全 文 ：Br uker AC-250 FT -NMR 核磁共振仪。制备薄层板
为 Merck 公司出品,柱色谱用硅胶等均为日本产
品。实验用材料购于陕西省黄龙县药材公司。
2 提取和分离
阴干的羊红膻根粉碎成粗粉, 以石油醚冷浸 3
次,每次 7d( 3×7d) , 回收石油醚, 将石油醚提取物
以水蒸气蒸馏法收得挥发油部位。将挥发油部位上
硅胶柱层析, 以 n-hexane-AcOEt 不同比例洗脱,
19∶1流份再进行硅胶柱层析, 并以 n-hexane-
CH2Cl2不同比例洗脱, 收集 9∶1 流份即得化合物
Ⅰ。
3 鉴定
化合物 Ⅰ: 无色 液体, 分子式 C10 H10 O 2。
UVMeOHmax nm: 249, 292, 300。IR( KBr ) cm- 1 : 2 940,
1 610, 1 470, 1 440, 1 200。1HNMR( CDCl 3) : 2. 43
( 3H, d, J= 1. 0 Hz, 2-CH3 ) , 3. 82( 3H , s, -OCH3 ) ,
6. 30( 1H, q, J = 1. 0 Hz, H-3) , 6. 80( 1H, dd, J =
2. 5, 9. 0 Hz, H-6) , 6. 95( 1H , d, J = 2. 5 Hz, H-4) ,
7. 29( 1H, dd, J= 9. 0 Hz, H-7)。13CNMR( CDCl3 ) :
13. 6( CH3 ) , 55. 3( -OCH3 ) , 102. 7( C-3) , 102. 8( C-
4) , 110. 7 ( C-7) , 111. 1 ( C-6) , 129. 7 ( C-9) , 149. 6
( C-8 ) , 155. 6 ( C-5) , 156. 0 ( C-2 )。MS m/ z: 162
[ M ]
+
, 147 ( M - CH3 )
+
, 131 ( M - CH3O )
+
, 119
( M - C2H3O)
+
,此化合物的结构已经合成所证实。
化合物Ⅱ: 无色液体, 分子式 C7H 12O 5。IR
( KBr ) cm
- 1
: 3 550, 3 095, 3 000, 2 920, 1 720,
1 640, 1 360, 1 240, 1 043。1HNMR( CDCl3 ) : 2. 01
( 3H, s, CH3 ) , 1. 99( 3H, s, CH3 ) , 7. 70 ( 1H, d, J =
5. 0 Hz, CH ) , 4. 19( 4H, m, 2×CH2 ) , 5. 03 ( OH )。
13CNMR( CDCl3 ) : 20. 7( -CH3) , 20. 8( -CH3) , 170. 8
( C= O) , 62. 3( CH2 ) , 67. 8( CH2 ) , 67. 8( CH)。与
dacet in 标准品混合后图谱不变,故鉴定为 dacet in。
化合物Ⅲ: 无色液体,分子式 C8H8O3。1HNMR
( CDCl3 ) : 3. 78( 3H , s, -OCH3 ) , 6. 92( 1H, d, J= 9. 5
Hz, H-3) , 6. 97( 1H , d, J= 3. 0 Hz, H-6) , 7. 13( 1H,
dd, J= 9. 5, 3. 0 Hz, H-4) , 9. 92( -OH) , 10. 62( 1H,
s, CHO)。13CNMR( CDCl3) : 55. 8( -OCH3 ) , 115. 1
( C-6) , 125. 1 ( C-1) , 152. 7 ( C-2 ) , 118. 6 ( C-3 ) ,
119. 9( C-4) , 155. 9( C-5) , 196. 1( CHO)。DEPT 谱
测定,有1个-CH3 , 3个-CH-, 根据以上数据分析, 并
与 isovanillin 标准品混合后测定图谱不变, 故确定
为 isovanil lin。
化合物Ⅳ: 白色粉末, mp 62. 5 ℃, MS: 256
[ M ] +。分子式 C16H32O 2, 与标准品 palmit ic acid 的
T LC, UV , IR,
1
HNMR,
13
CNMR 谱一致。
化合物Ⅴ:与油酸( o leic acid)与标准品的 MS,
NMR 及 T LC 一致。
参 考 文 献
1 苗爱蓉,等 . 陕西新医药, 1981, 11: 48
