全 文 ：· 药理实验与临床观察 ·
消痕片对粥样硬化兔血管壁组织 E T一 1m R NA和
N OSm R NA表达的影响△
苏州 中药 研究所 ( 1 5 20 0 7 )
中国 中医研 究院
谢梅林 ’ 顾振纶 周文轩 ` “ 郭次仪 ` “
陈可冀
摘 要 采用 原位杂交 和 R T一 PR C方法 , 观察消痕片治疗 16 周动脉粥样 硬化兔后对血管壁 组织
E T
一
l m R N A 和 N O S m R N A 表 达的影 响 。 结果显示 , 粥样硬 化组 的 E T 一 1 m R N A 和 iN O S m R N A 表
达 较多 , 而 c N O Sm R N A 表达较少 。使用 消痕 片后 , 动脉壁组织 中的 E T 一 1 m R N A 表达 明显减少 , 提
示血浆和血 管壁组织 中的 E T 一 l 减少是 由于 E T 一 l m R N A 转 录水平降低所致 。 消痪 片对血 管壁组
织 中 iN O Sm R N A 和 e N ( ) S m R N A 表 达影 响 是不 同 的 , 它 可降低 i N O S m R N A 表 达 , 增 加 e N O S
m R N A表达 。 表明消疲 片可通过调节 N O S 不同亚型基 因的表达而 消减动脉粥样硬化病变的程度 。
关健词 消痕片 内皮素 一氧化氮合酶 基 因表达
E f f e e t s o f X i a o y u T a b l e t o n E x P r e s s i o n o f E T
一
1 m R N A a n d N O Sm R N A
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.
K e y w o r d s X ia o y u T a b le t e n d o th e lin n it r ie o x i d e s y n t h a s e g e n e e x p r e s s i o n
消痕片为丹参 S a l v i a m i l t io r hr i z a B g e .
水 提 取 物 和 山 植 C ar t ae g us P动 n at ifz d a
B ge
. 醇提取物按 一定 比例混 合组成的纯 中
药 制 剂 。 已 有 研 究 表 明 , 它 通 过 调 节 血
脂 〔 ’ 一 “ 〕 , 降低血浆 内皮素 ( E T )和增加血清一
氧化氮 ( N O ) 含量 〔们等作用而消退动脉粥样
斑块 〔5〕 。 本文采用组织原位杂交和 R T 一 P C R
方法 ,从 E T 和一氧化氮合酶 ( N O S ) 基因转
录水平观察消癖片对粥样硬化血 管壁组织
E T
一
l m R N A
、 诱导型一氧化氮合酶 ( iN O S )
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S u z h o u In s t i t u t e o f C h i n e s e M
a t e r i a M e d i e a
,
S u z h o u
谢 梅林 男 , 医学 博士 , 副教授 , 原为 苏州医 学院 药理 学教研室 副主任 , 江苏省 药理学会理事 , 1 99 8 年获得 江苏省青蓝
工程优秀青年骨 干教师称号 。 现为上海中医 药大学博士后研究人员 。 曾获得科 技进 步奖部级二等奖 l 项 , 三等 奖 3 项 , 市级
三 等奖 l 项 。 在国 内外学术 刊物上以第一 作者发表论 文 20 余篇 , 被美国 S C I 收录 2 篇 ,参编著作 2 部 。 主要研究方 向为心血管药理学和 中药新 药的研究与开发 。
“ 苏州医 学院客座教授△香港保健 协会 资助项 目
.
8 3 4
·
mN R A和 构 建 型 一 氧 化 氮 合 酶c (N O S )
mRN A表达 的影响 , 以 进一步 阐明其消退 动
脉粥样斑块的作用机制 。
1 实验材料
1
.
