全 文 ：册 . 北京:人民卫生出版社 , 1994.
[2 ]　许腊英 ,毛维伦 ,江向东 ,等 .荷叶降血脂的开发研究 [ J] .湖北
中医杂志 , 1996, 4: 42-43.
[3 ]　龚康敏 ,魏克民 ,厉兰娜 ,等 .荷叶饮对高脂血大鼠血脂及血流
变学的影响 [ J ].河南中医 , 1999, 19(2) : 28-29.
[4 ]　肖华山 ,黄代青 ,傅文庆 ,等 .荷叶对体外氧自由基的清除作用
及其对果蝇寿命的影响 [ J ].中国中药杂志 , 1997, 22( 6): 374-
378.
[5 ]　胡天喜 ,陈季武 ,许建营 ,等 . 云芝糖肽和灵芝多糖清除活性氧
的作用 [ J] .生物化学与生物物理学报 , 1992, 24( 5): 465-470.
[6 ]　杜力军 ,孙　虹 ,李　敏 ,等 . 荷叶大豆及其合剂调脂活性部位
的研究 [ J] .中草药 , 2000, 31( 7): 526-528.
何首乌毛状根培养及大黄酚的含量测定
王振华 ,杜　勤 ,刘　浩 ,许晓峰 ,张俊荣 ,简慧兰* ,李　莉* ,曾绍培⒇
(广州中医药大学 中药学院 ,广东 广州　 510407)
摘　要:目的　测定何首乌毛状根中大黄酚的含量。方法　用发根农杆菌 Ri 15834菌株感染何首乌茎、叶外植体 ,
均可诱导出毛状根 ,并能合成大黄酚 ,采用薄层扫描法测定毛状根中大黄酚。 结果　毛状根中大黄酚的含量为
0. 0164%。 结论　该毛状根具有典型的毛状根形态特征 ,大黄酚含量低于何首乌药材。
关键词: 何首乌 ;毛状根 ;大黄酚
中图分类号: R927. 2　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 08 0695 02
Culturing of hairy root of Polygonum multiforum and
determination of its chrysophanol content
W ANG Zhen-hua, DU Qin, L IU Hao , XU X iao-feng , ZHANG Jun-rong ,
JIAN Hui-lan, LI Li, ZENG Shao-pei
　　 ( Co lleg e o f Chinese Materia Medica, Guang zh ou Univ ersity of TCM , Guang zhou Guangdong 510407, China)
Abstract: Object　 To determine the content of ch rysophano l in th e cultur ed hair y ro o t o f Polygonim multiforum Thunb.
Methods　 Hair y r oo t of P . multiforum w as induced from stem and leaf explant w ith ag r obacterum rhizogens Ri 15834, and
its chr ysophanol content determined by TLCS. Results　 The t ransferr ed ro ot showed typica l hairy cha racteristics and could
synthesize ch ry sophano l to a content o f 0. 016 4% as determined by T LCS. Conclusion　 Content of chr ysophanol in the cul-
tured hair y r oo t wa s lowe r than that o f the c rude medicinal material.
