全 文 ：· 药理实验与临床观察 ·
根皮素对人 白血病 H L一 6 0细胞 D N A和细胞周期的影响△
苏州 医学院药理学研究室 ( 2 1 5 0 7)肖 东 去 顾振纶
摘 要 以人白血病 H L一 60细胞为实验对象 ,利用 3H 一脱氧胸昔 ( 3H 一工d R )掺人实验 , JAM 实验法
及流式细胞仪观察懈皮素对 H L 一 60 细胞 D N A 和细胞周 期的影响 。 结果显示 ,懈皮素 15 拌m ol / L ~
120 拌m ol / L 可显 著抑制 H L 一 60 细胞的 D N A 合成及诱发 D N A 链断裂 ; 懈皮素主要是阻滞 G l 期向
S 期移行 ,使 G l 期 细胞蓄积 , S 期细胞减少 。 懈皮素的作用呈 明显的剂量依赖关系 。
关键词 懈皮素 D N A 损伤 培养的 H L 一 60 细胞 细胞周期
懈皮 素 ( q u e r e e t i n , Q u e )为 天然 的黄 酮
类化合 物 , 存在 于许多植 物 中 , 具 有抗血 小
板 、 抗氧 自由基及抗缺血 /再灌性心律失常作
用 〔`一 5〕 。 Q u e 对多种癌细胞的生长具有抑制
作用 〔 6一 的 。 意味着 Q u e 可能是一种新的抗癌
剂 。 我们研究 了 Q ue 对人早幼粒白血病细胞
系 ( H L 一 6 0 )细胞 D N A 和细胞周期的影响 , 以
期为 Q u e 用于抗癌治疗提供理论依据 。
1 材料
H L
一
6 0 细胞 由本实验室所有 。 懈皮素为
S i g m a 产品 。 R P M I一 1 6 4 0 培养基为美国 G ib -
co 产品 ,小牛血清为 中国杭州 四季青 生物工
程材料公司产品 。 3H 一脱氧胸昔 ( 37 k B q / L ,
比活性 1 3 . 3 2 k B q /m m o l ) 为 中国科学 院上
海原子核研究所产品 。
2 方法
2
.
1 细胞培养 : 见文献 〔. 。
2
·
2 Q
u e 配制 : 见文献 〔 6〕 。
2
.
3 “ H
一脱氧胸昔 ( “ H 一 T d R ) 参人实验 ; H L -
6 0 细胞 为 I X I O , e e l l s / L ,接种于 1 2 孔板 , 每
孔 Z m L , 分别加人药物或 R PM I一 1 6 4 0 完全
培 养 基 , 37 ` C 培 养 犷 h 后 , 各 组 分 别 加
人 3H 一 T dR 各 3 7 k B q ,继续培养 1 2 h ,按常规
玻璃纤维纸 过滤法制 样 , 烘 干滤膜 , 加闪烁
, 于 B ec km a n 液体闪烁计数仪进行 自动计
,计算掺人抑制率 。
液数
掺人抑制率 (% ) = 对照组 cP m一实验组 cP m对照组即m X 1 0 0%
2
.
4 D N A 链 断裂量 的观察 : 采用 J AM 实
验方法 〔 1。〕检测细胞 D N A 链 断裂程度 , 收获
H L
一
6 0 细胞 I X I O g e e l l s / L , 接种于 2 4 孔板 。
每孔 l m L , 加人 3 7 kB q “ H 一 T d R 后 3 7 ℃培
养 6 h 。 再次收集细胞去除未掺人的 “ H 一 T dR ,
分别 加人药 物或 R P M I一 1 6 4 0 完全培 养基 ,
3 7℃培养 48 h ,按上法收集样品 。 细胞 D N A
链断裂程度按以下公式计算 :
D N A 断裂率 (环 ) = 对照组叩m 一实验组 cP m对照组 印m X 1 0 0%
2
.
5 细胞周期分析 : 按文献 〔川方法 , 在给药
物 4 8 h 后收获细胞 ,用预冷的 P B S 洗涤细胞
2 次 ,在较暗环境下加入碘化丙锭 (S i g m a ) 染
色 ( 4 cC X 3 0 m i n ) 。 用 流式 细胞仪 ( E P I C S
X L
,
C o u l t e r
,
U S A )分析细胞周期 。
2
.
