全 文 ：创含卜 劝 n日 . ,
.
, 尸 , H ,
. 罗习 ,刊 ` 刁 ~ ` . 2二 .
一种改良的糖醛酸含量测定方法
中国科学 院上海有 机化学 研究所 (2 0 0 0 2 3) 林 颖 ’ 黄琳娟 田庚元
摘 要 用硫 酸 一咔哇法 测定天然多糖化 合物 中糖醛酸含 量时 , 发现 中性糖对测定结 果有影响 , 并
提 出相 应的改进方法 . 即测定 中性糖 的吸收度 , 从样 品的吸 收度值减去 中性搪 的吸收度值 , 即为搪
醛酸 的吸收度值 。
关健词 硫酸 一咔哩法 糖醛酸 多搪
A n l m P r o v e d M e t h o d f o r t h e Q u a n t i t a t i v e D e t e r m i n a t i o n o f U r o n i e A e i d
1 in Y i
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a n g h a i I n 、 t it u t e o f ( ) r g a n i e C h e m is t r y , C h i n e s e A e a d e -
m y o f S e ie n e e s
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A b s t r a e t T h e q u a n t it a t iv e d e t e r m i
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一 e a r
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o r im e t r y
,
w a s fo u n d t o b e in t e r f e r e d b y t h e p r e s e n e e o f n e u t r a l s u g a r s
.
A e e o r d i n g
-
l y
, a n im p r o v e d m e t h o d w a s d e v e l o p e d b y d e t e r m in in g th e a b s o r b a n e e o f t h e n e u t r a l s u g a r a n d s u b s t r a e t t h is
v a
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r o m t h e a b s o r b a n e e o f t h e s a m x) le t o o b t a i n t h e e o r r e e t e d v a l u e o f u r o n ie a c id
.
K e y w o r d s
s u l f u r ie a e ld
一 e a r b a z o l e e o l o r im e t r y u r o n ie a e id p o l y s a e e h a r i d e s
糖醛酸含量的测定方法 目前常用的仍是
硫酸 一咔哇法 ` , , 但在实 际工作中 , 特别是在
测定天然产物 中糖醛酸 含量时 , 发现测得的
结果往往与实际情 况 不符 , 因此探索正确测
定天然化合物中搪醛酸含量的方法是很重要
的 。 在文献中 , 虽然有关于 影响糖醛酸测定结
果的论述 〔 2 · “二 ,但未见有 中性糖存在对其影响
的实验报道及 方法上的改进 。 我们用实验证
明中性糖的存在对糖醛酸的测定结果有较大
的影响 , 并提出 了一种消除中性糖影响的方
法 , 现报道如下 。
1 材料与仪器
0
.
1 % 咔 哇 试 液 ( 5 0 m g 咔 哇溶 于 5 0
m l
J
9 5% 乙醇 ) , 葡萄糖醛酸 ( G lc A ) 、 半乳糖
醛酸 ( G a l A ) 、 葡萄糖 ( G l e ) 、 半乳糖 ( G a l ) 、 甘
露糖 (M a n ) 、 木糖 ( X y l ) 、 阿拉伯糖 ( A r a ) 、 鼠
李糖 ( R h a ) 、 果糖 ( F ur )均 为化学纯 , 构祀 多
糖样 品 I J b G P 3 , L bG P 4 , I一b P I , I J b P Z , I J b P 3
由本课题组提供 。 72 2 分光光度计 。
2 方法与结果
2
.
1 常用的硫酸 一咔哇法
2
.
1
.
1 标准曲线绘制 : 精确称取干燥的单糖
标准样品 10 m g ,定容于 2 5 m I J 容量瓶中 。 然
后准确量取 0 , 0 . 1 , 0 . 2 , 0 . 4 , 0 , 6 , 0 . 8 m L 单
糖标 准 溶液 于 带 塞试 管 中 , .各 管 加水 至 1
m I
J 。 在冰水浴中向各管加人 6 m L 浓硫酸 ,
摇匀后 , 改在 85 C 水浴 中保持 2 0 m in , 取出
后冷至室温 ,各管加 0 . 2 n l l J 咔哇液 ,在室温
下保持 Z h , 测定吸收度 ( 5 3 0 n m ) , 以浓度对
吸收度作标准曲线 。
2
.
