全 文 ：·药理实验与临床观察·
六味地黄汤活性部位 3A的免疫调节作用研究
杨　胜 ,张永祥 ,吕晓东 ,董剑英 ,乔善义 ,赵毅民
(军事医学科学院毒物药物研究所 ,北京　 100850)
摘　要:目的　初步研究六味地黄汤活性部位 3A的免疫调节作用。方法　观察 po给予 3A对环磷酰胺 ( Cy )处理
小鼠、肉瘤 S180荷瘤小鼠及快速老化模型小鼠 ( SAM )等免疫功能低下模型免疫反应的影响。结果　 3A对以上模型
低下的抗体生成反应和脾细胞增殖反应具有明显的改善作用。结论　 3 A具有明显的免疫调节作用 ,是六味地黄汤
的重要活性部位之一。
关键词: 六味地黄汤 ;活性部位 ; 3A;免疫调节
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 04 0326 04
Studies on immunomodulatory activity of fraction 3A from
LIUWEIDIHUANG DECOCTION
YANG Sheng , ZHANG Yong-xiang , LU¨ Xiao-dong , DONG Jian-ying , Q IAO Shan-yi, ZHAO Yi-min
　　 ( Institute of Pha rmaco lo gy and Toxicolog y , Academy of M ilitar y Medical Sciences, Beijing 100850, China )
Abstract: Object　 To carry out a preliminary investiga tion on the immunomodulato ry activi ty of frac-
tion 3A, a f raction f rom the ethano l-so luble po rtion o f LIUWEIDIHU ANG DECOCTION ( LW)* . Meth-
ods　 Effects of f raction 3A ( po) o n antibody production response and splenocy te pro li feration o f models
w ith cyclophosphamid trea ted, sa rcoma S180 bearing and senescence accelerated mouse-prone /8 ( SAMP8)
mice w ere evalua ted. Results　 Fraction 3A ( po) significantly improved the immune response in all of the
immunodeficient models. Conclusion　 Fraction 3A possesses potent immunomodula ting effect and is one
o f the impo rtant effectiv e f raction of LW.
Key words: L IUWEIDIHU ANG DECO CTION ( LW ); ef fective fraction; 3A; immunomodula tion
* LIUWEIDIHUANG DECOC TION is a w ell know pro totype o f classical TCM recipe to nourish the kidney-yin.
　　六味地黄汤 ( LW )是中医“滋补肾阴”的经典代
表名方 ,临床被广泛用于治疗免疫系统或与免疫系
统功能失调有关的疾病。现代实验药理学研究表明 ,
六味地黄方对机体的免疫功能具有明显的调节作
用 [1～ 3 ]。 本室应用药理学与化学密切合作的研究方
法 ,在活性评价导向下 ,对 LW发挥免疫调节的活
性成分进行定向追踪分离 ,逐步分离获得了多个活
性部位 [4, 5 ]。 其中从 LW醇溶部分中分离获得的活
性部位 3A经初步化学分析表明其主要含有多种皂
苷组分。本研究进而观察了 3A对 3种不同原因引
起的免疫功能低下模型的免疫调节作用。
1　材料与方法
1. 1　 3A的 制备:熟地黄、山茱萸、干山药、泽泻、白
茯苓、牡丹皮按 8∶ 4∶ 4∶ 3∶ 3∶ 3的比例混合煎
煮 ,获得 LW;经乙醇溶解得到醇溶部分 ,再经多步
硅胶柱层析分离 ,得活性部位 3A,冻干用于研究。
1. 2　动物及处理
1. 2. 1　快速老化模型小鼠 ( Senescence Accelerated
M ouse, SAM ):抗快速老化亚系 ( S AM-resistance /