6 统计学方法 : 显著性检验用方差分析 。
3 结果
.3 1 对 H L 一 6 0 细胞 D N A 合成的影响 : 结果
见表 1 。 与对照相比较 , Q u e 1 5 拌m o l / L ~ 1 2 0
拜m ol / L 能明显抑制人 H L 一 60 细胞 D N A 的
合成 , 1 2 0 拼m ol / L 抑制率高达 8 % 。 经统计
A d d r e s s
:
X i a o D o n g
肖 东 男 , 36 岁 , 博
,
S u z h o u M e d i e a l C o lle g e
,
士后 , 副教授 。 在苏州医学
S u z h o u
院获得 医学博士学位 , 现在 中国科学院上海药物研究所肿瘤细胞和分子药理实验室从事博士后研究 。 主要从事心血管药理 、肿瘤药理 和新药 研究开发 。 主持和参与多项课题研究 , 已发表科研论
文 2 。 余篇 , 多次在国际会议上进行学术交流 ,其 中 5 篇论 文被 SCI 收录 。 获得部级科技 进步三 等奖 2 项 。
△香港保健协会资助项 目
.
7 4 8
.
学检验 ,差异非常显著 (尸 < 0 . 0 1 ) 。
表 1 Q u e 对 H L 一 6 0 细胞 D N A 合成的影响` 士 s )
组别 剂量
(“ m o l / L )
C p m
( Z X 10
5 e e ll s )
ó办0,13内匕
对 照
Q u e
4 3 3 6士 3 3 0
3 6 0 6士 1 4 7 .
2 6 9 6士 7 9 节 苍
1 9 2 8士 5 4 份 份
5 2 2士 5 2 “ “
1 6
。
8
3 7
。
8
5 5
。
5
8 8
。
0
, = 10
,与对照组 比较 : 价 尸 < 0 . 05 . 份 尸 < 0 . 01 (下 同 )
3
.
2 对 H L 一 6 0 细胞 D N A 链断裂的影响 : 结
果见表 2 。 Q u e 1 5 拌m o l / L一 1 2 0 拜m o l / L 作
用 4 8 h 能诱发 H L 一 60 细胞 D N A 链断裂 , 与
对照组比较 ,差异非常显著 。
表 2 Q u e 对 H L 一 6 0 细胞 D N A 链
断裂的影响 (牙士 s)
组别 剂量
(拜m o l / L )
C p l l l
( I X 1 0 6e e ll s )
D N A 断裂
(写 )
对照
Q u e
3 80 4士 3 0 4
3 0 8 5士 9 7 份
1 90 4士 2 0 2 “ .
1 36 0士 8 4 . 份
8 0 6士 6 1 “ 居
3
.
3 对 H L 一 60 细 胞 周 期 的影 响 : Q u e ls
拜m o l / L 一 1 2 0 拜m o l / L 处 理 H L 一 6 0 细 胞 4 8
h
,
G
l 期细胞 从 4 2 . 5%增加 至 5 2 . 3% , S 期
细胞从 50 . 5% 降到 30 . .7 % , G Z / M 期细胞也
有所增加 。 Q ue 主要使 H L 一 60 细胞迫迟在 G ,
期 , 与对照组 比较 ,有显著差异 (表 3 ) 。
表 3 Q ue 对 H L 一 6 0 细胞周期的影响 (万士 s)
药物剂量 细胞周期 (写 )
(拌m o l / L ) G l 5 e Z /M
0 4 2
.
5士 3 . 1 5 0 . 5士 4 . 9 6 . 6士 1 9
1 5 4 8
.
5士 5 . 9 3 9 . 7土 4 . 3 资 普 1 1 . 6士 3 . 0 苦
3 0 5 1
.
5士 3 . 7 苍 “ 3 8 . 5士 2 . 9 苦 苦 1 0 . 0士 2 . 6 书
6 0 5 1
.
1士 2 . 3 苦 苍 3 7 . 2士 3 . 3 母 苍 1 1 . 7士 1 . 0 . 份
1 2 0 5 2
.