1
.
2 测定各单糖在 5 3 0 n m 处的检测响
应 : 分别准确 吸取各种单糖 溶液 ( 10 m g / 2 5
m L ) 0
.
4 m l
, , 补水至 1 m L 用 2 . 1 . 1 项下方
法测得其吸收值 , 结果如表 1 。
上述结果表明 , 用咔哇法测定时 , 天然多
糖化合物 中常见的各种 中性单糖在 5 3 0 n m
A d d r e s
s :
I i n Y i n g
,
S h a n g h a
一
I n s t i r u e o f O r g a n ie C l飞e m i s t r y
,
C h i n e s e A e a d e m y o f cS i e n e e s
,
S h a n g h a i
《中草药 》 19 9 9 年第 3 0 卷第 1 期 . 8 1 7 .
处也均有程度不 同的吸收 。
表 1 咔哇法测定时各单箱在 5 3 0 n m 处 的吸收值
G a l Gle M a
n
Xy l A r a Rha Fr u Ga lA G le A
0
.
0493 0
.
1018 0
.
0 503 0
.
0 840 0
.
0 251 0
.
0 14 0 0
.
1245 0
.
2603 0
.
2498
2
.
2 各单糖浓度与咔哇法测定时在 5 3 0 n m
处 吸收值的线性关 系 : 以 常用咔哇法 (参考
2
.
1
.
1 )测定各单糖吸收标准曲线 ( 其中 G al A
和 G cl A 标准溶液的配制为精确称取干燥 的
糖醛酸 1 0 m g 溶于 10 0 m L 容量瓶 ) , 其线性
回归方程及相关系数如下 。
G le y = 0
.
4 6 3 l X + 0
.
0 0 4 9 3 9 (
r 一 0 . 9 9 9 6 )
G
a
l Y = 0
.
2 3 5 8X + 0
.
0 0 4 5 6 7 ( )
一
= 0
.
9 9 9 3 )
M
a n Y = 0
.
1 5 8 7X 十 0 . 0 0 2 9 6 3 ( ,一 0 9 9 9 8 )
X y l Y = 0
.
2 5 5 9X + 0
.
0 0 0 8 8 4 ( r 一 0 . 9 9 9 7 )
F r u Y 一 0 . 1 7 2 7X + 0 . 0 0 1 8 7 2 ( r = 0 . 9 9 6 0 )
R h a 吸收值基本保持 不 变
G
a lA Y = 0
.
5 8 5 7X + 0
.
0 0 5 9 1 7 ( r 二 0 . 9 9 9 8 )
G le A Y ~ 0
.
4 2 6 4X + 0
.
0 0 0 6 0 1 (
r
= 0
.
9 9 9 9 )
上述 结 果可 知 , 各 中性单 糖在 0 . 04 ~
o
·
3 2 m g /m L 范围内 、 G a lA 和 G l e A 在 0 . 0 1
一 0 . 0 8 m g /m I J 范围内各单糖浓度与咔哇法
检测吸收值呈线性 。
2
.
3 定量考察各 中性单糖对咔哇法测定糖
醛酸含量的影响
2
.
3
.
1 分 别 准 确量 取 G a l A 和 G l e A ( 1 0
m g / 1 0 0 m l
一
) 0
.
4 m L
, 各加人 0 . 0 , 0 . 4 , 0 . 6
m l
洲 各 中性单 糖溶 液 ( 10 m g / 25 m L ) , 分别
补水至 l m l _ ,按咔哇法测其吸收值 。
2
.
3
.
2 分 别准确量取各 中性单糖溶液 ( 10
m g / 2 5 m I
J
) 0
.
