全 文 ：1 1 62
3 Kom orT i
,
et a l
.
C h e m eB
t , 1 9 6 8
,
1 0 ( 9 )
:
3 0 9 6
4 K o m o r i T
,
et a l
.
L i e b ig s A n n C h e m
,
1 9 7 3
,
( 5 / 6 )
:
9 7 8
5 Id a Y
, e t a l
.
L i e b ig s A n n C h e m
,
1 9 7 8
,
( 5 )
:
8 3 4
6 M u r r a y R D H
.
P h y t o e h e m i s t r y
,
1 9 8 4
,
2 3 ( 3 )
:
6 2 3
7 福 州军区军事医学科学研究所 . 中草药 , 1 9 80 , 1 1 ( 1 1 ) :
5 2 2
8 W IJ M
, e t a l
.
In d J C h
e m
, 1 9 7 8
,
16 ( B )
:
6 4 3
9 G u P t a D
, e t a l
.
P h y t o e h e m i s t r y
,
1 9 8 9
,
2 8 ( 3 ) : 94 7
1 0 A d e n s a n y a S
,
et a l
.
P h y t o e h e m is t r y
,
1 98 9
,
2 8 ( 3 )
: 7 7 3
1 1 张志明 , 等 . 微量元素 , 1 9 8 7 , ( 1 ) : 4 4
1 2 W e b s t e r J
, e t a l
.
J A g
r i e F o o d C h e m
,
1 9 8 4
,
3 2
:
10 8 7
13 0 2 0 O N
, e t “ 1 . P h y t o e h e m i s t r y , 1 9 8 4 , 2 3 ( 2 ) : 3 2 9
1 4 G i a e o m e t t o A P
, e t a l
.
A r q B i o l T e e h n o l ( C u r i t i ba )
,
1 9 8 7
,
3 0 ( 2 )
:
3 1 7
1 5 R a g h u n a n d a n K V
, e t a l
.
I n d J P h a r m cS i
,
1 98 7
,
4 9
( 6 )
:
2 3 3
1 6 Q P
u t e F l
, e t a l
.
J S e i F o o d A g r i e
,
1 9 7 8
,
2 9
: 9 5 9
1 7 S P li t t
s t o e s s e r W E
, e t a l
.
J A m e r S o e H o r t cS i
,
1 9 7 3
,
9 8 ( 6 )
:
5 6 3
1 8 S a x o n E C
.
E e o n B o t
,
1 9 8 1
,
3 5 ( 2 )
:
1 6 3
19 付正声 ;等 . 西北师范学报 ( 自然科学版 ) , 1 9 86 , ( 1) : 30
2 0 沈序维 , 等 . 高等学校化学学报 , 1 9 8 7 , s ( 6 ) : 5 2 5
21 中药辞海编辑委员会 . 中药辞海 (第一卷 ) . 北京 : 中国
医药科技出版社 , 1 9 9 4 . 2 4 0 7
2 2 山东医学院生理教研组 . 山东医学院学报 , 1 9 6 1 , ( 1 ) :
1 l
2 3 曹仁烈 , 等 . 中华皮肤科杂志 , 1 9 5 7 , ( 4 ) : 2 8 6
24 山东医学院药理教研组 . 山东医学院学报 , 1 9 5 9 , ( 1 3 ) :
8 7
2 5 陈 芳 . 江苏中医 , 1 99 5 , 1 6 ( 7 ) : 9
2 6 丁国明 , 等 . 中草药 , 1 9 9 2 , 2 3 ( 4 ) : 1 9 2
2 7 唐迎雪 . 中国中药杂志 , 1 9 9 5 , 2 0 ( 7 ) : 4 3 5
2 8 胡熙明 . 中国中医秘方大全 ( 中 ) . 上海 : 文汇出版社 ,
1 9 8 9
.
9 1
2 9 张信义 . 浙江中医杂志 , 1 9 9 3 , 2 5 ( 2 ) : 5 7
3 0 潘锦堂 . 植物分类学报 , 1 9 9 4 , 3 2 ( 4 ) : 3 1 6
( 1 9 9 7
一
0 5
一
2 0 收稿 )
培养细胞中小果碱的产生及其生物合成研究概况
云南大学生物系 (昆明 6 5 0 0 9 ” 王 东 ’ 李启任
摘 要 从愈伤组织的诱导 ,影响细胞生长和 小璧碱合成的因子 , 提高细胞生长和小巢碱含量的
方法及小粟碱的生物合成途经方面作了综述 ,并展望了未来的发展趋势 。 ,
关键词 小粱碱 细胞培养 生物合成
小巢碱 ( b e r b e r i n e ) 又称黄连素 ,是节基
异喳琳生物碱中原小璧碱型的一种 。 它广泛
地存在于小璧科 、 毛莫科 、 防己科 、芸香科 、 婴
粟科及鼠李科等的多种植物体 内〔` 〕 , 传统上
小璧碱就作为一种广谱抗菌 、 消炎及健 胃药
而广为应用 。 长期以来人们只能从植株中来
提取小桨碱 , 由于需求量大 ,过度采挖造成野
生资源的枯竭 以及生态环境的破坏 ; 另外栽
培上存在着一定困难 。 因此 , 寻找新的药源成
为人们所关注的问题 。 众多的研究者将注意
力放到了利用植物组织和细胞培养技术生产
小璧碱的研究上 。现结合我们的工作 , 将有关
组织和细胞中小粟碱的产生及其生物合成途
径的研究进展概述如下 。
1 培养细胞中小案碱的产生
1
.
