全 文 ：·
892
· 中草药 h Cin e se Tr ad i ti on a land He r ba lDr ugs2 0 0 0年第 3一卷第 2 1期
化合物 V I:白色针 晶 , m p 1 90 ℃ ~ 19 1 C ; U V 、
I R
、 ’
H
, ` 3
C N M R 数 据 与 g r a n d id e n t a t i n 仁, · 5〕基 本 一
致 ,鉴定化合物 vI 为 g r a n d id e n t a t i n 。
化合物呱 : 白色针晶 , m p 15 6 ℃一 15 7 ℃ ; U V 、
I R
、 `
H
, ` 3
C N M R 数据 与 s a l i r e p o s id e 〔 , · ’ 〕基本一致 ,
鉴定化合物呱 为 s a l i r e p o s id e 。
参 考 文 献
T h i e rn e H
.
P h a r m a z i e
, 1 9 6 3
,
1 8
: 7 7 0
D o m m i s
s e R A
,
V
a n H I
,
V i e t in e k A J
.
P h y t o e h e m i s t
r y , 1 9 86
,
2 5 ( 5 )
: 1 0 2 1
林 茂 , 李守珍 . 药学学报 , 1 9 9 3 , 2 8 ( 6 ) : 4 3 7
1 i n d
r o r h l
一
R
,
S t e p h e n M T
,
S e
r ib e
r
J M
,
B i o e h e m S y
s t E e o l
,
19 8 7
, 15 ( 6 )
:
6 7 7
P e a r l I A
,
D a
r
l i n g 5 F
.
T a p p i
,
19 6 5
, 4 8 ( 9 )
: 5 0 6
P e a r I A
,
D a
r
l i n g 5 F
.
J O
r g C h e m
, 1 9 6 2
, 2 7 ( 5 )
: 1 8 0 6
裴月湖 , 李晓华 , 王素贤 ,等 . 中草药 , 19 83 , 14 (1 0) : 1
( 1 9 9 9
一
1 2
一
2 1 收稿 )
从蜂毒中分离纯化蜂毒肤的实验研究△
江西中医学院基础部 (南昌 3 3 0 0 0 6) 徐 彭 ’ 欧阳永伟 黄敬耀 张桂英 肖 诚 刘 波
摘 要 为 了建立一条适合国内采用的提取纯化蜂毒肤的工艺路线 , 本课题采用溶媒萃取 、 化学裂解和含与不含 4
m ol / L 脉的醋酸盐缓冲液的两次凝胶过滤柱层析的方法 , 可以从蜂毒中得到 电泳纯 的蜂毒肤 , 其静脉 注射的 L D 50
为 4 . 0 m g k/ g , 在试管内的 H D S。为 8 . 0 m g I/ 矛 , 在 0 . 25 m g八曰 时 , 即可使红细胞膜的流动性有 明显增 强 。
关键词 蜂毒 蜂毒肤 分离纯化 溶媒萃取法 化学裂解法 凝胶过滤柱层析
蜜蜂毒 ( B e V e n o m , 简称蜂毒 )是 由蜜蜂毒腺
产生后贮存于毒囊中 , 当蜜蜂受刺激时从其尾部鳌
针排出的一种毒液 ,蜂毒能治病 的偶然 , 开创 了人类
利用蜂毒治病的悠久历史 。 虽然蜂毒是经受 了千百
年长时期考验的对某些疾病确有疗效 的天然药物 ,
古今中外对蜂毒医疗应用积有丰富的经验 ,而且蜂
毒资源 丰富 , 现代关于蜂毒 的基础与应用研究也相
当活跃 ,但到 目前为止 , 蜂毒的临床应用仍很有 限 ,
尚未有任何国家将蜂毒的制剂收人药典 , 究其原因 ,
主要是蜂毒的成分众多 ,作用复杂 ,制成单体制剂的
工艺复杂 , 成本较高 , 因此 , 探索提纯蜂毒单体成分
的研究很有意义 。 在蜂毒的众多成分 中 , 以蜂毒肤
( m el it t in ) 的含量最高 ,生物 活性最强 , 具有最 为广
阔的临床应用前景川 。 国外虽有其分离提纯方法的
报道比 3 〕 ,但其工艺复杂 、 条件苛刻 , 难以在工业生产
中采用 。 本文报道一条适合国内使用的提取纯化蜂
毒肤的工艺路线 。
1 试剂与仪器
1
.