1 药物与试剂 : 消疲片为棕褐色粉末 , 系
太平保健药业 (蛇 口 ) 有限公 司提供 , 临用时
用蒸馏水配至所需浓度 。 力平脂为法国科尼
大药厂产品 。 胆固醇 由南京生物化学制药厂
提供 。 猪油系市售产品 。 地高辛高效 D N A 标
记 及 检测 S t a r t e r K i t l , T i t a n T M o n e t u b e
R T
一
P C R s y s t e m
,
1 0 m m o l / L d N T P 和 4一吗
琳 一丙磺酸为德国宝灵曼公 司产品 。 T ir oz l 试
剂和 蛋白酶 K 为美 国 G IB C O / B R L 公司产
品 。 D N a s e 一 f r e e R N a s e , 澳化乙锭 , 继精 D N A
和甘氨酸 为 iS g m a 产品 。 去离 子 甲酞 胺为
C l o n t e h 公司产品 。 焦碳酸二 乙醋 ( D E P C )为
F l u k a 产品 。 二甲苯靓蓝 为 E a s t m a n k o d a k
公 司产品 。 E T 一 l 。 D N A 和 i N O S e D N A 地高
辛标记探针由北京中山生物技术有限公司提
供 。 。 N O S 引 物 , 其 序 列 为 5 气 G G T G A A
T T C A T A C C A G C C T G A T C C A T G
G A A C A C
一
3 ` ( s e n s e )
,
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C T T C T T C C T G T C C G C A A A G C T
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一 s e n s e )
, 由中科 院微生物所合
成 , 扩增片段长度为 “ l b p 。 G A P D H 内参照
引物 , 北京医科大学心血管病研究所汤健教
授惠赠 。 R N a s i n 和 P C R m a r k e r 为华美生物
工程公司产品 。 其它试剂均为国产分析纯 。
1
.
2 实验仪器 : o ly m p us 显微镜 , 高速冷冻
离心机 ( S i g m a 3 K 3 o )和图像分析仪 ( K S 一 4 0 0
型 ) 为德国产品 。 D N A 扩增仪 ( P T 一 2 0 0 型 )为
美国 P E 公司产品 。 电泳仪 ( D Y Y 一 1 12 型 )
为北京六一仪器厂产品 。 紫外可见分光光度
计 ( U V 一 3 0 0 型 ) 为美国 S h im a d g n 公司产品 。
紫外反射 透射分析仪 ( ZF 一 1 型 ) 为上海长 明
光学电子仪器厂产品 。
1
.
3 实验 动物 : 雄性 新西 兰兔 , 体重 2 ~
2
.
5 k g
, 由苏州医学院实验动物中心提供 。
2 方法
2
.
1 兔腹主动脉粥样硬化模型复制及实验
《中草药 》 1 9 9 9 年第 3 0 卷第 1 1 期
分组 : 取雄性新西兰兔 , 于基础饮料中加人胆
固醇 0 . 5 9 / ( k g . d )和猪 油 o · 5 m L / ( k g ·
d ) 作高脂喂养 , 2 周后测得血清总胆 固醇 已
由高脂饲 养前的 ( 1 . 13 士 0 . 46 ) m m ol / L 上
升至 ( 5 . 5 0士 1 . 8 6 ) m m o l / L 。 参考 H e l i n 方
法 〔6 〕用 4 F . F or g a rt y 导管进行腹主动脉内皮
剥脱约 10 c m ,术后继续喂养高脂饮料 6 周 ,
兔血清总 胆固醇 由正常兔 的 (0 . 70 士 0 . 2 4)
m m o l / L 上升至 ( 1 6 . 6 6 士 5 . 9 9 ) m m o l / L , 随
机取 3 只兔处死后取出腹主动脉进行光镜和
电镜观察 , 结 果表明 , 腹 主动脉 内膜明显增
厚 ,有大量泡沫细胞和 胆固醇结晶形成 , 提示
动脉粥样硬化模型 已经形成 。 此时将高脂饮
料改喂正常饮料 , 并将 已形成腹主动脉粥样
硬化兔 24 只 随机分为 4 组 , 即粥样硬化组 ,
消疲片小剂量组 (0 · 1 6 9 k/ g · d) 和大剂量组
( O
·
3 2 9 / k g
·
d )
,力平脂组 ( 15 m g / k g · d ) ,
另加一组伪手术对照组 ,每组 6 只 , 连续给药
16 周后颈动脉放血处死 , 迅速取出腹主动脉
s m m 置 1 0 % 甲醛溶液 固定 , 石蜡包埋 , 用
于 R N A 原位杂交 ,余下 主 动脉放入液 氮内
保存 , 用于 提取总 R N A 。
2
.
