全 文 ：·药理实验与临床观察·
灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶 A活性的影响△
中国人民解放军 401医院药剂科 (青岛 266071)　　李明春 　梁东升　许自明
第一军医大学药理教研室　　　　　 　　　　　　雷林生　 杨淑琴　孙莉莎
摘　要　为观察灵芝多糖 ( GLB7 )体外对小鼠腹腔巨噬细胞 ( MΥ)蛋白激酶 A( PKA)活性的影响 ,采用反相离子对
高效液相色谱法测定 MΥ中 RKA活力。结果表明 GLB7 ( 40 mg /L)能引起小鼠腹腔 MΥ中 PKA活性明显升高 , 10
min达峰值 , 30 min恢复到基础水平。 提示灵芝多糖的免疫增强作用与其增强 MΥ中 PKA活性有关。
关键词　灵芝　灵芝多糖　巨噬细胞　蛋白激酶 A
Effects of Ganoderma (Ganoderma lucidum ) Polysaccharide on PKA Activity of
Murine Peritoneal Macrophages
　　Depar tment o f Pharmacy, No. 401 Hospita l o f PLA ( Qingdao 266071)　 Li M ingchun, Liang Dong sh eng and Xu Ziming
　　Depar tment of Pha rmaco log y , the Fir st Milita ry Medical Univ ersity　 Lei Linsheng , Yang Sh uqin and Sun Lisha
Abstract　　 To investigate the ef fects o f Ganoderma lucidum polysaccharide ( GLB7 ) on pro tein kinase
A ( PK A) activity of murine peri toneal macrophages. A new ionpai r RP-HPLC method w as used to
determine the activ ty of PK A in cells. The results show ed tha t GLB7 ( 40 mg /L ) activ ated the PKA of
murine peri toneal macrophages, to a peak value w ithin 10 min, and then recovered to it s basic lev el af ter
30 min. This resul t indicated tha t GLB7 may act as an immunopoteniator of PKA in murine peri toneal
macrophages.
Key words　　 Ganoderma lucidum ( Leyee. ex Fr. ) Karst　 Ganoderma lucidum poly saccha ride　
macrophage　 protein kina se A ( PKA)
　　灵芝多糖是灵芝 Ganoderma lucidum ( Ley ss.
ex Fr. ) Karst的主要活性成分。以往实验证明灵芝
多糖具有免疫增强和抗肿瘤作用 ,它能增强小鼠腹
腔巨噬细胞 ( MΥ)的吞噬功能 ,促进混合淋巴细胞
培养反应 ,促进未经纯化的脾细胞在体外的增殖 ,增
强 DNA多聚酶α的活性以及促进白细胞介素 2的
分泌等 [1～ 4 ]。 但灵芝多糖的免疫作用机制尤其是对
免疫细胞的信号转导过程有何影响尚不清楚。 本文
利用反相离子对高效液相色谱测定技术 ,观察灵芝
多糖对小鼠腹腔 MΥ中蛋白激酶 A( PKA)的影响 ,
以探讨灵芝多糖的免疫调节作用机制。
1　材料和方法
1. 1　药品与试剂: 灵芝多糖 ( GLB7 ) ,按文献方法提
取 [5, 6 ] ,化学组成是以葡萄糖、半乳糖为主的杂多糖 ,
糖苷键连接方式以 β ( 1→ 4)为主 ,稍多 α( 1→ 6) ,分
子量 9 000。 RPM I-1640培养基 ,为 Gibco产品。胎
牛血清 ( FCS):杭州四季青生物工程材料研究所产
品。 Sucrose、 DTT、 Leupetin、 Histone (Ⅲ -s)、 PM-
SF、 ATP、 ADP、 AMP、 cAMP均为 Sigma产品。 甲
醇、 PiCA,皆为国产色谱纯。
1. 2　动物: BALB /c纯系小鼠 , ♀不限 , 8周龄 ,
体重 18～ 22 g ,由第一军医大学实验动物中心提供。