1 蜜蜂毒 : 购 自浙江省络云县养蜂场 , 系 由西方
蜜蜂 (AP i、 m el lz’fe ar , 亦称为意蜂 ) 的工蜂鳌针排出
的一种毒液 , 用取毒器收集并干燥成粉末状 。 购进
后 , 经蒸馏水 (4 ` C )溶解 并过滤 除去蜜蜂鳌针等不
溶物 ,冷冻干燥得淡黄色粉末 (此为原料蜂毒 ) ,干燥
器内保存备用 。
1
.
2 试剂 : 葡聚糖凝胶 S e p h a d e x G 一 1 0 、 G 一 2 5 、 G 一 5 0
均为中国长征制药厂产品 ,盐酸肌 、 嗅化氰均为华美
生物工程公司进 口分装产品 、 化学纯 , A m p h d in 为
瑞典 L K B 公 司产品 , 亚硫酸钠和对氯汞苯甲酸均为
国产化学纯 ,氨水 、 正丁醇 、 甲酸等均为国产分析纯 。
1
.
3 仪器 : H D 一 8 5一 5 A l 核酸蛋白检测仪为浙江省永
嘉电器厂产品 , W L B 一 78 一 C 型电子微量泵为浙江新 昌
国康仪器厂产品 , B S 一 1 0 A 自动部分收集器和 T H -
1 0 0 0 梯度混合器均为上海沪西分析仪器厂产品 , Z F -
Q 81 旋转浓缩蒸发器为上海 医械专机厂产品 , Y a m a -
ot 冷冻干燥器为 日本大和株式会社产品 , D Y Y 一 1 SB
型稳压稳流定时电泳仪为北京六一仪器厂产品 , 7 21
分光光度计为上海第三分析仪器厂产品 。
1
.
4 动物 : 昆明种小 鼠 、 普通种家兔均 由江西 中医
学院动物房提供 。
2 方法与结果
2
.
1 蜂毒肤的分离纯化
2
.
1
,
1 蜂毒 的溶媒萃取 : 参 照文献川 , 取蜂毒 5 0
m g
, 溶 于 3 0 m L 0 . 1 5 m o l / L N H 4O H 中 , 加 人 2 0
m L 正 丁醇 ,剧烈振摇 , 离心 ( 3 0 0 0 r /m i n ) 2 0 m i n ,
收集醇层并继续用正丁醇萃取 2 次 ,合并萃取液 , 25
C 回收正 丁醇 , 冷冻 干 燥 , 得产 物 A (简称 A ) 4 3 7
A d d r e s s
:
徐 彭 男
X u p e早g , _ eD p a r t m e nt o f B a “ i e , J ian g x i C o l l e g e o f T C M , N a n e h a n g
,
1 9 8 1 年 毕业 于江酉 中医学 院药学 专业 , 理学士 , 副教授 , 江西 中医学院基 础部 副主任 。 主要从事生物毒素 的分离提纯及其生物学作用和中药药理的实验研究 , 参与或主持过多个国家及省部级科研课题 ,在 国内学术 刊物上发表 论文 10 余篇 。 联系 电话 : 0 7 9 1一 68 1 1 7 13
△本课题为国家中医药管理局青年基金资助课题
中草药 C h in e s e T r a d it io n a l a n d H e r b a l D r u g s 2 0 0 0年第 3 1卷第 1 2期 . 8 9 3 ·
111 9
。
2
.
1
.