0
,
0
.
4
,
0
.
6 m L
, 分别补水至 1
m l
一 ,按咔哇法测其吸收值 。 得数据如表 2 。
表 2 各种 中性 单糖对箱醛酸影响的定 t 考察 结果
加 人标 准中性 糖体积 ( m l ) 加人标 准中性搪体积 ( m L )
A 53
0
A 53 o
U
·
U U
· 任 U · 。 0 . 0 0 . 4 0 . 6
G a 1A + G l e
G l
e
( G a l A + G l
e
) (二l e
G a 1A十 G a l
(二a l
( G
a
1A + G a l ) G a l
G a lA + M
a n
M
a n
( G a l A + M a n ) M a n
G a l A + X y l
X y l
( G a lA + X y l ) X y l
G a l A + R h a
R h a
( G a 1A + R h
a
) R h a
G a l A 千 F r u
F
r u
( G a lA + F r u ) F r u
G a l A + A
r a
A r a
( G a lA + A r a ) A r a
0
.
2 7 3 8
0
.
0 0 0 0
0
.
2 7 3 8
0
.
2 5 4 9
0
.
0 0 0 0
0
.
2 5 4 9
0
.
2 6 3 6
0
.
0 0 0 0
0
.
2 6 3 6
0
.
2 6 9 2
0
.
0 0 0 0
0
.
2 6 9 2
0
.
2 2 18
0
.
0 0 0 0
0
.
2 2 1 8
0
.
2 4 4 4
0
.
0 0 0 0
0
.
2 4 4 4
0
.
2 5 5 1
0
.
0 0 0 0
0
.
2 5 吕l
0
.
3 7 3 2
(〕. 1 0 1 7
0
.
2 7 1 5
0
.
3 0 5 9
0
.
0 5 1 3
0
.
2 5 4 6
0
.
3 1 5 2
( 0盛6 3
0
.
2 6 3 6
0
.
3 工5 5
几、 . 0 7 5 9
0
.
6 2 9 6
0
.
24 0 0
0
.
00 9 (,
0
.
2 3 1 0
0
.
3 7 2 1
0
.
13 4 5
0
.
23 7 6
0
.
2 6 7 8
0
.
0 0 7 2
0
.
2 6 0 6
0
.
3 9 2 0
0
.
13 7 7
0
.
2 5 4 3
0
.
3 4 9 5
.
0 9 14
( )
.
2 5 8 4
0
.
3 10 0
0
.
0 5 5 2
0
.
2 5 4 8
0
.
3 8 3 7
0
.
12 7 5
0
.
2 5 6 2
O
,
2 2 2 3
0
.
0 1 7 0
0
.
20 6 3
0
.
44 3 2
0
.
2 19 1
0
.
22 4 1
0
.
3 12 5
0
.
0 5 3 9
0
.
25 8 6
G l e A + G le
( ; l
e
( G l e A + G l e ) (二le
G l
(
、
A + 〔 ; a l
G a i
( G l e A 十 G a l ) (二a l
G l e A + M
a n
M a n
( G l
e
A + M
a n ) M
a n
G l
e
A + X y l
X y l
( G le A + X y l ) X y l
G l e A 十 R h a
R h a
( G le A 十 R h a ) R h a
G l e A 十 F r u
F
r u
( G l e A + F r
u
) F r
u
G l e A + A r a
A r a
( G l e A + A
r a ) A
r a
0 2 4 3 8
0
.
0 0 0 0
0
.
2 4 3 8
0
.
2 6 0 3
0
.
0 0 0 ()
0
.
2 6 0 3
0
.
2 4 0 3
0
.
0 0 0 0
0
.
2 4 0 3
0
.
2 6 0 ( )
0
.
0 0 0 0
0
.
2 6 00
0
.
2 2 04
0
.
0 00 0
0
.
2 20 4
0
.
2 20 4
0
.
00 0 0
0
.
2 20 4
0
.
2 3 60
0
.
