全 文 ：·药理实验与临床观察·
蜂毒素对肝癌细胞系 SMMC7721增殖的影响
张　晨 ,凌昌全 ,李　柏 ,彭永海
(第二军医大学长海医院 中医科 ,上海　 200433)
摘　要:目的　了解蜂毒素对肝癌细胞生长、增殖的影响。方法　采用台盼蓝排染法测定细胞的生长曲线 , M T T法
测定细胞增殖的抑制率 ,流式细胞仪检测细胞周期和细胞 PCNA的表达。 结果　蜂毒素可明显抑制肝癌细胞
SMM C7721的生长、增殖 , PCN A阳性细胞表达率随着蜂毒素剂量的增加而降低 ,对细胞周期的影响表现为 S期
细胞增加 , G2 /M期细胞减少。结论　蜂毒素可抑制肝癌细胞的生长、增殖 ,并且减少 PCN A阳性细胞的表达 ,影响
细胞周期的比率。
关键词: 蜂毒素 ;肝癌 ;增殖
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 01 0043 03
Effect of melittin on proliferation of hepatocarcinoma cell line SMMC7721
ZHANG Chen, LING Chang-quan, LI Bai , PENG Yong-hai
( Depar tment o f TCM , Changhai Hospital, Shanghai 200433, China )
Abstract: Object　 To study the effect o f melit tin on g row th and proli feration o f hepatocarcinoma
cells. Methods　 Hepatocarcinoma cell line SMMC7721 w as t reated by meli ttin. The g row th and prolifera-
tion w as observ ed by cel l counting and M T T assay; necrosis w as estimated by Trypan blue staining . The
expression of proliferating cell nuclear antig en ( PCN A) and cycle phase w ere detected by flow cy tometer.
Results　 Melit tin could significant ly inhibi t the g row th o f SMMC7721 and blo ck up cells prog ress th rough
G2 /M. The percentag e of PCN A posi tiv e cell w as decreased g radually w hen concentra tion o f meli t tin w as
increased. Conclusion　 Melit tin could inhibit the pro li ferativ e activi ty o f hepa tocarcinoma cell line
SMMC7721 and reduce of PCN A positiv e cell expression and arrest cells in S phase.
Key words: meli t tin; hepatoca rcinoma; pro liferation
　　蜂毒素是蜂毒的主要活性成分 ,约占蜂毒干重
的 50%。 近年来 ,随着蜂毒分离、提取、纯化技术的
不断提高 ,对蜂毒素的功能及作用机制的研究也日
益广泛。有研究表明蜂毒素可以通过多种途径影响
细胞的信号传导系统 ,诱导细胞凋亡 ,并具有抗菌、
抗病毒及抗肿瘤等广泛的生物学效应。我们研究室
在提取高纯度蜂毒素的基础上 ,开展了蜂毒素抗肿
瘤的疗效及作用机制的研究 ,本实验初步观察了蜂
毒素体外对肝癌细胞系 SMMC7721生长、增殖的
影响 ,为蜂毒素在抗肿瘤的临床应用及作用机制方
面的深入探讨提供部分实验依据。
1　材料与方法
1. 1　药物: 蜂毒素由本研究室分离、提纯 (纯度
97. 21% ) ,使用时用 RPM I1640培养基稀释成 600
μg /mL备用。
1. 2　细胞系:肝癌细胞系 SMMC7721由中国科学
院上海细胞研究所引进 ,常规接种于含 10% 小牛
血清的 RPM I1640完全培养基中 , 37℃ , 5% CO2饱
和湿度培养 ,取生长期细胞进行实验。
1. 3　细胞生长曲线测定: 将细胞以 2. 5× 104接种