1, S AMR1 ) , 快速 老化 亚 系 ( SAM-prone /8,
SAMP8) ,从日本京都大学引进 ,在本院动物室繁殖饲
养。饲养室温 ( 20± 2)℃ ,饮水不限 ,每日光照 /黑暗各
12 h。本研究选不同月龄的 SAMR1及 SAM P8,♀ ,
用于实验。给药组每日 po给予 1次 ,连续 7 d,体积
0. 1 mL /10 g;对照组给予等体积蒸馏水。
1. 2. 2　环磷酰胺 ( Cy )处理小鼠: N IH纯系小鼠 ,
二级 ,♀ , 6～ 8周龄 , ( 20± 2) g ,中国人民解放军总
医院动物中心提供。将小鼠随机分为 3组 , Cy于给
·326· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 4期
收稿日期: 2000-08-07基金项目:国家重点基础研究发展规划项目 ( No G1999054401)及“九· 五”国家攀登计划预选项目资助课题作者简介:杨　胜 ( 1973-) ,男 ,山西省人 ,现为在读博士研究生 ,主要从事中药复方研究。
药后 3 d给予 1次 , 50 mg /kg , ip; 3A给药方法同
SAM。
1. 2. 3　 S180荷瘤小鼠: NIH纯系小鼠 ,♀ , 6～ 8周
龄 , ( 20± 2) g;将小鼠随机分为 3组。 S180瘤细胞小
鼠体内传代 ,取富含 S180瘤细胞的小鼠腹水 ,调整细
胞浓度为 1× 106 cfu /mL,注射于每只小鼠右腋皮
下 0. 2 mL。小鼠自移植瘤细胞后 24 h开始 po给予
3A,每日 1次 ,分别于第 6, 9, 12, 15天处死动物进
行实验。
1. 3　主要试剂: RPM I-1640培养液为美国 Gibco
公司产品。 Cy为上海华联制药厂产品。氚标胸腺嘧
啶脱氧核苷 ( 3H-TdR) ,中国原子能科学研究院同
位素研究所。刀豆蛋白 A( Con A) , Sigma公司。新
生牛血清 ( NCS) ,本院放射医学研究所。补体 ,新鲜
补体血清 ,从本院动物中心提供的豚鼠股动脉取血 ,
4℃静置 ,混合 ,离心取上清液用做补体 , - 80℃
保存。
1. 4　溶血空斑 ( Plaque Fo rming Cell, PFC) 实
验 [6 ]: 以绵羊红细胞 ( SRBC)于实验前 4 d, ip免疫
小鼠 , 5× 107个 /只 ,实验时断头取脾 ,制备 2. 5× 106
cfu /mL脾细胞悬液 ,取上述细胞悬液 400μL与
50% SRBC ( 50μL)及 50% 补体 (按 1∶ 1稀释的
新鲜豚鼠血清 , 50μL)混合 ,取 100μL加入制备好
的玻璃小室 ,石蜡封口 , 3～ 4板 /组 , 37℃ 温箱孵育
1 h,计数小室内溶血空斑数 ,结果以每 106个脾细胞
所含空斑数 ( PFC /106 )表示。
1. 5　淋巴细胞增殖实验 [7 ]: 小鼠断头处死 ,无菌取
脾 ,制备脾细胞悬液 5× 106 cfu /mL,取 100μL悬
液加入 96孔培养板 ,同时加入等体积的 RPM I-
1640液或 Con A (终浓度 1μg /mL)。 37℃温箱孵
育 56 h 后 ,每孔加入 20μL 3H-TdR ( 7. 4 kBq /
孔 ) ,继续培养至 72 h,用多头细胞收集仪将细胞收
集到玻璃纤维滤膜上 , 80℃ 烘干后于液体闪烁计
数仪测 cpm值。
1. 6　统计学处理:所有实验数据以 x± s表示 ,两组
间均数的比较采用 t检验进行。
2　结果
2. 1　 3A对 Cy处理小鼠免疫反应的作用
2. 1. 1　对 Cy处理小鼠脾细胞抗体生成反应的影
响: 3A在 0. 1～ 0. 6 g /kg剂量范围内对 Cy处理小
鼠脾细胞抗体生成反应能力低下具有明显的改善作
用 ,其中 0. 3 g /kg作用最为显著 (表 1)。
2. 1. 2　对 Cy处理小鼠脾细胞增殖反应的影响: Cy
处理小鼠的脾细胞自发和 Con A诱导的增殖反应
能力均明显降低。 3A ( 0. 3 g /kg× 7 d)对 Cy处理
小鼠脾细胞自发增殖无明显作用 ,对 Con A诱导的
脾细胞增殖反应具有明显的促进作用 (表 2)。
表 1　 3A对 Cy处理小鼠脾细胞抗体生成反应的影响
(x± s,n= 3)
组别 剂量 ( g /kg ) PFC /106脾细胞
对照 - 3 820± 140
Cy对照 - 2 533± 117* *
Cy+ LW 10 4 720± 191# #
3A 0. 1 3 747± 242# #
0. 3 4 480± 322# #
0. 6 3 007± 133#
　　与对照组相比: * * P < 0. 01
与 Cy对照组相比: # P < 0. 05　# # P < 0. 01
