 ,活血 ,解诸毒”的作用。
近年来对大豆的研究逐渐增多 ,如从大豆皂苷 ,
大豆磷脂和大豆异黄酮等就抗肿瘤、抗炎、心肌动作
电位等方面进行了探讨。但对于其调脂作用的临床
及实验研究则较少报道。二药配伍其调脂作用及其
活性部位的分布更未见报道。故对此进行研究 ,对于
阐明二药及其配伍的调脂作用及其可能的物质基础
都具有重要的理论意义。
1　材料
1. 1　药物: 大豆、荷叶及其配伍水提取物由徐州百
谷神生物工程有限公司提供。 其中生物碱和黄酮部
分由本所植物化学研究室制备。
1. 2　实验动物: KM小鼠 ,购自中国医学科学院实
验动物所 ,合格证号: ( 96) 01-3001,体重 ( 31. 84±
6. 99) g、 ( 21. 49± 0. 44) g。
1. 3　试剂与测试仪器:总胆固醇 ( TC)和甘油三酯
( TG)试剂盒购自北京中生生物工程高技术公司 ,批
号分别为: 990101, 990211,按试剂盒要求进行测试。
以 ZX-1A型半自动生化分析仪测试 (北京中生生物
工程高技术公司生产 )。
2　方法
·526· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 7期
Address: Du Li jun, Ins ti tute of Medicinal Plan t Dev elopm ent , Chines e Acad emy of M edical Sciences and Peking Union Medical College,
Beijing杜力军　男 ,教授 , 1990年毕业于成都中医药大学药学院 ,获医学博士学位。 1992年军事医学科学院毒物药物研究所访问研究。现任中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所药理二室主任。研究方向:心脑血管药理。近五年来先后负责和承担国家及院课题 9项。获国家中医药科技进步奖 1项。 在国内外杂志上发表论文 30余篇。