1. 3　巨噬细胞的培养: 按文献方法 [ 7]无菌取小鼠腹
腔 MΥ,经苔盼蓝染色细胞活率 95%以上 ,调整细
胞浓度为 109～ 1010 /L,接种于多孔培养板中 ,置于
含 5% CO2、 95%空气孵箱中 , 37℃孵育 24 h。对照
组皆以 RPM I-1640完全培养基替代 ,实验组中加测
试药物等处理因素皆以 RPM I-1640完全培养基溶
解和稀释。
1. 4　 RKA活性测定 [8 ]
1. 4. 1　 PKA的制备: 于培养的细胞体系中加入
200μL PK A提取液 ,内含: T ris-HCl ( pH7. 4) 20
mmol /L, DTT 2 mmol /L, Leupetin 5 mg /L,
PM SF 1 mmol /L, Sucrose 200 mmol /L , CaCl2 1
·353·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 5期
Address: Li M ingchun , Departmen t of Pharmacy, No. 401 Hospi tal of PLA, Qingdao李明春　男 ,副主任药师。 1987年毕业于第二军医大学药学系 ,获学士学位: 1998年毕业于第一军医大学 ,获药理学硕士学位 ,研究方向为免疫药理。 近年来在国内外期刊上发表论文 10余篇 ,获军队科技成果奖 6项。 现主要从事临床药理学研究工作。△国家自然科学基金资助项目　No /39400165
mmol /L, KCl 10 mmo l /L, M gCl2 2 mmol /L。冰浴
下超声粉碎。 900× g离心 5 min,去除碎片和胞核 ,
得上清即为胞浆组分和膜性组分 ,以此用于测定
PK A总活力。以上操作皆于 4℃以下进行。
1. 4. 2　 PKA活性测定:用反相离子对高效液相色
谱法测定 [8 ]。 色谱条件: C18柱 ;流动相:甲醇-磷酸盐
缓冲液 ( 20∶ 80, pH7. 0,内含 5 mmol /L PiCA) ;流
速: 1 mL /min;检测波长: 259 nm; 柱温: 室温 ;
0. 01AU FS、进样量 20μL。 PKA反应体系中包括
PK A反应液 ,内含: Tris-HCl ( pH7. 4) 20 mmo l /L,
MgCl2 5 mmol /L,组蛋白 ( Histone,Ⅲ -s ) 1 g /L,
DTT 2 mmo l /L, AT P 0. 5 mmol /L, cAMP 2
μmo l /L和适量酶液 (按蛋白含量计 ) ,反应总体积为
1 mL。先将除酶液以外的其它溶液混匀 , 30℃预热
5 min,再加入酶液起始反应。反应开始后于 30℃水
浴摇床中准确保温 10 min,立即置于沸水浴中 1
min终止反应 ;冷却后离心除去蛋白沉淀 ,上清液中
加入 1 mL氯仿 -甲醇 ( 2∶ 1)混合物 ,振荡 1 min,抽
提脂溶性物质 , 200× g离心 5 min;小心吸出水层 ,
其中含 A TP、 ADP和 AM P。重复前步骤处理 1次 ,
合并提取液 ,低温冻存待测。
1. 4. 3　蛋白含量测定:按 Low ry法测定。
1. 4. 4　 PKA活力定义:一个酶活力单位相当于每
分钟使 Histone (Ⅲ -s)磷酸化而消耗 1 nmo l ATP
所需的酶量。
2　结果
2. 1　反相离子对 HPLC法测定 PK A:在上述色谱
条件下 , ATP、 ADP和 AMP三种物质可呈现良好
的分离 ,在样品测定中 ,杂质峰不影响 AT P的测定
(图 1)。
A-标准品　　 B-样品
图 1　反相离子对 HPLC法测定 MΥ中 PKA色谱图
2. 2　 GLB7对小鼠 MΥ中 PKA活性的影响: 以 40
mg /L GLB7与 MΥ一起孵育不同时间后 ,测定
PK A总活力。结果显示: GLB7可明显增强小鼠腹腔
MΥ中 PKA总活力 , 10 min达到峰值 ,至 30 min恢
复到基础水平 (图 2)。在 10 min时 GLB7与 PKA的
量效关系具有一定浓度依赖性 (r= 0. 878 9,表 1) ,
实验测得 PK A的基础总活力为 ( 80. 93± 4. 52)
nmol / ( min· mg ) (n= 6,x± s )。
A-实验组 ;　 B-对照组 ;　 GLB7浓度为 40mg /L
图 2　 GLB7对小鼠腹腔 MΥ PKA活性的影响时程
表 1　 GLB7对小鼠 MΥ PKA活性的影响 (n= 6, x± s )
GLB7
( mg /L)
PKA总活性 (nmol /min· mg )
实验组 对照组
10 288. 14± 11. 81* 81. 32± 7. 45