00 0 0
0
.
2 36 0
0
.
3 5 0 6
0
.
1 1 8 3
0
.
2 3 2 3
0
.
3 1 4 3
0
.
0 4 7 3
0
.
2 6 70
0
.
3 0 50
0
.
0 5 33
0
.
2 5 17
0
.
3 43 2
0
.
0 8 4
0
.
2 59 2
0
.
2 37 0
0
.
0 10 0
0
.
2 2 7 0
0
.
3 5 8 5
0
.
1 10 3
0
.
2 4 8 2
0
.
2 6 19
0
.
0 2 5 4
0
.
2 3 6 5
0
.
4 0 4 3
0
.
1 7 4 1
0
。
2 3 0 2
0 3 4 0 6
0
.
1 0 5 1
0
.
2 3 5 5
0
.
3 1 0 1
0
.
0 8 5 4
0
.
2 2 4 7
0
.
3 7 10
0
.
1 0 72
0
.
2 6 38
0
.
2 2 15
0
.
0 12 0
0
.
2 09 5
0
.
4 33 5
0
,
2 09 7
0
.
2 33 8
0
.
28 8 8 5
0 0 55 8
0
。
2 32 7
上述实验结果表明样 品的吸 收值随中性
糖的含量增加 而增大 ( R h a 除外 ) , 而 样品 吸
收值与中性糖吸收值之差和糖醛酸的吸收值
基本一致 。
2
.
4 改进的硫酸 一咔哇法 : 根据 2 . 3 的实验
结果 , 我们提出一种改进的硫酸 一咔哇法测定
糖醛酸含量 的方法 , 即样品的吸收值减去中
性糖的吸收值为样品的吸收值 。
2
.
4
.
1 标准溶液的配制
溶液 1 · 准确量取 G a l A ( 1 0 m g / 1 0 0 m L )
0
.
2 m L
, 加人 0 . 2 m L G a l ( 10 m g / 2 5 m L ) 和
0
.
2 m I
J
G l e ( 1 0 m g / 2 5 m L )
,补水至 1 m L 。
.
8 1 8
-
溶液 2 · 准确量取 G a l A ( 1 0 m g / 10 0 m L )
0
.
4 m L
, 加人 0 . 2 m L G a l ( 1 0 m g / 2 5 m L )和
0
.
2 m L G l e ( 1 0 m g / 2 5 m L )
,补水至 1 m L 。
溶液 3 · 准确量取 G a l A ( 1 0 m g / 1 0 0 m L )
0
.
6 m L
, 加入 0 . 2 m l“ G a l ( 1 0 m g / 2 5 m L )和
0
.
2 m L G l e ( 1 0 m g / 2 5 m L )
,补水至 1 m L 。
中性单 糖溶 液 . 量取 0 . 2 m L G al ( 10
m g / 2 5 m L )和 0 · 2 m L G l e ( 10 m g / 2 5 m L ) ,
补水至 l m L 。
2
.
4
.
2 方法改进前后糖醛酸测定结果的比
较 : 上述中性单糖溶 液按咔哇法测定在 5 3 0
n m 处的吸收值为 0 . 0 4 42 。
表 3 所列结果表 明 , 改进的咔哇法所测
得的标准溶液 中糖醛酸吸收值与实际测定值
基本一致 , 因此这种改进的硫酸一咔哇法在测
定各种样品 中糖醛酸的含量时 , 排除了 样品
中中性糖对测定的影响 , 因而要 比常用的硫
酸 一咔哇法准确 。
表 3 不同方法的据醛酸测 定结果
同 2 . 1 . 1 ) , 测得样品吸收值 ( 注 : 样 品中中性
糖浓度应在其线性范围内 ) 。
2
.
5
.