2 组织原位杂交 〔 7〕 : 石蜡切片置 60 C恒
温培养箱 30 m in 后浸人二甲苯 ,梯度乙醇水
化 , 蛋白酶 K 消化 , 4 %多 聚甲醛 固定 , 预杂
交 4 2 C 、 3 0 m i n (预杂交液 : 6 X S S C , 4 5 %去
离 子 甲酞胺 , s x D e n h a r d t ’ s 液 , 1 0 0 拌g /m L
变性蛙精 D N A ) , 杂交加 1 拜g /m L 变性探针
的杂交液 , 42 C 杂交 20 h , 然后分 别用 6 X
S S C
一
4 5 %去离子 甲酞胺 , 2 X S S C , 缓冲液 I
( 1 0 0 m m o l / I
J 马 来 酸 , 0 . 1 5 m o l / L N a C I ,
p H 7
.
5 )和 缓冲液 I (缓 冲液 1 9 m L 加封闭
液 l m L ) 洗涤 , 滴加抗地 高辛抗体 , 反应 3 0
m i n 后用 N B T / B C IP 显色 6 h 。 显微镜下观
察血管壁紫蓝色或蓝色阳性杂交信号 ,直接
输人 K S 一 40 。 型 图像分析仪 , 定量测量 阳性
反应颗粒在视野 中所 占面积和 积分光密度
( I O D )
。 设立 R N a s e 处理及无探针对照组 。
2
.
3 血管壁总 R N A 提取 : 每兔取液氮保存
的腹主动脉血管壁组织 50 m g , 同一组中的
一
8 3 5
.

低 , 证 明消疲 片是在 转 录水平 上通 过 降低
E T
一
l m R N A 表达而 使 E T 一 1 含量下降 。 E T
是一种强烈长效促生长因 子 , 它可促进血管
平滑肌细胞的迁移和增生 , 由此推则消疲片
通 过 降 低 粥 样 硬 化 血 管 壁 组 织 中 E T 一 1
m R N A 的转录而 抑制 血管平 滑肌 细胞的迁
移和增生 ,从而消减动脉粥样硬化 。
本实验 通过对 粥样硬化血 管壁组织 中
iN O S m R N A 和 e N O S m R N A 表达研究发现 ,
在去内皮新西兰兔喂养高脂饮料形成动脉粥
样斑块组织 中 , i N O Sm R N A 表达 明显增强 ,
而 e N O S m R N A 表达减 少 , 这 与 N o r b e r t 等
报道 L P S l/ F N 一 y 刺激人单 核细胞或 巨噬细
胞后使 iN O Sm R N A 和 e N O S m R N A 表达的
结 果相一致 〔的 , 提示 下调 c N O S m R N A 和 上
调 iN O S m R N A 表达可 独立 出现 〔 9〕 。 这是 因
为高脂饮食后 , 内皮细胞和 血管平滑肌细胞
质膜脂质 双分 子层 出现明显的重构 , 使膜 中
胆固醇含量大大地增加 〔 `明 , 内皮细胞膜掺人
大量胆固醇后可使之与膜联结的 c N O S 活性
下调 〔川 ,而胆固醇在 血管平滑肌细胞中可增
强细胞因子诱导 i N O S 活性 〔 , ’ 〕 。 也有文献报
道高胆固醇喂养兔 的肺组织钙依赖型 N O S
活性下降 , 而钙非 依赖型 N O S 活性 明显增
加 〔 ’ “ 。 但在本实验条件下 , 也可能是由于去
内 皮 后 内 皮 细 胞 数 明 显 减 少 而 使 c N O S
m R N A 表达减少所致 。 然而 ,这些结果均提
示 , i N O S活性增加或 c N O S 活性降低均可加
重动脉粥样硬化 , 相反 ,抑制 iN O S 活性或增
强 c N O S 活性 则可阻止 动脉粥样硬 化的进
展 。 消癖 片可使粥样硬 化血管 壁组 织 中的
i N O Sm R N A 表达明显减 少 , e N O S m R N A 表
达增加 , 表 明消疲片 可 通过 影响 N O S 不同
亚型基 因的表达来调节 N O S 活性而发挥抗
动脉粥样硬化作用 。
总之 , 血管平滑肌细胞从动脉 中膜迁移
至内膜并增殖是促细胞增生因子作用增强和
抗细胞增生因子作用减弱所致 。 消痕片可从
转 录水平干扰动脉粥样 硬化血管壁组织 中
E T
一
l m R N A 和 N O Sm R N A 表达 ,从而恢复