20 377. 19± 13. 38* 80. 07± 5. 47
40 442. 71± 13. 45* 80. 84± 9. 41
80 489. 25± 19. 28* 79. 89± 11. 26
160 537. 74± 21. 25* 87. 04± 10. 37
　　与对照组比较: * P < 0. 01
3　讨论
关于蛋白激酶的测定方法 ,目前国内外一般采
用32 P-γ-A TP磷酸化组蛋白法测定 PKA活力。虽然
同位素法灵敏度高 ,但存在放射性污染 ,加之条件要
求高 ,不易进行。 以 HPLC法测定 PKA的活性 ,不
仅避免了同位素污染 ,而且方法简便、重现性好
( RSD = 0. 18% )、准确性及灵敏度高 (回收率
99. 63% )。其测定原理是: ATP在 PKA反应体系中
作为提供磷酸的物质 ,使底物磷酸化 ,同时降解为
ADP和 (或 ) AM P,其中 ATP的消耗量与 PK A之
活力成正比。
蛋白激酶是催化体内蛋白磷酸化的酶类 ,而蛋
白磷酸化则是体内各种生物反应最终起作用的通
路。 PK A是一类 cAMP依赖性蛋白激酶 ,是整个
cAMP作用的分子基础 ,在真核细胞内几乎所有
cAMP的作用都是通过活化 PKA,从而使底物蛋白
发生磷酸化而实现。 本实验证明灵芝多糖可引起小
鼠腹腔巨噬细胞 PK A活性明显升高 ,提示其免疫
增强作用可能与活化 PKA有关。但其活化途径仍
需进一步研究。
·354· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 5期
参 考 文 献
1　林志彬 . 北京医科大学学报 , 1992, 24( 4): 271
2　雷林生 ,等 . 基础与临床 , 1992, 12( 2): 59
3　 Lei L S, et al . Acta Ph armaceut ical Sinica, 1992, 27( 5): 331
4　 Lei L S, et al . J Bei jing M ed Univ, 1991, 23( 4) : 329
5　李荣芷 ,等 .北京医科大学学报 , 1991, 23( 6) : 473
6　何庆云 ,等 .北京医科大学学报 , 1989, 21( 3) : 225
7　鄂　征主编 .组织培养技术 . 北京:人民卫生出版社 , 1993: 185
8　李明春 ,等 .中国生化药物杂志 , 1999, 20( 5) : 233
( 1999-09-20收稿 )
无花果多糖对小鼠细胞免疫功能的影响△
山东济宁医学院药理教研室 ( 272113)　　戴伟娟 　司端远　辛　勒　王　清
摘　要　为观察无花果多糖 ( FCPS)对小鼠细胞免疫功能影响。 给环磷酰胺抑制小鼠及应激小鼠 ig FCPS,检测小
鼠的迟发型超敏反应 ( DTH)。 FCPS能增强环磷酰胺、应激所致免疫功能低下小鼠的迟发型超敏反应。证明 FCPS
能增强细胞介导的免疫反应。
关键词　无花果多糖　迟发型超敏反应　细胞免疫功能
Effects of Fig (F icus carica ) Polysaccharide on
Cellular Immune Function in Mice
　　 Depa rtment o f Pha rmacolog y , Jining M edical Colleg e in Shandong Prov ince ( Jining 272113)　 Dai Weijuan, Si
Duanyuan, Xin Qin and Wang Qing
Abstrast　　 To observ e the effects of Ficus carica polysaccharide ( FCPS) on cellula r immune function
in mice. FCPS w as orally administered to cyclophosphamide intoxicated mice and mice under st ress. The
delay ed-type h ypersensi tivi ty ( DT H) response of mice ea r skin w ere monitored. Result show ed that FCPS
can significantly enhance response o f DT H in cyclopho sphamide intoxicated mice and mice under st ress. It
could be concluded tha t FCPS could enhance cellular immune reaction in mice.