3 样品中糖醛酸含量的测定 : 样品中糖
醛酸的吸收值为样品吸收值与中性糖吸收值
之差 ,再根据对应标准的回归方程 ,计算出该
样品中糖醛酸含量 。 实验结果如表 4 所示 。
表 4 常用的与改进的咔哇法测定箱醛酸
含 t 结果的比较
糖醛酸含量 〔% )
多 搪样品 常用咔哇法 改进咔哇法
L b G P 3
L b G P 4
I b P I
I b P Z
L b P 3
认
:
.
:
3
.
4
6
.
4
5
.
9
6
.
7
咔哇法测定值
改 良咔哇法测定值
搪醛酸实际值
溶液 1
0
.
1 4 9 7
0
.
1 0 5 5
0
.
1 0 9 2
溶液 2
0
.
2 4 8 2
0
.
2 0 4 0
0
.
2 0 5 8
溶液 3
0
.
3 6 2 8
0
.
3 18 6
0 3 2 0 7
注 : 改进 的咔哇法测定值 为常用咔哇法测定 值与标准
配制 溶液中中性 单搪吸收值 (0 . 0 4 4 2) 之差 。
2
.
5 改进的咔哇法测定糖醛酸实例 : 从构祀
子中分离得 到的多糖样品 L b G P 3 , L b G P 4 ,
L b P I
,
L bP Z 和 L b P 3 中的糖醛酸含量测定 ,
具体操作如下 :
2
.
5
.
1 样品中中性糖吸收值的测定 : 要求得
样品中中性糖对检测 的吸收干扰值 , 首先必
须知道其 中中性糖的含量和组成 比 。 根据葱
酮 一硫酸法 〔们可测得 中性糖的含量 。 组成比的
测定需先将样品全水解 〔 5〕 ,然后再 用 H P L C
或 G C 测得样品中各中性单糖的组成 比 。 以
此称取各种相应 标准中性单糖配成混合液 ,
然 后 取 l m L 溶 液 于带 塞 试 管 中 , 然 后 按
2
.
1
.
1 所述的标准 曲线制备操作 , 测得其吸
收值 。
2
.
5
.
2 样 品的吸收值测定 : 按 咔哇法 (方法
从表 4 结果可 以看出常用咔哇法测定糖
醛酸的含量其值偏高 。
3 讨论
在咔哇法所规定的测定波长下 , 中性戊
糖和 中性己糖均有吸收 , 影响糖醛酸含量测
定的准确性 。 为此我们对 7 种不同的中性糖
分别进行 了考察 , 测得其浓度与吸收值的线
性范围 。 实验结果表明 X y l . M a n , G I。 , G al ,
F r u 分 别找到了 各 自的线性 范围 , R h a 随着
浓度的改变其吸收值基本保持不变 , A ar 较
难判断 。各种单糖线性范围的测得 , 不仅证实
了中性糖的存在对咔哇法测定糖醛酸的结果
产生干扰 , 而 且为提 出一种 比常用咔哇法准
确性高的糖醛酸测定方法提供了实验依据 。
用咔哇法测定各种中性单糖对糖醛酸影
响的定量考察实验表明 , 糖醛酸和各 中性单
糖在其各 自的线性范围内取样 ,样 品 的吸收
值与中性糖吸收值之差与不含中性糖的糖醛
酸实际测得吸收值基本一致 。
参 考 文 献
1 张惟杰 主编 . 复合多糖生化研究技术 (第 一版 ) . 上海 : 上
海科学技术 出版社 , 19 8 7 : 6
2 李好枝 . 等 . 中草药 ` 19 9 5 , 2 6 ( 7 ) : 3 4 7
3 B i t t e r T
, 以 a l . A n a l B i o e h e m , 1 9 6 2 , 4 : 3 30
4 D u b i s M
, e r a l
.
A n a l C h e m
, 1 9 56 , 2 8
: 3 5 0
5 黄琳娟 , 等 . 药学学报 , 19 9 8 , 3 3 ( 7 ) : 5 12
( 1 9 9 9
一
0 3
一
0 2 收稿 )
《中草药 》 1 9 9 9 年第 3 0 卷第 1 1 期 . 8 1 9 .