全 文 ：·药理实验与临床观察·
蜂毒素对小鼠肝癌 H22细胞增殖的影响
凌昌全 ,彭永海 ,张　晨 ,黄雪强 ,李　柏
(第二军医大学长海医院 中医科 ,上海　 200433)
摘　要: 目的　观察蜂毒素对小鼠肝癌 H22细胞增殖的影响 ,探讨其抗肿瘤的可能作用环节。 方法　以 M TT法测
定蜂毒素体外对小鼠肝癌 H22细胞增殖的影响 ,运用流式细胞术分析增殖细胞核抗原 ( PCN A) 的表达 ,并观察 iv
蜂毒素对荷瘤小鼠的抑瘤作用。结果　蜂毒素对 H22细胞的抑制作用随药物浓度增加而增强 ;蜂毒素作用于 H22细
胞后 ,细胞 PCNA平均荧光强度低于对照组 ; iv蜂毒素对小鼠皮下 H22肝癌细胞具有明显的抑制作用 ,抑瘤作用随
浓度增加而增强。 结论　蜂毒素在体内外对小鼠肝癌 H22细胞增殖均有明显的抑制作用 ,下调细胞 PCN A表达可
能是其作用环节之一。
关键词: 蜂毒素 ; 肝癌 ; 细胞增殖 ; 增殖细胞核抗原
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 10 0921 03
Effect of melittin on growth and proliferation of H22 hepatocarcinoma cells
LING Chang-quan, PENG Yong-hai , ZHANG Chen, HU ANG Xue-qiang , LI Bai
( Depa rtment o f TCM , Changhai Hospital, Second M ilitary Medical Univ er sity , Shanghai 200433, China )
Abstract: Object　 To observ e the ef fect o f meli t tin on the g row th and pro li feration of H22 hepato-
carcinoma cells and study the po ssible mechanisms. Methods　 The prolifera tion inhibi to ry ra te of H22 cells
t reated w ith melit tin w as assa yed by M T T. The volume of proliferating cell nuclear antigen ( PCN A )
expression of H22 cel ls t reated wi th meli t tin w as analy zed w ith flow cy tometer af ter being stained wi th im-
munocytochemical methods. The anti tumo r effect of meli t tin w as observ ed in H22 tumo r-burdened mice.
Results　 The H22 cell killing by meli t tin w as dose-dependent. Af ter t reatment wi th meli t tin, the fluo res-
cence densi ty of PCN A of H22 cells decreased signif icant ly. M eli ttin can inhibi t the g row th of H22 hepato-
carcinoma in vivo. Conclusion　 Meli ttin can inhibi t the pro liferation of H22 cells bo th in v itro and in vivo.
Dow n-regula ting the expression of PCN A of cel ls may be one o f anti tumor mechanisms.
Key words: meli t tin; hepatoca rcinoma; cells pro li feration; prolifera ting cell nuclear antig en ( PCN A)
　　蜂毒素是蜜蜂毒的主要成分 ,对多种肿瘤细胞
有杀伤作用。有报道 1μmol /L蜂毒素可阻止肿瘤
细胞增殖而不抑制正常细胞的生长和克隆率 [ 1]。以
往研究表明 ,大剂量蜂毒素在体外对多种肿瘤细胞