于 6孔板中 , 24 h细胞贴壁后加入终浓度为 4, 16
μg /mL的蜂毒素处理细胞 ,逐日取对照及药物处理
组细胞 , 0. 02% EDTA消化细胞 ,台盼蓝染色 ,光镜
下计活细胞数。
1. 4　细胞增殖抑制率的测定: 采用 MT T法 , 96孔
板接种 1× 104细胞 ,实验组加入 16, 8, 4, 2, 1, 0. 5
μg /mL终浓度的蜂毒素培养 72 h,实验结束前 4 h
加 M TT 20μL继续培养。实验结束时倾去培养基 ,
每孔加 DMSO 150μL,震荡混匀 , 10 min后于酶联
仪上测定波长为 490 nm的吸光度值 ,按下列公式
·43·中草药　 Chinese T raditional and Herba l Drugs　第 34卷第 1期　 2003年 1月
收稿日期: 2002-06-07基金项目:军队“九五”重点课题 ( 98DJ-3269)作者简介:张　晨 ( 1963— ) ,男 ,吉林人 ,主治医师 , 1986年毕业于延边医学院 , 1995年于大连医科大学获硕士学位 ,现在第二军医大学长海医院攻读中西医结合学博士学位 ,研究方向为携蜂毒素基因腺病毒对肝癌的靶向基因治疗。
计算细胞增殖抑制率。
　　细胞增殖抑制率 (% ) = ( 1-实验组吸光度值 /对照组
吸光度值 )× 100%
1. 5　细胞周期的测定:细胞经 4, 16μg /mL蜂毒素
处理后于 48, 72及 96 h收集细胞 , 70% 冷乙醇固
定过夜 ,弃乙醇 , PBS洗涤 ,加入含 RNase和 Tri ton
X-100碘化丙锭的染液 ,避光染色 30 min,用流式
细胞仪 ( BD公司 )检测。
1. 6　增殖细胞核抗原 ( PCN A)检测: 细胞经药物
处理后 , EDT A消化收集细胞 ,乙醇固定 ,用含
0. 1% Triton X-100的 PBS预处理细胞 ,用 FITC
标记的 PCN A单克隆抗体直接进行染色 , FITC标
记的小鼠 IgG2α作同型性对照 (英国 SEROT EC公
司 ) ,流式细胞仪检测阳性细胞数。
2　结果
2. 1　蜂毒素对细胞生长的影响:由图 1可见 , 4和
16μg /mL蜂毒素对 SMMC7721细胞的生长有明
显的抑制作用。
2. 2　蜂毒素对增殖细胞的影响: 表 1显示蜂毒素
作用 72 h对 SMMC7721细胞增殖的影响 ,随着蜂
毒素浓度的升高 ,对细胞增殖的抑制率明显上升。
2. 3　蜂毒素对细胞周期的影响: 表 2显示不同时
间及不同浓度蜂毒素作用后造成 SMMC7721细胞
周期的变化。
2. 4　蜂毒素对细胞增殖核抗原的影响:流式细胞仪
1-对照　 2-蜂毒素 4μg /mL　 3-蜂毒素 16μg /m L
1-cont rol　 2-melit tin 4μg /mL　 3-meli t tin 16μg /m L
图 1　蜂毒素对 SMMC7721细胞生长的影响
Fig. 1　 Inhibition on growth of SMMC7721 by melittin
表 1　蜂毒素对肝癌细胞 SMMC7721的抑制率
Table 1　 Prolif eration inhibition of SMMC7721 by melitt in
蜂毒素 / (μg· mL- 1 ) 72 h抑制率 /%
0. 5 15. 84± 3. 00
1. 0 18. 83± 2. 46
2. 0 22. 24± 3. 55
4. 0 28. 22± 1. 75
8. 0 35. 99± 3. 76
16. 0 54. 45± 4. 68
检测结果显示 ,蜂毒素作用 4 d后 ,对照组及实验组
的 PCN A表达率分别为 57. 97% , 36. 80% 和
25. 95%。随着蜂毒素的浓度升高 , SMMC7721细胞
的 PCN A阳性细胞百分率逐渐下降 (图 2)。
3　讨论
　　有研究显示 ,蜂毒素在体外对多种实验性肿瘤
细胞有强烈的杀伤作用 [1, 2 ]。 Zhu [3 ]等研究发现蜂毒
表 2　蜂毒素对 SMMC7721细胞周期的影响 %
Table 2　 Ef fect on cycle phase of SMMC7721 by melittin %
蜂毒素
/(μg· mL- 1 )
48 h
G0 /G1 S G2 /M
72 h
G0 /G1 S G2 /M
96 h
G0 /G1 S G2 /M
　　 0 　 65. 50 　 23. 34 　 11. 15 　　 65. 08 　　 21. 12 　　 13. 80 　　 66. 43 　　 20. 60 　　 12. 96