Key words　　 Ficus carica po lysaccharide ( FCPS)　 delayed-type hypersensitivi ty ( DTH)　 cellula r
immune function
　　近年研究证明广泛存在于动物细胞膜、植物和
微生物细胞壁中的多糖类物质能提高机体免疫系统
的功能 ,它不仅能促进 T细胞、 B细胞、 MΥ细胞等
免疫细胞的功能 ,还能促进细胞因子的生成 [1 ]。本研
究初步观察了无花果多糖 ( FCPS)对环磷酰胺、应激
所致小鼠迟发型超敏反应低下的恢复作用 ,以探讨
其对细胞免疫功能的影响。
1　材料与方法
1. 1　材料: FCPS粗提物由济宁医学院中草药研究
室司端运博士提供 ;二硝基氟苯 ( DN FB)为德国
E. Merck公司产品 ;环磷酰胺 ( Cy )由上海第十二制
药厂生产 ,批号 941208。昆明种小鼠 ,购自山东鲁抗
集团动物中心。
1. 2　方法: 取健康小鼠 ,按体重分层次随机分为 4
组 ,分组及剂量见表 1。分别 ig给药 ,每天 1次 ,连续
10 d,对照组 ig等容量生理盐水。用药第 4天 ,以脱
毛剂在小鼠腹部脱毛处理 ,次日用 1% DNFB(用
1∶ 1丙酮麻油配制 )在脱毛处致敏 ,每鼠 25μL,涂
匀 , 24 h后再用同法加强致敏 1次。致敏第 4天用
1% DN FB 10μL均匀涂抹左耳进行攻击 ,第 2天处
死小鼠 ,剪下左右双耳 ,用打孔器在双耳相应部位各
打一耳片 ,称重 ,求出左右耳片重量之差进行组间比
较 [1 ]。
1. 3　统计学处理:各组数据以 x±s表示 ,组间差异
用 t检验判断有无显著性。
2　结果
2. 1　 FCPS对 Cy诱导的免疫低下小鼠 DTH的影
响:结果见表 1。应用 Cy (动物致敏当天 ,连续 3 d ip
60 mg /kg )组小鼠 DTH强度与对照组相比明显减
弱 ,而给药组均能恢复免疫低下小鼠的 DT H。提示
·355·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 5期
Address: Dai Weijuan, Departm ent of Ph armacology, Jining Medical College, Jining戴伟娟　女 ,研究生 ,硕士 ,副教授 ,一直从事药理学教学与科研工作。主要研究方向为免疫和神经药理学。曾完成美国中华医学基金会资助项目 ,山东省卫生厅资助项目及济宁医学院多项课题 ,现正承担山东省自然科学基金资助项目。 曾获山东省医学科学技术进步奖 ,山东济宁科学技术进步奖。△山东省自然科学基金资助项目编号 Y98c 04 033