有很强的杀伤作用 [2 ] ,小剂量蜂毒素具有诱导细胞
凋亡的作用 [3 ]。本研究在进一步对蜂毒素抗肝癌细
胞增殖作用进行观察的同时 ,初步探讨其抑制肿瘤
细胞增殖可能的作用环节。
1　材料
1. 1　试剂与药品:蜂毒素为本科实验室采用凝胶色
谱法纯化制备 (纯度 97% ) [4 ] ,环磷酰胺 ,上海华联
制药有限公司 ,批号 001119;鼠抗小鼠 PCN A、兔抗
小鼠 IgG-FITC为美国 Sigma公司产品 ,四甲基偶
氮唑蓝 ( M T T)为 Fluka公司产品 ;小牛血清为杭
州四季青公司产品 , RPM I-1640培养基为美国 Gib-
co公司产品。
1. 2　细胞株:小鼠肝癌 H22腹水型细胞株为本科实
验室保存。
1. 3　动物: 昆明种雄性小鼠 ,体重 ( 20± 2) g ,由第
二军医大学动物实验中心提供。
2　方法
2. 1　对体外培养 H22肝癌细胞的杀伤作用:取指数
生长期 H22细胞 ,以 5× 104 /孔细胞接种于 96孔板
中 ,加入不同剂量的蜂毒素 ,每孔溶液总体积为 200
μL,共 7个治疗组 ,蜂毒素终浓度分别为 2, 4, 8,
16, 32, 64, 128μg /mL,每组 4个复孔 ,另设不加蜂
毒素的细胞悬液对照组和空白对照组 ,每组 8个复
孔 ,分别在 37℃ , 5% CO2饱和湿度条件下培养 24,
·921·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 10期 2003年 10月
收稿日期: 2002-12-15基金项目: 上海市“百人计划”项目 ( 97BR044)作者简介: 凌昌全 ( 1957— ) ,男 ,教授 ,博士 ,博士生导师 ,主要从事中西医结合防治肝癌研究。 　 E-mail: Lingchangquan@ hotmail. com
48 h后 ,每孔加入 M T T液 ( 5 mg /mL) 20μL,继
续避光培养 4 h,离心 ,弃上清液 ,每孔加入 150μL
二甲基亚砜 ,振荡 10 min,在酶联免疫检测仪上于
492 nm波长测定各孔吸光度 ( A ) 值 ,按下列公式
计算细胞生长抑制率。
抑制率= ( 1- A治疗 - A空白
A对照 - A空白
)× 100%
2. 2　对 H22细胞 PCN A表达的影响: 取指数生长
期 H22细胞 ,以 1× 106 /孔细胞接种于 24孔板中 ,加
入不同剂量的蜂毒素 ,每孔总体积 2 mL,共 2个治
疗组 ,蜂毒素终浓度分别为 2, 6μg /mL,另设只加
细胞不加药的对照组 ,于加药后继续培养 24 h和
48 h ,分别收集细胞 , 1 500 r /min离心 5 min, PBS
洗涤 2次 ,用终浓度为 0. 002% Triton X-100预处
理 20 min后 ,加入 20μL ( 1∶ 100)鼠抗小鼠 PC-
N A抗体 , 37℃ 水浴 30 min, PBS洗涤 2次 ,加入
20μL ( 1∶ 50)兔抗小鼠 IgG-FITC标记荧光二抗 ,
另设不加 PCN A抗体、只加 IgG-FITC标记荧光二
抗作为空白对照 , 37℃ 水浴 30 min, PBS洗涤 2
次 ,免疫荧光间接法标记 PCN A。 采用流式细胞仪
进行检测 ,每个样品收集 10 000个细胞 ,以分析软
件进行分析。
2. 3　对皮下荷 H22肝癌小鼠的抗肿瘤作用: 昆明种
雄性小鼠 120只 ,体重 ( 20± 2) g,分笼饲养 ,适应
环境 3 d后开始实验。取指数生长期 H22细胞 ,调整
细胞浓度为 1× 107 /mL,每只小鼠右腋皮下接种细
胞悬液 0. 2 mL。次日将小鼠随机分为 5组 ,每组 24
只 ,蜂毒素 3个剂量组分别尾 iv蜂毒素 4. 5, 3, 1. 5
mg /( kg· d ) ,阳性对照组 iv 环磷酰胺 30 mg /
( kg· d) ,生理盐水组 (空白对照 ) iv 生理盐水 ,注
射量均为每只 0. 2 mL。 连续给药 5 d,休息 2 d,再
继续给药 5 d,共给药 10 d。停药后第 2天各组处死
小鼠 12只 ,剥取肿瘤称瘤重 ,其余小鼠观察生存
期。 抑瘤率按以下公式计算。
抑瘤率= 对照组平均瘤重 -实验组平均瘤重对照组平均瘤重 × 100%
2. 4　统计学处理: 数据以 x± s表示 ,组间吸光度 A
值及瘤重比较采用秩和检验 ,率的比较用 i2检验 ,小
鼠生存期比较采用 F检验 ,组间比较用 q检验。