表 2　 3A对 Cy处理小鼠脾细胞增殖反应的影响
(x± s,n= 4)
组别
3H-TdR掺入值 ( cpm )
Con A ( - ) Con A (+ )
对照 3 535± 135 31 609± 2 291
Cy对照 2 742± 274* * 6 137± 1 244* *
Cy+ 3A 2 564± 64 14 295± 2 241# #
　　与对照组相比: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
与 Cy对照组相比: # # P < 0. 01
2. 2　 3A对 S180荷瘤小鼠免疫反应的作用
2. 2. 1　对 S180荷瘤小鼠脾细胞抗体生成反应的影
响:结果表明 , 6 d时荷瘤对照组小鼠脾细胞抗体生
成反应能力较对照组增强 , 9 d时明显下降 , 15 d时
则下降更为明显。给予 3A ( 0. 3 g /kg )对荷瘤 6至
12 d小鼠脾细胞抗体生成能力低下具有明显改善
作用 (表 3)。
表 3　 3A对 S180荷瘤小鼠脾细胞抗体生成反应的影响
(x± s,n= 3)
天数
(d )
PFC /106脾细胞
对照组 S180对照组 S180+ 3A
6 2 667± 117 3 003± 193* 3 827± 204# #
9 3 187± 170 2 710± 92* 3 217± 248# #
12 2 953± 142 2 687± 133* 3 040± 72#
15 2 397± 175 1 593± 101* * 1 633± 67
　　与对照组相比: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
与 S180对照组相比: # P < 0. 05　# # P < 0. 01
2. 2. 2　对 S180荷瘤小鼠细胞增殖反应的影响:小鼠
荷瘤 9 d时其脾细胞增殖反应能力显著降低 ,特别
是 Con A诱导的增殖反应能力下降十分显著。给予
3A ( 0. 3 g /kg )对荷瘤 9 d小鼠脾细胞自发和 Con
A诱导的增殖反应能力低下均具有明显的改善作
用 (表 4)。
2. 3　 3A对快速老化模型小鼠 ( SAM )免疫反应的
作用
·327·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 4期
表 4　 3A对 S180荷瘤小鼠脾细胞增殖反应的影响
(x± s ,n= 3)
组别
3H-TdR掺入值 ( cpm )
Con A ( - ) Con A (+ )
对照 16 158± 140 125 769± 10 630
S180对照 3 321± 250* * 　 1 980± 144* *
S180+ 3A 5 694± 619# # 11 575± 917# #
　　与对照组相比: * * P < 0. 01;　与 S180对照组相比: # # P < 0. 01
2. 3. 1　对 SAM脾细胞抗体生成反应的影响: 结果
表明 , SAM R1脾细胞抗体生成反应能力随增龄略
有下降 ,但各月龄组之间无显著性差异。 给予 3A
( 0. 3 g /kg× 14 d)对 SAM R1脾细胞抗体生成反应
能力无明显影响。 SAMP8脾细胞抗体生成反应能
力随增龄明显降低 ,与同月龄 SAMR1相比 , 6月龄
开始明显降低 , 9月龄时更为显著。 3A ( 0. 3 g /kg×
14 d) 对 3, 6月龄 SAMP8脾细胞抗体生成反应能
力无明显影响 ,对 9月龄 SAMP8脾细胞抗体生成
反应能力低下则具有明显的改善作用 (表 5)。
表 5　 3A对 SAM脾细胞抗体生成反应的影响
(x± s ,n= 3)
品系 月龄 PFC /10
6脾细胞
对照组 3A
SAM R1 3 1 957± 70 2 057± 100
6 1 700± 66 1 817± 61
9 1 653± 95 1 613± 55
SAM P8 3 1 893± 60 1 812± 60
6 1 507± 74* 1 543± 64
9 1 120± 53* * 1 412± 35# #
　　与同月龄 SAMR1对照组相比: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
与 SAM P8对照组相比: # # P < 0. 01
2. 3. 2　对 SAM脾细胞增殖反应的影响: SAMR1
脾细胞增殖反应能力随增龄无明显变化 , 3A ( 0. 3
g /kg× 14 d)对 3月龄 SAMR1的脾细胞增殖反应
具有促进作用。 SAMP8脾细胞增殖反应能力随增
龄快速降低 ,与同月龄 SAMR1相比 , 6月龄开始明
显降低 , 9月龄时更为显著。给予同样剂量 3A对 6