Key words: Polygonum multiforum Thunb; hairy ro ot; ch ry sophano l
　　何首乌 Polygonum mult if lorum Thunb. 是著
名的常用传统中药 ,药用块根 ,具有补肝肾、益精血、
乌须发、强筋骨等功能。何首乌的化学成分主要有蒽
醌类化合物、卵磷脂以及微量元素等。
毛状根培养是植物细胞培养一种新技术。 毛状
根培养系统具有生长迅速、不需要外源生长激素、产
生次生代谢产物稳定等优点。目前已开展毛状根培
养药用植物 [1, 2 ]。但关于何首乌毛状根及其有效成分
方面的研究未见报道。本研究采用发根农杆菌 Ri
15834菌株感染何首乌茎、叶外植体 ,诱导出毛状
根 ,并对毛状根中大黄酚进行含量测定。
1　材料与方法
1. 1　细菌培养:取发根农杆菌 Ri 15834菌株 ,接种
到 YEB固体培养基中活化 ,然后转移至 YEB液体
培养基中振荡培养 ,使处于指数生长期 ,用于转化何
首乌。
1. 2　外植体制备: 取何首乌茎、叶 ,在 75%乙醇中
浸泡 0. 5 min,再用 0. 1%升汞消毒 15 min。无菌水
冲洗干净后 ,茎切成 1 cm长的小段 ,叶切成 1 cm×
1 cm的小块 ,接种于无激素的 MS0培养基上预培养
48 h后用于转化。
1. 3　毛状根的诱导: 将上述外植体浸入用 MS培
养液稀释 1倍的农杆菌菌液中 10 min,取出 ,吸干
多余液体 ,置 MS0为培养基上培养两天后取出 ,转
入含 500 mg /L羧苄氨基青霉素的 M S培养基中 ,
21℃暗箱培养。
1. 4　毛状根的培养: 将长度超过 3 cm的毛状根转
移到 M S0固体培养基上继代培养 ,以后每 21 d继代
·695·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
⒇ 收稿日期: 2000-09-17基金项目:本研究为广东省中医药管理局课题 B96— 31的一部分研究内容作者简介:王振华 ( 1966-) ,男 ,硕士研究生毕业 ,讲师。 研究方向:中药制剂研究、中药质量、标准制订、中药新资源的开发利用。
* 广州中医大学 98级中药资源专业本科生
1次 ,得到生长迅速的毛状根体系。 收获毛状根 ,阴
干 ,备用。
1. 5　仪器及试剂: CS-9000薄层扫描仪 (日本岛
津 ) ;硅胶 G(薄层层析用 ,青岛海洋化工厂 ) ;其他试
剂均为分析纯。大黄酚对照品由中国药品生物制品
检定所提供。定量毛细管 ( Drummond Scienti tic Co.
U SA) ;何首乌药材购自广东省药材公司饮片厂。
1. 6　何首乌药材及毛状根中大黄酚的含量测定
1. 6. 1　样品及对照品溶液的制备:何首乌毛状根测
试液的制备:称取何首乌毛状根 5. 15 g ,加氯仿 40
m L,回流提取 1 h,共提取 2次 ,合并滤液 ,回收氯
仿 ,用氯仿定容至 10 mL,作为供试液 A。
何首乌药材溶液的制备:将何首乌药材粉碎 ,过
40目筛。 称取药材粉末 10. 00 g,加氯仿 80 mL,回
流提取 1 h,共提取 2次 ,合并滤液 ,回收氯仿 ,用氯
仿定容至 100 mL,作为供试液 B。
对照品溶液的制备: 精密称取大黄酚对照品
2. 3 mg ,用氯仿溶解 ,并定容至 25 mL。
1. 6. 2　薄层色谱条件:薄层板为含 0. 5% CMC-Na
的硅胶 G板 , 105℃活化 30 min。 展开剂石油醚-乙
酸乙酯-冰醋酸 ( 10∶ 2∶ 1. 5) ,展开温度 20℃～ 25
℃ ,实验室相对湿度 75%～ 85% ,上行展开 10 cm ,
取出晾干。
扫描条件: 双波长反射法锯齿扫描 ,λs= 435
nm , λR= 510 nm , Sx= 3,狭缝 1. 2 mm× 6 mm。
1. 6. 3　标准曲线绘制:定量吸取 1, 2, 3, 4, 5μL对
照品液 ,点于同一薄层板上 ,按上述薄层色谱条件展
开 ,取出晾干 ,置扫描仪测定峰面积。
1. 6. 4　稳定性试验:测定层析后的大黄酚对照斑点
的峰面积 ,每隔 20 min测定 1次 ,连续测 2 h。