3　结果
3. 1　对肝癌 H22细胞体外生长的抑制作用:经与蜂
毒素共育 24, 48 h , 4μg /m L以下组蜂毒素对 H22细
胞的生长抑制率在 30% 左右 ,而 8μg /mL以上组
对 H22细胞的抑制作用明显增强 ,抑制率在 70% 以
上 ,且随药物浓度增高而增强 ;各剂量组 24, 48 h两
个时间点之间对 H22细胞的杀伤作用差异无统计学
意义 ,见表 1。
3. 2　对肝癌 H22细胞 PCN A表达的影响: 蜂毒素
表 1　蜂毒素对肝癌 H22细胞体外生长的抑制作用 (x± s)
Table 1　 Inhibitory eff ect of melittin on growth of hepatocarcinoma H22 cells in vitro (x± s )
组　别 终浓度
/(μg· mL- 1) n
A值
24 h 48 h
细胞生长抑制率 /%
24 h 48 h
蜂毒素　 　　　 128 4 　 　 0. 038± 0. 004* * 　 　 0. 035± 0. 001* * 　　　 100 　　　 100
64 4 0. 042± 0. 004* * 0. 039± 0. 003* * 99. 3 99. 9
32 4 0. 112± 0. 005* * 0. 114± 0. 004* * 85. 8 90. 8
16 4 0. 123± 0. 024* * 0. 121± 0. 004* * 84. 0 90. 0
8 4 0. 193± 0. 013* * 0. 284± 0. 029* * 71. 9 70. 5
4 4 0. 398± 0. 012* * 0. 603± 0. 059* 34. 9 30. 0
2 4 0. 461± 0. 016* 0. 665± 0. 038* 23. 5 22. 6
对照　 　　　　 - 8 0. 591± 0. 002 0. 869± 0. 046 0 0
　　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs cont rol group
2, 6μg /mL作用 H22细胞 24, 48 h后 ,流式细胞仪
检测各组 PCN A荧光强度 ,结果蜂毒素组 24, 48 h
PCN A平均荧光强度均低于对照组 ;提示蜂毒素对
PCN A的表达有明显的抑制作用。 见表 2。
3. 3　对皮下荷 H22肝癌小鼠的抗肿瘤作用: H22细
胞皮下接种成瘤率 100% 。经统计学处理 ,高、中剂
量蜂毒素组、环磷酰胺组平均瘤重明显低于对照组
( P < 0. 01) ,低剂量蜂毒素组与对照组平均瘤重无
明显差异 ;各实验组与对照组相比生存期延长 ,见
表 2　蜂毒素对肝癌 H22细胞 PCNA表达的影响 ( x± s )
Table 2　 Effect of melittin on PCNA expression
of hepatocarc inoma H22 cells ( x± s )
组　别 终浓度
/ (μg· mL- 1)
平均荧光强度
24 h 48 h
蜂毒素 2 675. 34± 10. 50* 379. 28± 12. 51* *
6 591. 62± 13. 28* 255. 11± 15. 53* *
对照　 - 1 016. 20± 20. 32 919. 13± 13. 82
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs cont rol g roup
·922· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 10期 2003年 10月
表 3。 结果提示:蜂毒素对 H22皮下移植瘤具有明显
的抑制作用 ,且随浓度增大 ,抑瘤作用逐渐增强。
表 3　蜂毒素对皮下荷 H22肝癌小鼠的抑瘤
及延长生存期作用 (x± s , n= 12)
Table 3　 Antitumor and prolonging survival time ef fect
of melitt in on subcutaneous inoculation mice
with H22 hepatocarcinoma cells (x± s , n= 12)
组　别 剂　量
/( mg· kg- 1 )
平均瘤重
/g
抑瘤率
/%
生存期
/d
生命延
长率 /%
蜂毒素　　　 4. 5 　 0. 33± 0. 13 　 84. 3 24. 18±1. 89* * 　 67. 30