月龄 SAMP8的脾细胞增殖反应能力有改善的趋
势 ,但与对照组相比无统计学差异 ,对 9月龄
SAM P8脾细胞增殖反应能力低下具有明显的促进
作用 (表 6)。
SAM R1脾细胞对 Con A诱导的增殖反应能
力在增龄过程中无明显变化 ,给予 3 A ( 0. 3 g /kg×
14 d)也无明显影响。Con A诱导 SAMP8脾细胞增
殖反应能力随增龄明显降低 ,与同月龄 SAM R1相
比明显降低。 3A ( 0. 3 g /kg× 14 d ) 对 9月龄
SAM P8经 Con A诱导的脾细胞增殖反应能力具有
明显促进作用 (表 7)。
表 6　 3A对不同年龄 SAM脾细胞增殖反应的影响
(x± s,n= 3)
品系 月龄
3H-TdR掺入值 ( cpm )
对照组 3A
SAM R1 3 2 200± 140 3 109± 522*
6 2 566± 561 2 173± 477
9 2 777± 225 3 074± 593
SAM P8 3 1 892± 159 2 134± 76
6 706± 157* * 942± 162
9 466± 43* * 2062± 304# #
　　与同月龄 SAM R1对照组相比: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
与 SAM P8对照组相比: # # P < 0. 01
表 7　 3A对 Con A诱导的不同月龄 SAM脾细胞
增殖反应的影响 (x± s,n= 3)
品系 月龄
3H-TdR掺入值 ( cpm )
对照组 3A
SAM R1 3 48 057± 1 373 45 029± 2 669
6 29 562± 3 973 42 154± 1 929
9 45 247± 2 233 43 406± 2 051
SAM P8 3 24 512± 1 348* * 24 805± 1 479*
6 18 525± 1 295* * 20 964± 1 312
9 8 138± 965* * 29 315± 1 177# #
　　与同月龄 SAM R1对照组相比: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
与 SAM P8对照组相比: # # P < 0. 01
3　讨论
Cy是常用的免疫抑制剂 ,对机体的免疫功能具
有多环节的抑制作用 ,本研究选用被诱导免疫功能
低下模型。结果表明 , 3A对 Cy所致小鼠脾细胞抗
体生成反应和增殖反应能力低下具有明显的改善作
用 ,提示 3A能够对抗 Cy的免疫抑制作用。
小鼠接种 S180瘤细胞后第 6天时 ,脾细胞抗体
生成反应明显增强 ,随后持续下降。该现象反映了荷
瘤动物免疫功能的动态变化规律 ,初期的增强是由
于移植肿瘤抗原引起的宿主免疫应答所致 ,但随着
肿瘤的生长 ,机体免疫功能逐步受到抑制。口服给予
3A对荷瘤 6至 12 d小鼠脾细胞抗体生成反应能力
低下具有明显改善作用 ,但随着荷瘤时间延长 ,到
15 d时改善作用消失 ,表明 3A对荷瘤引起的免疫
功能低下具有改善作用 ,但当免疫功能受到严重破
坏时则难以逆转。
SAM是日本京都大学竹田教授实验室建立的
快速老化模型小鼠 , SAMP8为快速老化亚系之一 ,
其特点是在增龄过程中中枢学习记忆功能迅速衰
退 ,免疫功能的进行性明显衰退是 SAMP8的另一
重要特征。目前 SAM在许多国家中被广泛应用于
衰老及抗衰老研究 [8 ]。本研究结果表明 , SAM P8免
疫功能随增龄快速衰退 , 9月龄时降低十分显著。口
服给予 3A对 9月龄 SAMP8的脾细胞抗体生成反
·328· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 4期
应及脾细胞增殖反应能力具有明显的改善作用 ,提
示 3A对衰老所致免疫功能低下具有明显的改善
作用。
以上结果表明 , 3A对多种原因造成的免疫功
能低下均具有明显的改善作用 ,提示 3A是 LW发
挥免疫调节作用的主要活性部位之一。因此 ,结合对
3A组分的分离鉴定研究 ,对其作用机制进行深入
的研究 ,不仅有助于进一步说明 LW的免疫调节作
用机制 ,而且对开发新型中药复方也具有实际意义。
参考文献:
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水杉总黄酮抗实验性心肌肥厚及抑制心室 c-Fos蛋白表达的作用
刘维莞 1 ,杨晓茹 1 ,屠治本 2 ,石明健 1 ,糜留西 2 ,王红英 1 ,敖　英 1
( 1. 武汉大学医学院 药理学教研室 ,湖北 武汉　 430071;　 2. 中国科学院武汉植物研究所 ,湖北 武汉　 430074)