3士 3 . 0 份 苍 3 0 . 7士 2 . 5 怜 苦 1 7 . 0土 1 . 2 备 份
4 讨论
在本实验条件下 , 懈皮素能明显抑制人
白血病 H L 一 60 细 胞 D N A 合 成 ,诱 发 D N A
链断裂 ;懈皮 素主要是阻滞 G l 期 向 S 期移
行 ,使 G l 期细胞蓄积 , G Z一M 期细胞增加 。 榭
皮素的作用呈 明显的剂量依赖关系 。
H L
一
60 细胞是人早幼粒 白血病 细胞 , 来
源于人急性早幼粒 白血病患者的外周血 中 ,
《中草药 》 1 9 9 8 年第 29 卷第 n 期
我们既往研究发现榔 皮素 15 拌m ol / L ~ 1 20
拼m ol / L 能明显抑制 H L 一 60 细胞增殖 〔的 。 本
实验采用脱氧腺昔 ( 3H 一 T dR )参人实验 , 发现
檄皮素 15 拌m ol / L 作用 48 h 即能明显抑制
D N A 的合成 ,抑制率达 18 . 9% , 随着剂量增
加 , 抑制率明显增加 , 当 1 2 0 拌m o l / L 时 , 抑制
率高达 8 8 % 。 结果 提示 , 懈皮 素通 过 抑制
D N A 合成而抑制 H L 一 60 细胞的增殖 。
细胞周期的研究长期以来一直是生命科
学领域中的一项重要 内容 。 它有两个重要的
时相转换 : G l一 S 和 G Z 一 M ,分别在它们的转接
点 G : / S 及 G Z / M 上设 有 各 自的 “ 检 查点 ”
( 。 h e e k p o i n t ) , 从而严格控 制关卡 的通行 , 实
现对细胞周期的调控 。 本实验表 明懈皮素处
理的 H L 一 60 细胞 , 主要是阻滞 G l 期 向 S 期
移行 ,使 G 飞 期细胞蓄积 , G Z一 M 期细胞增加 ,
而 S 期细胞明显减少 。 结果与文献 〔 123 懈皮素
对人 白血病 T 细胞的作用基本相符 。
为 了探讨懈皮素抑制 H L 一 60 细胞增殖 、
D N A 合成以及其对细胞周期影响的机制 ,本
实验采 用 JA M 法 探讨懈皮 素作用下 D N A
链是否发生断裂 。 D N A 链断裂早于细胞膜破
裂之前发生 , 因此 J A M 法是一种快速 、 敏感
检测细胞死亡 的方法 。 该方法使用 “ H 一 T d R
标记细胞 ,简便易行 〔 1。〕 。 实验结果显示懈皮
素 1 5 拜m o l / L ~ 1 2 0 拌m o l / L 作 用 4 8 h 能促
使 H L 一 60 细胞 D N A 链断裂 ,随着剂量增加 ,
断 裂 量 明 显 增 加 , 当 懈 皮 素 增 加 到 12 0
拜m ol / L , 断裂率为 78 . 8% 。 D N A 链裂解成小
片段 , 即懈皮素诱导 H L 一 60 细胞凋亡 。 细胞
周期 分析显示榭皮素 首先使 H L 一 60 细胞阻
滞于 G l 期 , 然后进人细胞凋亡 。 我们采用琼
脂糖凝胶 电泳法 、 流式细胞仪检测及 电镜观
察发现懈皮素外理 的 H L 一 60 细胞 出现典型
的凋亡改变 〔6〕 。 从而提示懈皮素能诱导人白
血病 H L 一 60 细胞凋亡 ,这可能是懈皮素抑制
白血病细胞增殖的机制之一 。
参 考 文 献
1 G u z l
, e t a l
.
A e t a P h a r m a e o l s in
,
1 9 9 3 ; 1 4
:
2 6 3
2 G u z l
, e t a l
.
A e t a A e a d M e d s u z h o u
, 1 9 9 1 ; 1 1
:
2 62
.
74 9
.
O公O曰q自880公40IA
ù内bō了15
3 0
6 0
1 2 0
G u21
, e t a l
.
A e t a P h a r m a e o l S in
,
1 9 9 4 ; 1 5
:
4 1 4
X i a o D
, e t a l
.
A e t a P h a r m a e o l S in
,
1 9 9 3 ; 1 4
:
5 0 5
X i a o D
, e t a l
.
A e t a P h a r m a e o l S in
,
1 9 9 5 ; 1 6
:
2 2 3
X i a o D
, e t a l
.
A e t a P h a r m a e o l S i n
,
1 9 9 7 ; 1 8
:
2 8 0
cS a m b i a G
, e t a l
.
I n t J C
a n e e r , 1 9 9 4 ; 5 7
:
2 1 1
O s m a n Y
, e t a l
.
E x P H e m a t o l
,
1 9 9 5 ; 2 3
: 4 4 4
9 L a r o e e a L M
, e t a l
.
B l o o d
,
1 9 9 5 ; 8 5
:
3 6 5 4
1 0 M a t z in g e r P
.
J Im m
u n o lo g i e a l M e th o d s
,
1 9 9 1
1 8 5
1 I A v i l a M A
, e t a l
.
C a n e e r R e s
,
1 9 9 4 ; 5 4
:
2 4 24
1 2 Y o s h id a M
, e t a l
.
C a n e e r R e s
,
1 9 9 2 ; 5 2
:
6 6 7 6
·
1 4 5
( 1 9 9 8
一
0 2
一
2 4 收稿 )
E f f e e t s o f Q u e r e e t i n o n D N A a n d C e l l C y e l e o f
H u m a n P r o m y e l o e y t i e L e u k e m i a C e l l s
/
( H L 6 0 )
X i
a o D o n g a n d G u Z h e n lu n ( R e s e a r e h S e e t io n o f P h a r m a e o l o g y
,
S
u z h o u M
e
d i
e a l C o ll e g e
,
S u z h o u
2 1 5 0 0 7 )
A b s t r a e t E f f e e t s 心 f q u e r e e t i n , a f l a v o n o id f o u n d in m a n y p l a n t s , o n D N A a n d e e l l e y e le o f h u m a n
p r o m y e l o e y t i e l e u k e m ia e e ll s (H L 6 o ) w e r e s t u d ie d
.