( 1999-04-19 收稿)
龙葵多糖的分离、纯化和鉴定(Ⅱ)
广州医学院基础医学部(广州 510182) 肖桂武 曾和平* *
摘 要 首次从中草药龙葵 Solanum nig rum L . 的稀碱提取液中分离得到 2 种多糖 SNL-3, SNL-4。分别经
琼脂糖凝胶电泳、凝胶柱层析法分析, 证实均为单一组分。SNL-3, SNL-4 经酸水解、Smith 降解、红外等确知,
SNL-3 由 D-木糖 ( 75. 7% )、D-甘露糖( 9. 2% )、D-葡萄糖( 4. 9% )和 D-半乳糖 ( 10. 2% )组成, 分子量为 23
700; SNL-4 由 D-木糖 ( 89. 4% )、D-甘露糖( 1. 7% )和 D-半乳糖( 8. 9% )组成, 分子量为 47 700。SNL-3 和
SNL-4 均以 1, 3Xyl 残基为主连结而成。
关键词 龙葵 龙葵多糖 免疫活性
Isolation, Purification and Identification of Polysaccharides from Black Nightshade
( Solanum nigrum) (Ⅱ)
Depart ment of Basic Medicine, Guang zhou Medica l College ( Guangzhou 510182) Xiao Guiw u and Zeng Heping
Abstract Water -soluble polysaccharides SNL-3, SNL-4 w ere isolated f rom Solanum nigrum L. .
·162· 中草药 Chinese T radit ion al and Herbal Dr ugs 2000年第 31卷第 3期
Address : Xiao Guiw u, Dep artment of Basic M edicine, Guangzhou Medical College, Guangzhou肖桂武 男, 1964年生。1995年获理学硕士学位,现于广州医学院基础医学部任讲师。1997年进入中山大学化学与化学工程学院攻读(在职)博士研究生,专业为生物有机化学,研究具有生物活性的天然和合成物质。已在国内外重要刊物上发表论文 9篇,申报专利 1项。
* * 华南师范大学化学系
Each o f them was shown to be a sing le homogeneous component by agarose gel elect rophoresis and
Sephadex co lumn chromato graphy . Their molecular w eights w er e respect iv ely estimated to be 23 700 and
47 700. Acid hydroly sis, periodate ox idation, Smith degradation and IR spect roscopic analysis show ed that
SNL-3 contained D-xylose ( 75. 7% ) , D-manno se ( 9. 2% ) , D-glucose ( 4. 9% ) and D-galacto se ( 10. 2% ) ;
SNL-4 contained D-xylose ( 89. 4% ) , D-mannose ( 1. 7% ) and D-galactose ( 8. 9%) . Both of them were
mainly composed o f Xy Ⅰ residues via ( 1→3) glucosidic linkage.
Key words Solanum nigrum L. poly saccharides f rom S olanum nigrum L. immunolog ic compe-
tence
现代的研究表明, 多糖能用来治疗肝炎、风湿
痛、癌症、艾滋病[ 1, 2]等疾病。龙葵作为我国传统的中
草药,被用于治疗疔疮、肾炎、癌症等疾病, 前人已从
中分离出生物碱等脂溶性有效成分,但水溶性有效
成分的研究至今未见报道[ 3]。
龙葵的稀碱提取液经 DEAE 纤维素, 凝胶 G-
100 柱层析, 得 2 种多糖精制品即 SNL-3, SNL-4,