2　结果与讨论
2. 1　毛状根的诱导和培养:发根农杆菌感染何首乌
茎、叶外植体 1星期后 ,外植体茎节处及叶片边缘叶
脉处出现毛状根 ,毛状根分枝多 ,密被白色根毛 ,在
无激素的 MS0固体培养基中能自主生长 ,紧贴培养
基向上生长 ,生长快速 ,具有典型的毛状根特征。
2. 2　何首乌药材及毛状根中大黄酚的含量测定
2. 2. 1　标准曲线绘制: 以峰面积 (X )对点样量 ( Y )
进行回归处理 ,得回归方程 Y= - 0. 52+ 1. 818×
10- 4· X, r= 0. 997,回归曲线不经过原点。 结果表
明点样量在 1～ 5μL(相当于 0. 092～ 0. 46μg)范围
内与峰面积呈良好的线性关系。
稳定性实验结果 , 2 h内峰面积值稳定。
2. 2. 2　含量测定:分别精密吸取供试液 A, B及大
黄酚对照品溶液 ,点于薄层板上 ,按 1. 6. 2项下展
开、扫描 ,重复 3次 ,测定结果何首乌毛状根中大黄
酚含 量 为 0. 0164% , 何 首 乌 药 材 中 含 量 为
0. 0538% 。
在何首乌毛状根中含有与原药材相同的蒽醌类
成分—— 大黄酚 ,其含量低于原药材 ,约为其 1 /
3. 3。这可能与毛状根来源与何首乌茎、叶外植体 ,而
茎、叶中此成分含量原本就比较低的缘故。另外何首
乌毛状根培养时间只有 1个多月 ,而药用何首乌块
根需生长多年 ,因而其大黄酚的含量有所差异。
我们的研究还发现 ,在营养充足的条件下适时
延长毛状根培养时间 ,在毛状根某些部位上能产生
膨大 ,其表皮颜色明显加深 ,与何首乌块根的形状非
常相似 ,这种现象在以往毛状根研究中末见有类似
的报道 ,其内部结构、化学成分尚待研究。因此适时
延长毛状根的培养时间 ,进一步优化培养条件 ,定向
培养毛状根的再生块根 ,毛状根中大黄酚的含量可
望有所增加。
参考文献:
[1 ]　张荫麟 ,宋经元 ,吕桂兰 ,等 . 丹参毛状根培养的建立和丹参酮
的产生 [ J] .中国中药杂志 , 1995, 20( 5): 269-270.
[2 ]　郑志仁 ,刘　涤 ,宋纯清 ,等 . 黄芪毛状根化学成分和免疫功能
活性的研究 [ J] .生物工程学报 , 1998, 14( 2): 153.
邮　购　信　息
①本草纲目 (上、下 ) , 230元　　②白话全译本草纲目 (吕兰蕙编译 ) 4卷 , 498元　　③本草纲目药物彩色图谱 (谢宗万 ) ,
298元　　④白话通解黄帝内经 (主编张登本 ) , 5卷 , 248元　　⑤现代实用中药新剂型新技术 (主编董万言 ) , 61元　　⑥中
成药临床新用 (主编梅全喜 ) , 63元　　⑦中药临床新用 (主编王辉武 ) , 65元　　⑧现代中药药理学 (主编王本祥 ) , 160元
⑨中成药名方药理与临床 (主编陈奇 ) , 110元　　10新编中成药手册 (二版 ) (陈馥馨等编 ) , 180元　　1中药药效与临床 (丁
兆梦编 ) , 78元　　12汉英双解中医大辞典 (原一祥等编 ) , 141元　　13中药学 (英文版 ) (刘公望等译 ) , 150元　　14中成药
实用手册 (三版 ) (俞长芳主编 ) , 101元　　15中国食养食疗大全 (张有 等编 ) , 90元　　16中国保健食品的进展 (于守洋等主
编 ) , 135元　　17中药大辞典 (上、下、附编三册 ) (江苏新医学院编 ) , 210. 50元　　18中药大辞典 (缩印本 ) (上、下 ) , 113. 70
元　　19常用中草药高效液相色谱分析 (王慕邹主编 ) , 60元
邮购办法: ①按书定价汇款 ,免邮费。 挂号发书 ,保证安全 ,发票随书寄 ,汇款时注明所购书名。 ②汇款地点: 邮编: 300070
天津市和平区蛇口道同发里底商 11号　金卫医学书店 ,电话: ( 022) 23522444。 ③银行汇款: 户名: 天津市和平区金卫医学书
店 ,开户行:天津市商业银行建业支行　帐号: 065201080054611　　* 本刊 2001年 1～ 6期邮购信息仍有效
·696· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期