2 产物 A 的凝 胶过滤柱层析 :取产物 A 01 0
m g
,溶解于 10 . 0 m L 含有 4 m ol / L 脉的醋酸盐缓冲
液 (0 . 05 m ol / L , p H 4 . 75 , 此为缓 冲液 甲 ) 中 , 上 葡
聚糖凝胶 G 一 50 柱 (2 x 80 。 m ) , 用缓 冲液甲洗脱 (图
1 )
,洗脱液以溶血试验进行蜂毒肤的生物活性跟踪 ,
收集溶血活性作用最强的吸收峰 V 共 5 m L , 旋转
蒸发器 ( 25 C )浓缩 , 浓缩液通过葡聚糖凝胶 G 一 10
( Z x s o 。 m )柱脱盐 , 冷冻干燥 , 得产物 B 7 7 m g 。
( 1
.
0只 1 0 0 e m ) ,用缓 冲液 乙洗脱 (图 2 ) , 洗脱液以
溶血试验进行蜂毒肤 的活性跟踪 , 收集溶血活性作
用最强的吸收峰 I 共 40 m I J ,按上法浓缩 、 脱盐并冻
干 ,得产物 D 45 m g ,此即为产物蜂毒肤 。 产物蜂毒
肤 的得 率为 3 9 . 3 3 m g / 1 0 0 m g 蜂 毒 ( 4 3 7 / 5 0 0 -
0
.
8 7 4
,
0
.
8 7 4 X 4 5 / 1 0 0 = 0
.
3 9 3 3 )
。
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0 2
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15
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。赵` 目曰“ “ ` 山山` ` ` ` L 图 Z C 的 s e p h a d e x G 一 2 5 层析
0 25 5 ” 10 众 5 15 17 .5 2 . 2 产物蜂毒肤的生物活性测定
时间 ` 伪 ) 2 . 2 . 1 半数致死量 (L D S。 )的测定 : 取体重 18 一 20 9
图 I A 的 se p h a d e x G 一 5 0 层析 健康小鼠 10 0 只 ,雌雄搭配 , 随机均匀分成 10 组 。 产
2
.
1
.
3 产物 B 的化学裂解 : 参照文献图 , 取产物 B 物蜂毒肤及蜂毒各用 5 个剂量组 ,剂量按等 比级数
7 m g
, 溶解 于 20 m L 的含有 3 m ol / L 盐酸 肌 、 5 排列 ,剂量 间 比例为 1 : 0 . 75 , 静脉注射给药 , 给药
m m ol / L 亚硫酸钠和 2 . 3 m m ol l/ J 对氯汞苯 甲酸的 后观察并记录小 鼠的死亡情况 , 实验数据按 iL ct h -
溶液中 ,整个溶液用 N H 4 0 H 调到 p H 7 . 0 , 在 37 心 if ed ld 邑 W il co xo n 方法用对数机率方格纸作图 , 测
孵化 Z h ,然后此溶液按上法脱盐并冻干 ,冻干物溶 得蜂毒 的 L D S。为 4 . 3 m g k/ g ,产物蜂毒肤的 L D S。为
于装有 70 %甲酸 30 m L 的带塞玻璃瓶 中 ,加人 50 4 . o m g k/ g 。
m g 的嗅化氰结 晶 , 混合 , 在室温下保持 24 h , 然后 2 . 2 . 2 半数溶血量 ( H D S。 ) 的测定 : 参照文献 s[] , 取
用水稀释 5 倍并按上法浓缩 、 脱盐并冻干 ,得产物 C 产物蜂毒肤及蜂毒进行溶血试验观察 ,测得产物蜂毒
(简称 C ) 6 0 m g 。 肤的 H D S 。为 8 . 0 m g / I才 ,蜂毒的 H D S。为 9 . 0 m g / L 。
2
.
1
.