4 67. 68 26. 18 6. 14 65. 83 32. 00 11. 17 59. 18 32. 88 7. 94
16 65. 59 34. 08 0. 33 67. 12 28. 55 4. 13 63. 75 30. 87 5. 38
图 2　蜂毒素对 SMMC7721细胞 PCNA的影响
Fig. 2　 Ef fect on prolif erat ing cell nuclear antigen of SMMC7721 by melitt in
·44· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l Drugs　第 34卷第 1期　 2003年 1月
素在 1μmol /L浓度时 ,阻止肿瘤细胞的增生 ,而不
抑制正常细胞的生长和克隆率。以往的研究显示 ,大
剂量蜂毒素在体外对多种肿瘤细胞有极强的杀伤作
用 ,而小剂量蜂毒素具有明显诱导细胞凋亡的作
用 [4, 5 ]。本实验是在对蜂毒素的分离、提取、纯化及对
其抗肿瘤作用研究的基础上 ,观察蜂毒素对肝癌细
胞系 SMMC7721细胞体外生长、增殖的影响 ,结果
显示 4, 16μg /mL蜂毒素对肝癌细胞的生长有明显
的抑制作用 ,并且 4μg /mL蜂毒素处理组经台盼蓝
染色发现细胞坏死率不足 1% ,说明此浓度的蜂毒
素对 SMMC7721生长的抑制不是通过细胞毒作
用 ,有可能是通过细胞凋亡途径。进一步研究表明蜂
毒素可以显著降低 PCN A的表达 ,并与浓度呈负相
关。 PCN A对细胞周期有重要的调控作用 ,其合成
和表达与细胞的增殖状态密切相关 ,蜂毒素对
SMMC7721肝癌细胞生长的抑制有可能与 PCN A
的表达降低有关。
肿瘤的特征之一是细胞周期异常 ,使肿瘤细胞
无限地增殖。 细胞周期各时相的生化变化是一个连
续的过程 ,细胞周期的任何一个时相的生物合成被
阻断 ,都可使整个细胞周期中断 ,肿瘤治疗的中心环
节就是干扰肿瘤细胞的细胞周期 ,从而影响细胞的
生长、增殖或诱导细胞凋亡的产生。本实验通过流式
细胞仪观察了蜂毒素处理后细胞周期变化 ,发现 4,
16μg /mL蜂毒素可影响 SMMC7721细胞的细胞
周期正常移行 ,阻止 S期细胞进入 G2 /M期 ,造成 S
期细胞的聚集 , G2 /M期细胞的减少。
蜂毒来源丰富 ,作用广泛 ,生物活性强 ,是医药
和生物工程方面的重要原料 ,其主要成分蜂毒肽对
淋巴瘤、肉瘤有细胞毒作用 ,可通过阻抑氧化磷酸化
对一些肿瘤产生抑制作用 [6 ]。 但蜂毒在肿瘤临床应
用方面尚受到一些毒副作用的限制 ,随着蜂毒素提
纯技术的进步及对其结构、剂型改造工作的深入 ,蜂
毒素在抗肿瘤的临床治疗方面的价值将会越来
越大。
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泽泻不同溶剂提取物对大鼠尿草酸钙结石形成的影响
曹正国 1 ,刘继红 1 ,吴继洲 2 ,鲁德曼 1 ,尹春萍 2 ,叶章群 1
( 1. 华中科技大学同济医学院附属同济医院 泌尿外科 ,湖北 武汉　 430030; 2. 华中科技大学同济医学院药学院 ,湖北 武汉
　 430030)
摘　要: 目的　研究泽泻不同溶剂提取物对大鼠尿草酸钙结石形成的影响 ,并确定其抑制尿草酸钙结石形成的有
效部位。 方法　通过 ig不同剂量的泽泻不同溶剂提取物对乙二醇和氯化铵诱导的大鼠肾草酸钙结石模型进行试
验研究。结果　泽泻乙酸乙酯浸膏高剂量组大鼠的血清 Cr , BUN ,肾 Ca2+含量 , 24 h尿 Ca2+ 分泌量 ,肾组织的草酸
钙晶体沉积均明显低于成石组 (P < 0. 05)。结论　泽泻乙酸乙酯浸膏能抑制实验性高草酸尿症大鼠尿草酸钙晶体
的形成 ,是泽泻抑制尿草酸钙结石形成的有效部位。
关键词: 泽泻 ;尿石 ;草酸钙
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 01 0045 04
·45·中草药　 Chinese T raditional and Herba l Drugs　第 34卷第 1期　 2003年 1月
收稿日期: 2002-06-15基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39970891)作者简介:曹正国 ( 1975— ) ,男 ,湖北黄石人 ,博士研究生 ,现参与两项国家自然科学基金课题 ( 39970891和 39970710) 的研究 ,主要从事泌尿外科尿石症和膀胱肿瘤的研究。 Tel: ( 027) 83663407　 E-mail: zgcao2002@ hotmail. com