A
s s a y t o 3 H
一
T d R i
n e o r p o r a t i
o n , JA M t
e s t a n d f lo w e y t o
-
m e t r ie a n a l y s i s w e r e u n d e r t a k e n
.
Q
u e r e e t in
,
1 5一 1 2 0 拌 m o l / L d e e r e a s e d t h e s y n t h e s e s o f D N A , d e g r a d e d
t h
e ir D N A i n t o s m a ll f r a g m e n t s
,
rn a i n l y b l o e k e d t o p r o g r e s s t h r o u g h s
一
p h a s e a n d a r r e s t e d a t G l p h a s e o f H L
-
6 0 e e l l
s i n a e o n e e n t r a t i
o n 一d e p e n d e n t m a n n e r
.
R
e s u
l t
s s u g g e s t e d t h
a t a n t i t u m o r a e t i o n o f q u e r e e t i n m a y b e r e
-
la t e d t o it s i n h ib it io n o f D N A s y n t h e s e s a n d in it i a t io n o f D N A d a m a g e
。
K e y w o r d s q u e r e e t i n D N A d a m a g e H L
一
6 0 e e ll s e u l t u r e d t u m o r e e l l s e e ll s e y e l e
蝎毒与吗啡中枢镇痛作用效果比较
潍坊 医学 院应用药理学实验室 ( 2 6 1 0 4 2)
北京大学生命科学院
李 宁 `
于龙川
吕欣然 韩 惠蓉 朱庆磊 李红军
摘 要 蝎毒及其提取物有 明显的镇痛 作用 , 我们对其 中枢镇痛作用 效果与吗 啡进行 了 比较 。 向
大鼠中脑导 水管周围灰质 ( P A G )内微量注射蝎毒 ( s e o r p i o n v e n o m , S V ) 和 吗啡 (m o r p h i。 。 ) , 以热
辐射甩尾 法为指标 ,观察比较二者中枢镇痛作用效果 。 结 果表 明 : 向大 鼠 P A G 内恒速注射 0 . 025 %
~ 。 . 10 % S V 0 . 5 拜 L (相 当于 0 . 5 拜g / k g ~ 2 拌g /k g )即 出现痛阑升高 , 20 m in 达峰值 (痛闭最大提高
150 % 以上 ) , 与对照组 比较 有显著差 异 (尸 < 0 . 0 1 ) , 而欲使大 鼠痛阑提高 150 % , P A G 内注 射吗啡
的用量约为 10 拜g / k g 。 提示 S V 有很强 的中枢镇痛作用 ,作用强于 吗啡 4 倍以上 。
关键词 蝎毒 吗啡 镇痛作用 中枢
全蝎为名贵中药 , 《本草纲 目 》记载 以全
虫或蝎尾人药 ; 主治风湿痹痛 。 刘崇铭 〔1 〕 、 雷
留根 〔幻等报道 蝎毒 ( SV ) 及其提取物 有较强
的镇痛效果 , 但其镇痛机制的研究未见报道 。
我们用热辐射甩尾法研究 了 S V 的中枢镇痛
作用 , 为进一步揭示 S V 最佳镇痛效果及其
中枢机制奠定基础 。
1 材料
1
.
1 S V 的采集 : 电刺激法采 自山东洒水县
产东亚钳蝎 B u t人u : m a rt h e n s i i K a r s e h 〔3 , , 用
生化法分离 、 提取 SV , 低温制成冻干粉 。
1
.
2 药 物 的 配 制 : 用 H a n k’ s 缓 冲 液 p H
A d d r e s s
:
L i N i n g
,
W
e i f a n g M e d i e a l C o ll e g e
,
W e i f a n g李 宁 男 , 医学学士 ,讲师 。 主要从事药理 和生理 学方面的研究工作 。 现为 山东省教委重点实验室— 应用药理学实验室的成员 。 先后参加 了国家 自然科学基 金 、 省 自然科 学基金 、 省卫生厅 、 省教委等多项科研课题 的研 究工作 。 其中参加的国家 自然科学基金 “ 单 纤维肌 电图及其应 用 ” 的课题获省科委科 技进步二等 奖 , 参加的省教 委 “ 蝎毒对心脑血管药理作用 的研
究 ” 课题获省教委应用成果 三等 奖 。 目前承担着山东省教委 “ 蝎毒对神经痛模 型镇 痛作用的研究 ” 等课题 。
.
7 5 0
.