4 产物 C 的凝胶过滤柱层析 :取产物 C 60 m g 2 . 2 . 3 对家兔红 细 胞膜 流 动 性 的影 响 : 参 照 文
溶 解 于 2 . 0 m L 醋 酸盐 缓 冲 液 ( 0 . 05 m ol / L , p H 献 [’. 5」,取产物蜂毒肤及蜂毒进行对家兔红细胞膜流
4
.
7 5
, 此 为缓 冲液 乙 ) 中 , 上葡 聚糖凝胶 G 一 2 5柱 动性影响的体外试验观察 , 结果见表 1 。
表 1 蜂毒和蜂毒肤对兔红 细胞流动性的影响 (n 一 9)
药物浓度 ( m g / L ) 荧光偏振度
对照组
蜂毒低剂量组
蜂毒高剂量组
蜂毒肤低剂量组
蜂毒肚高剂 量组
0 5 3
1
.
0 7
0
.
2 5
0
。
5 0
0
.
3 5 7士 0 . 0 0 6
0
.
3 4 2士 0 . 0 2 0 `
0
.
3 2 8士 0 . 0 2 0 . 书
0
.
3 3 9士 0 . 0 1 4 书
0 3 3 3士 0 . 0 1 6 , 计
红细胞膜微粘度
6 9 70 士 0 . 5 3 6
5
.
98 6士 1 . 2 70 .
5
.
10 8 士 1 . 0 8 2 份 替
5
.
8 8 8士 0 . 9 9 2 潇
5
.
2 6 7士 1 . 0 0 6 二
红 细胞膜流动性能
1
.
1 2 3士 0 0 8 7
1
.
3 8 0士 0 . 3 3 8 备
1
.
6 3 3士 0 . 3 5 5 备 仲
1
.
4 0 4士 0 . 3 3 5 健
1 5 9 4士 0 3 4 2 卜 .
协 尸 < 0 . 0 5 , . 件 尸 < 0 . 0 1
·
8 9 4
· 中草药 C h i n e s e T r a d it i o n a l a n d H e r b a l D r u g s 2 0 0 0年第 3 1卷第 1 2期
2
.
3 产物蜂毒肤的生化性质鉴定
2
.
3
.
1 纯度测定 :按 文献方法困 , 分别作产物蜂毒
肤 及蜂 毒的 十二 烷基硫酸钠 (S D S ) 聚丙胺凝胶 电
泳 , 电泳 的结果显示 : 产物蜂毒肤为一条带 ,蜂毒有
5 条明显的条带 。
2
.
3
,
2 等 电点 测 定 : 按 文 献 方法川 , 用 两 性载 体
A m p h ol in e (P H 4一 1 1) 作产物蜂毒肤的凝胶等电聚
焦 电泳 , 测得其等电点 为 1 0 5 。
3 讨论
蜂毒肤是一种含有 26 个氨基酸的小分子多肤 ,
是蜂毒中的最主要毒性成分 , 生物活性强 , 尤其是具
有很强的溶血活性 ; 含量高 , 约占蜂毒干重 的 50 % ;
属强碱性疏水性 多肤 , 具可逆性 的油水两亲性 , 对生
物膜具有特定的作用 , 已广泛地用作 为膜研究的工
具药和临床用药的前期实验研究 。同时 ,蜂毒中还含
有多个其它小分子 的多肤 , 因此 ,蜂毒肤的分离提纯
一直是众 多学 者关注 的问题 〔’ 一 3〕 , 本研究利用蜂毒
肤 的油 水两亲性和其分子结构 中不含琉基及双琉
键 lj[ , ·进行溶媒萃取和化学裂解处理 , 同时利用其在
浓度 高时常以 四聚体形式存在 lj[ , 因而采 用在含 4
m ol / L 脉 (使蜂毒肤的四聚体解散 )与不含 4 m ol / L
脉的两种不同情况的缓冲液系统 中进行凝胶过滤柱
层析 ,虽然整个分离纯化的条件要求不高 ,但达到了
较为理想的分离提纯 ,所获产 品的纯度和得率均较
高 , 生物活性没受影响 , 因此 , 本课题所设计的从蜂
毒中获取蜂毒肤的分离纯化工艺路线 , 可以在 国内
中小企业 中采用 。
参 考 文 献
1 陈远聪 ,袁 士龙 . 毒素的研究 与利用 . 北京 : 科学出版社 , 19 8 :
1 2 8
2 K r e i l G
.