生物活性测试结果表明,多糖精制品均具有免疫活
性(生物活性的研究另报道)。
1 材料与方法
1. 1 材料: 龙葵全草鲜样采自秋末, 红外光谱用
PERKIN -ELMER 1700, 紫外光 谱用 Shimadzu
UV -240, 旋光仪用 WZZ-T1,高效液相色谱用岛津
LC-6A 测定。标准多糖 Dex tran 分子量分别为 1×
10
4、5×104、7×104、2×106 (标准蓝色葡聚糖) , 均为
Sigma 公司产品。
1. 2 方法
1. 2. 1 龙葵粗多糖的提取和分离:将采集的龙葵鲜
样切碎后,用 95% 乙醇浸泡2个月, 晒干。取干燥的
龙葵 1 kg,水提取后残渣加 0. 5 mol / L NaOH[ 4] (水
提取液另分析) ,温水浴中加热 6 h, 共 2次。过滤
后,往滤液中逐渐加入冰醋酸, 产生大量绿色沉淀。
滤除沉淀后,调 pH 至中性。将碱提取液敞口蒸发至
1 L,残渣弃去。在碱提取浓缩液中加入 1 L 95% 乙
醇,离心,干燥,得棕色固体 A 154. 5 g。
1. 2. 2 龙葵粗多糖的纯化: 取棕色固体 A 100 g,
经 Sevage 法除蛋白并反复溶解、醇析,得固体 B 33
g (所除杂质未分析)。
DEAE 纤维素柱层析: 上样量 B 4 g ,上样体积
B 38 mL, 先以蒸馏水进行洗脱, 尔后以 1 mol / L
NaCl 为上限溶液进行梯度洗脱。洗脱液以 0. 2%
硫酸蒽酮试剂显色后测吸光度。依吸光度对洗脱液
体积作图,得到洗脱曲线。分别收集单一峰,浓缩后
用无水乙醇沉淀、透析,干燥后得灰白色的 SNL-3
1. 3 g、SNL-4 1. 6 g。
凝胶 G-100 柱层析( Sephadex G-100) : SNL-3、
SNL-4 的上样量和上样体积分别为 600 mg、600
mg; 18 mL、23 mL。以蒸馏水进行洗脱,洗脱液经收
集后, 用 0. 2% 硫酸蒽酮溶液检测,依洗脱曲线收
集其中单峰区域部分, 浓缩后, 按 1∶1 体积比加入
无水乙醇, 沉淀干燥后得多糖精制品 SNL-3 403
mg, SNL-4 480 mg。
1. 2. 3 龙葵多糖的均一性测定: 琼脂糖凝胶电泳
7. 5 cm×2. 5 cm, 0. 025 mol/ L 硼酸盐溶液, 电压
300 V,电流 10～15 mA, 电泳 1 h, 0. 1% 阿利新蓝
染色。Sephadex G-200 凝胶柱层析( 37 cm×1. 1
cm)上样量为 1 mg ,流速 5～6 mL/ h,蒸馏水洗脱,
按每 2 mL 体积分部收集, 0. 2% 硫酸蒽酮显色后
测定吸光度,依相关数据绘出曲线(图 1)。
1. 2. 4 多糖的特征分析: 分别以水、二甲亚砜、乙
醇、丙酮等溶剂试验其溶解性质。在水溶液浓度为
0. 03 g/ mL 时测定比旋光度, 采用 KBr 固体压片法
测定多糖的红外光谱。
分子量:柱规格 72 cm×2. 7 cm, 展层剂为蒸馏
水, 所用凝胶为 Sephadex G-200,标准多糖 Dex tran
分子量分别为 1×104, 4×104 , 5×104 , 7×104, 2×
106 (标准蓝色葡聚糖)。将标准多糖(均取 3 mg)上
柱, 精确测出各自的洗脱体积( Ve) , 得出与分子量
对数关系的标准曲线,经线性回归处理,得校正的工
作曲线(图 2) , 相关系数 r= 0. 997 4284, 相关方程
Y = - 0. 894 975 8 X + 6. 083 59( Y = Ve/ V o, X =
LogM )。尔后以同样条件测定多糖的洗脱体积, 在
标准曲线上查出相应的分子量。
完全水解: 分别称取多糖 SNL-3、SNL-4 为 26
mg、28 mg ,加入 1. 3 135 mo l/ L H 2SO 4为 2. 0 mL、
2. 0 mL、充氮气除氧封管,均于 100℃ 水解 8 h, 水
解液用碳酸钡中和, 过滤。水解液的检出:高效液相
色谱:色谱柱 HRC-NH2( 4. 6 mm×150 mm)流动相
为乙腈-水= 75∶25,流量为 0. 8 mL/ m in, 示差检
测,定量分析采用外标法(一点校正)。
Sm ith 降解: 称取 SNL-3、SNL-4 为 14 mg、15
mg, 分别加 11 mL、11 mL 浓度为 0. 02 mol / L 的