摘　要: 目的　观察水杉总黄酮 ( TFM )对容量超负荷大鼠心肌肥厚的作用及其对心室 c-Fos蛋白表达的影响。 方
法　采用腹腔动 -静脉造瘘建立大鼠容量超负荷模型 , ig给予 T FM ,免疫组化测定心室 c-Fos蛋白的相对含量。结
果　 TFM剂量依赖性地减轻大鼠心脏重量 ,抑制心室 RNA和蛋白质合成 ,并抑制心室 c-Fos蛋白表达。 结论　
TFM可预防容量超负荷大鼠心肌肥厚的形成 ,抑制心室 c-Fos蛋白表达可能是其分子机制之一。
关键词: 水杉总黄酮 ;容量超负荷 ;心肌肥厚 ; c-Fos
中图分类号: R972. 4; R932. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 04 0329 04
Inhibitory effects of total flavones of Metasequoia glyptostroboides on
experimental cardiac hypertrophy and express ion of c-Fos protein in ventricle
L IU Wei-wan1 , YAN G Xiao-ru1 , TU Zhi-ben2 , SHI M ing-jian, M I Liu-x i2 , WAN G Hong-ying1 , AO Ying1
　　 ( 1. Depa rtment o f Pha rmacolog y , Medical Co lleg e of Wuhan Univ er sity , Wuhan Hubei 430071, China; 2. Wuhan In-
stitute o f Bo tany, Chinese Academ y of Sciences, Wuhan Hubei 430074, China)
Abstract: Object　 To observ e the ef fects o f to tal f lav ones of Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng
( T FM ) on volume-overlo ad ca rdiac hyper trophy and the expression of c-Fos pro tein in ra t. Methods　 Vo l-
ume-overload cardiac hypert rophy of ra t w as induced by aortocaval shunts. The ra ts w ere giv en ig TFM
( 400, 40 and 4 mg /kg /d) . c-Fos protein in the ventricles w ere measured by immunocy tochemical study.
Results　 TFM a t the above dosage decreased hea rt w eight and contents o f RN A and protein in the my-
ocardium, inhibi ted the expression o f c-Fos pro tein in the ventricles. Conclusion　 T FM can prevent v o l-
ume-overload cardiac hypert rophy in ra ts. The inhibi to ry effects on the expression of c-Fos pro tein may be
i ts mechanism in the molecular level.
Key words: to tal f lav ones of Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng ( TFM ); v olume-overload; ca r-
diac hypert rophy; c-Fos
　　水杉总黄酮 ( Total Flav ones of Metasequoia
glyptostroboides Hu et Cheng , TFM )是从古老的杉
属植物中提取的活性部位 ,其药理作用国内外少见
报道。我室初步研究表明 , TFM具有钙拮抗作用 ,
可防治心律失常 [1 ]。心肌肥厚 ,作为心血管疾病的独
立危险因素已形成共识。近年来 ,防治心肌肥厚的药
·329·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 4期
收稿日期: 2000-06-18基金项目:国家自然科学基金资助课题 ( NO. 39970085)