3. 0 0. 64± 0. 07 69. 5 18. 09±1. 70* * 15. 03
1. 5 2. 03± 0. 41 3. 3 16. 09±1. 38* 9. 04
环磷酰胺 30 0. 07± 0. 02* * 96. 7 23. 63±1. 69* * 57. 06
对照　　　　 - 2. 10± 0. 47 0 14. 45±1. 37 0
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs control group
4　讨论
　　本实验采用 M TT法检测了蜂毒素对体外培养
的小鼠肝癌 H22细胞的杀伤作用 ,结果表明 , 8μg /
m L以上蜂毒素对 H22细胞的抑制率均在 70% 以
上 ,作用明显 ,且随药物浓度增加而增强。 本实验还
在体外实验的基础上 ,继续观察了蜂毒素对小鼠皮
下 H22细胞移植瘤的抑瘤效果。结果表明蜂毒素不
但在体外可抑制 H22细胞生长增殖 ,在体内亦能明
显抑制移植瘤的生长 ,随药物浓度增大 ,抑瘤作用逐
渐增强 ,同时明显延长了荷瘤小鼠的存活时间。
增殖细胞核抗原 ( PCN A) 是真核细胞合成
DNA所必需的一种酸性核蛋白 ,近年研究表明其
是 DNA聚合酶的辅助蛋白之一 ,调控 DNA的合
成 ,并在细胞周期中起重要的调控作用 [5 ]。PCN A在
G1后期开始表达 ,并逐渐升高 , G1 /S期交界处达到
高峰 , S期持续高水平表达 ,到 G2期明显下降。现已
证明 PCN A的合成与表达与细胞的增殖状态相关 ,
其量的变化与 DN A的合成一致。本研究结果发现 ,
蜂毒素作用于 H22细胞 24, 48 h后 ,细胞平均荧光
强度低于对照组 ,提示 H22细胞经蜂毒素作用后 ,参
与 DNA合成的 PCN A的表达明显下降 ,故推测影
响 PCN A的表达可能是蜂毒素抑制小鼠肝癌 H22
细胞生长和增殖的作用环节之一 ,确切的作用机制
值得进一步探讨。
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泽兰有效部分对血小板聚集和血栓形成的影响
石宏志 1 ,高南南 2 ,李勇枝 1 ,余竞光 2 ,范全春 1 ,白桂娥 1
( 1. 航天医学工程研究所 ,北京　 100094; 2. 中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所 ,北京　 100094)
摘　要: 目的　研究泽兰有效部分 L. F04对血小板聚集和血栓形成的影响 ,探讨其活血化瘀作用机制。 方法　用
高分子右旋糖酐静脉推注造成大鼠血瘀证模型 ,观察泽兰 L. F04对二磷酸腺苷 ( ADP )诱导的大鼠体内血小板聚
集以及体内动静脉旁路血栓、体外旋转环内血栓形成的影响。结果　 L. F04 0. 408, 0. 204 g /kg对模型组大鼠 ADP
诱导的体内血小板最大聚集率明显增加皆有显著的抑制 ,且呈剂量依赖关系 ;与对照组相比 ,血瘀模型大鼠体外血
栓质量明显增加 ,长度仅有增加趋势 , L. F04高、低剂量 ( 0. 408, 0. 204 g /kg )皆有抗血栓形成作用 , L. F04高剂量
对血栓干质量、湿质量的减轻尤为明显 ; L. F04高、低剂量对实验性动静脉旁路血栓形成均有明显的抑制作用 ,抑
制率分别为 27. 41% , 27. 14%。 结论　泽兰 L. F04可显著抑制血小板聚集及体内、外血栓形成。
关键词: 泽兰 ; 血小板聚集 ; 血栓
中图分类号: R852. 22; R286. 32　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 10 0923 04
·923·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 10期 2003年 10月
收稿日期: 2002-12-18基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 39770899)作者简介: 石宏志 ( 1970— ) ,女 ,河北永清人 ,航天医学工程研究所助理研究员 ,硕士 ,毕业于中国医学科学院、中国协和医科大学药用植物研究所 ,研究方向为生药学、航天医学。 T el: ( 010) 66362387　 E-mail: shihong z2002@ yahoo. com. cn