·163·中草药 Chinese T radit ion al and Herbal Dr ugs 2000年第 31卷第 3期
NaIO4 ,暗处放二周, 加乙二醇(各约加 0. 6 mL )后,
溶液于透析袋中透析 2 d,加硼氢化钠( 25 mg ) , 搅
拌 2 h,放置过夜, 加醋酸除去过量硼氢化钠,透析 2
d,减压蒸发至干,残留物用 1. 3 135 mol/ L H2SO 4
溶解充氮气封管,于室温水解 4 d,水解液用碳酸钡
中和,过滤,清液进行 HPLC 分析。
2 结果与讨论
我们采用稀碱液提取、经除蛋白、DEAE 纤维
素柱层析、凝胶 G-100 柱层析等方法精制,得到活
性多糖 SNL-3、SNL-4, 两者分别为 403 mg、480
mg ,收率各为 1. 1%、1. 3%。
2. 1 均一性测定:琼脂糖凝胶电泳均为一个蓝色斑
点,说明都为均一组分。凝胶柱层析依实验数据,绘
出相应的洗脱曲线(图 1)。
图 1 SNL-3和 SNL-4的
Sephadex G-200 柱层析
图 2 分子量测定的标准曲线
多糖都只有单一峰,且峰形基本对称, 说明各组
分都为均一组分。
2. 2 多糖的特征分析:
2. 2. 1 溶解性: SNL-3、SNL-4易溶于水,均不溶于
二甲亚砜,乙醇、丙酮等有机溶剂。
2. 2. 2 比旋光度 : 比旋光度值分别为SNL -3
[] 20D = + 179. 3°, SNL-4[] 20D = + 95. 3°。
2. 2. 3 红外光谱:多糖在 3 400 cm - 1附近都有 O-
H 伸缩振动的强吸收, 2 900 cm - 1附近有 C-H 的伸
缩振动, 1 400～1 200 cm - 1是 C-H 的变角振动吸收
峰, 1 200～1 000 cm- 1附近有 C-H 的伸缩振动,
1 000～1 200 cm - 1是 C-H 的变角振动吸收峰,
1 200～1 000 cm - 1的一组强峰,是吡喃糖环的 C-O
(属于 C-O-C 和 C-O-H 类)伸缩振动所引起的。
SNL-3、SNL-4 都在 800 cm - 1有吸收,提示可能存
在 型糖苷键[ 5]。
2. 2. 4 分子量:选用凝胶柱层析法进行测定, 标准
曲线见图 2。多糖的洗脱体积分别为 104 mL、91
mL,依标准曲线求得分子量分别为 23 700, 47 700。
2. 2. 5 完全水解:将多糖全水解液进行高效液相色
谱分析, 结果表明: SNL-3 由 D-木糖( 75. 7%)、D-
甘露糖 ( 9. 2%)、D-葡萄糖 ( 4. 9% ) 和 D-半乳糖
( 10. 2%)组成, SN L-4 由 D-木糖( 89. 4%)、D-甘露
糖 ( 1. 7%) 和 D-半乳糖( 8. 9%) 组成。SNL-3 和
SNL-4 均以 Xyl 残基为主连结而成。
2. 2. 6 Smith 降解:多糖的降解产物经 HPLC 分
析, 结果表明: SNL-3 和 SNL-4 的降解产物均为乙
二醇、甘油和木糖醇, 其摩尔比分别为 1∶2∶78和
3∶1∶96,说明降解产物中主要是木糖醇,木糖醇应
为抗氧化的 1, 3Xyl残基的降解产物。
综合全水解、Smith 降解、红外等实验结果, 我
们认为, SNL-3 和 SNL-4 均以 1, 3Xyl 残基为主连
结而成。必须指出的是,由于本实验采用了稀碱液提
取,所以不排除发生去皮反应的可能性,所得活性多
糖可能为降解物。有关这方面的研究还有待我们更
深入进行。
致谢:华南师范大学实验中心帮助测试红外光
谱和高效液相色谱,本文中使用的龙葵全草由马广
智博士鉴定,生物活性由唐梅老师完成,在此表示衷
心的感谢。
参 考 文 献
1 Hatan aka K, et al . J M ed Chem, 1987, 30: 810
2 Yasuh ito K. JP 02, 178, 229, 1990. 7. 11
3 肖桂武,等 . 华南师范大学学报研究生学术论文专辑 . 1994: 42
4 方积年 . 药学通报, 1984, 19: 10
5 Percival ECV. J Garnet M il ler Ltd, London, 1962: 211
( 1999-04-29 收稿)
纪念《中华人民共和国广告法》实施 5 周年
·164· 中草药 Chinese T radit ion al and Herbal Dr ugs 2000年第 31卷第 3期