F E B S I E T T E R S
,
1 9 7 3
: 24 1
3 Y v e s M
,
U
r s
B
,
eB
r n a r d W F
, e z a l
.
A n a l y t i e a I B i o e h e m i
s t r y ,
1 9 8 2
:
6 1
4 法样光 ,甘午君 ,李会元 ,等 . 中华血液学杂志 , l9 8 4( 2) : 132
5 徐 彭 ,欧阳永伟 ,黄敬耀 , 等 . 中草药 , 1 9 9 6 , 2 7 ( 9 ) : 5 4 2
6 莽克强 ,徐 乃正 , 方荣祥 ,等 . 聚丙烯酞胺凝胶 电泳 . 北京 : 科学
出版社 , 1 9 7 5 : 2 6 , 8 1
( 2 0 0 0
一
0 6
一
1 5 收稿 )
荆芥及其相关药材挥发油的成分研究
南京中医药大学 (2 1 0 0 29) 吴玉 兰 ’ 丁安伟 冯有龙
摘 要 采用 薄层色谱 、气 一质联用 等方法对荆芥及 其相关药材防风 、 薄荷 、 紫苏 、 广蕾香 、 海州 香落等药材挥发 油
含量及其中所含的主要化学成分进行分析比较 ,研究其化学稳定性 , 为药材的鉴别提供依据 。
关健词 挥发油 T L C G C 一 M S 联用
荆芥为传统 中医常用的解表药 ,具有解表散风 、
透疹等功效 ,荆芥挥发油为其主要活性成分之一 。 药
理实验表明 , 荆芥挥发油具有镇痛 、 抗炎 、 扩张支气
管和抗过敏等作用川 ,我们认为荆芥挥发油含量及
其成分分析应作为药材质量评价和控制的重要指标
之一 。
为了考察荆芥挥发油 的稳定性 ,我们将 1 9 8 4 年
所提荆芥挥发油与新提挥发油进行 T L C 及 G C 一M S
分析比较 , 以研究其主要成分的变化情况 。 本文还对
防风 、 薄荷 、 广蕾香 、 紫苏 、 海州香蕾等 5 种药材的挥
发油成分及含量进行 了研究 。 这些药材或常与荆芥
复方配伍 , 或挥发油中所含主要成分与荆芥相近 ,或
与荆芥外形易混淆 。 通过 比较研究 ,找出其间主要差
异 , 为上述药材鉴别及质量控制提供依据 。
1 供试药材 . 、
荆 芥 : 为唇形科植物荆芥 sc hi ez n eP et o t en u不, -
zi a B r i q
. 的干燥地上部分 ,切成 3 ~ 4 m m 小段 , 产
地江苏 。
防风 : 为伞形科植物防风 S aP as hi ka ir a id va ir -
c a t a ( T u r e z
.
) S e h is e h k d e 的干 燥 根 , 切 成 2一 3
m m 厚的圆片 , 产地黑龙江 。
薄荷 : 为 唇形 科植 物 薄荷 eM nt h a h a lP oc a 勿 x
Br i q
. 的干燥地上部分 ,切成 5~ 6 m m 的小段 ,产地
江苏 。
紫苏 : 为 唇 形 科 植 物紫 苏 尸er il a fr ut es e e sn
( L
.
) b r i t t 的干燥带嫩枝的叶 ,切成 5一 6 m m 的小
段 , 产地江苏 。
广霍香 : 为唇形 科植物广 霍香 尸。 g os et m or c a -
·
A d d
r e s s :
W u Y
u
l a n
,
N
a n j i n g I J r
l
i v e r
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i t y o f T C M
,
N a n j i n g