E T 和 N O 平衡 的失调 , 这可 能是其 消退 动
脉粥样硬化的作用机制之一 。
致谢 : 苏 州 中药研究所陆群和朱路佳 同
志参加部分实验操作 。
参 考 文 献
1 谢梅林 ,等 . 中草药 , 19 9 8 , 2 9 ( 3 ) : 13 8
2 谢梅林 ,等 . 中国现代应用药学 , 1 9 9 8 , 15 (6 ) ; 15
3 谢梅林 , 等 . 中国 中药杂志 , 19 9 9 , 2 4 ( 4 ) : 2 2 9
4 谢梅林 , 等 . 海峡医 药文化学报 , 1 9 9 , 2 ( 1 ) : 29
5 谢梅林 , 等 . 中成药 , 19 9 9 , 2 1 ( 1 0 ) : 5 1 5
6 H e li n P
, 尸t a l
.
A t h e r o s e l e r o s i s
, 1 9 7 1
,
1 3 : 3 1 9
7 姜 泊 , 等 . 分子生物学常用实验 方法 . 北 京 : 人 民 军
医 出版社 , 1 9 96 : 62 , 12 8
8 N o r b e r t R
, r t a l
.
E u r J I m n l u n o l
,
1 9 9 4 , 2 4 : 1 9 4 1
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N a u n y n
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P h a r m a e o l
, 19 9 3
, 3 4 7 ( s u P P I )
:
R 6 1
10 C h e n M
, ￡2 a l
.
B i o e h e m B i o p h y
s
A e t a
,
1 99 5 , 1 2 7 2 :
1 0 1
1 钟慈声 , 等 . 一氧化氮的生物医学 . 上海 : 上 海医科 大
学 出版社 , 19 9 7 : 17 9
1 2 刘景生 , 等 . 基础医 学 与临床 . 19 9 6 , 16 : 4 01
13 1
,
a n g D
, ` r a l . B r J P h a r m a e o l
, 19 9 3
, 1 0 8
:
2 90
( 1 9 9 9
一
0 3
一
2 0 收稿 )
《中国中西 医结合杂志 》 由 中国 中西 医结 合学会和 中国中医研究院主办 , 国内外公开发行 。 本刊主要宣
传报道 党的中医政策和 中西 医 结 合方针 . 我国中西医 结合在临床 、科研 、教学等 方面的经验 和成 果 。 探讨中西
医结合思路 的方法 , 介绍国 内外 中西 医结合新进展 , 开展学 术探讨 。 为提 高与普及相结合刊物 。 本 刊的读 者对
象为 中医 、 西 医 、 中西 医结 合工 作者 , 医学 院校学生 , 基层 医务工 作者等 。
本 刊为月刊 , 2 0 0 0 年为大 16 开 8 0 页 , 每册定价 6 . 9 0 元 , 全年 82 . 8 0 元 。 国 内代 号 2 一 52 , 各地邮局均 可
订阅 。 国外代 理 : 中国国际图书 贸易总公 司 , 国外代号 M 一 64 0 。
本社 1 9 9 5 年开始 出版《 中国中西 医结合杂志 》英文 版 (C H IN E S E JO U R N A L O F IN T E G R A T E D T R A -
D IT IO N A L A N D W E S T E R N M E D IC I N E )
, 英 文 版为季 刊 , 大 1 6 开 本 , 国 内外 公开 发行 , 国 内定 价每册
25
.
0 元人 民币 , 全年 10 . 0 元 人民币 。 国 内代号 82 一 8 25 , 各地邮局均可 订阅 。 国外代理 : 中国图书进 出 口 总
公司 , 国外定价每册 15 . 0 0 美元 (不含 邮费 ) 。
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《中草药 》 1 9 9 9 年第 3 0 卷第 1 1 期 . 8 3 7 .