1 愈伤组织的诱导 : 1 9 6 7 年首先从欧洲
小巢 B e ber ir : v lu g a ir : L . 的愈伤组织中分离
到了小璧碱 。 其后从不同植物的不同器官中
也诱导产 生了愈伤组织 〔, 一 5〕 , 其中小壁碱的
含量有的 已达到或超过了原植 物体中的含
量 〔, , 5 〕 。
1
.
2 影响细胞生长和小粟碱合成的因子 : 许
帝
A d d r e s s w a n峨~ D些乓, p兮p竺 t
, 2 7 岁 ,顿士 ,讲帅 。
m e n t o f B i Y u n n a n U n i v e r s i t y
王工程 。
东
已在
主要从事
,
K u n m i n g
国内刊物上发表论文 3 篇 。 理和植物生物工程的教学和科研工作
。 研究方向为植物次生代谢细胞
.
1 2 8
.
多研究表明 ,在细胞培养过程中 , 多种理化因
子对细胞的生长和小粟碱的合成有显著的影
响 。 因此 ,通过对有关理化因子的控制 ,将起
到提高细胞生长速率和小璧碱合成能力的作
用 。
1
.
2
.
1 化学因子 : 不同的培养基对细胞生长
和小璧碱合成有明显 的影 响 。 L S 、 B 。 、 S H 、
iN ct h 等 培养 基 能 促 进 日 本黄 连 C o P t is
] aP
o in “ L . 愈伤组 织 的 生 长 。 而 W hi t e 、
H e l l e r 和 E r ik s s o n 培养基则抑制生长 ;小璧
碱含量在 W hi et 培养基中最高 , B 。 和 W hi et
培养基对小巢碱的产生有促进作用 ; 日本黄
连的悬浮培养细胞在 W hi et 培养基上效果
最好〔2 , 。 6 , 7一V 培养基有利于黄连 C . c h i n e n -
5 1: F r a n e h
. 愈伤组织的生长 〔 3〕 。 粉叶小璧 B .
rP iu
o os a rF
a cn h
. 的愈伤组织在 B 。 培养基上
细胞生长和小璧碱的合成均优于 M S 培养
基〔 5〕 。
植物激素长期 以来就被认为在细胞生长
和生物碱合成中扮演着重要的角色 。 不同浓
度的 2 , 4一 D 刺激亚欧唐松草 T h al ic t ur m m i -
n u 、 L
. 培养细胞产生大量的小璧碱 ;高浓度
的 K T 和 B A 使掌叶防己碱和药根碱的合成
能力降低 , 而对小璧碱的产生没有影响〔 , ’ 6〕 。
2
,
4
一
D 和 N A A 促进亚欧唐松草悬浮培养细
胞中小璧碱的形成 ; B A 和 K T 也对小璧碱
合成有刺激作用 〔 7〕 。 在粉叶小巢的愈伤组织
培养中 , 生长素类对生长的作用效果是 2 , 4 -
D > I A A > N A A
,而 对小璧碱合成的影响效
果则是 N A A > 2 , 4 一D > I A A ;细胞分裂素中 ,
K T 在细 胞生 长和 小聚碱合成方面均 优于
B A 〔 5〕
。
蔗糖对 日本黄连的细胞生长和小璧碱的
合成最有效 ,蔗糖最适浓度为 3 % ,果糖和葡
萄糖促进细胞生长但抑制小璧碱的形成 〔2〕 。
亚欧唐松草的细胞培养中 ,硝 态氮和氨态氮
的不同 比例导致不同的结果 〔 8〕 。 提高培养基
中按离子的水平有利于原小璧碱型生物碱的
产生 , 提高培养基中铜离子浓 度也能 显著地
促进小巢碱的合成 〔的 。
硬币草药 》 1 99 8年第 29 卷第 2 期
1
.
2
.
2 物理因子 : 光抑制 日本黄连培养细胞
的生长和小璧碱的合成 , 而较高的通气量对
细胞生长和小巢碱的合成均有促进作用 〔 2〕 。
在威 氏小巢 B . 二 ils on a 。 H e m s l . 的细胞发酵
培养中 ,溶氧率能影响小璧碱的形成 , 最适溶
氧率为 50 % , 总生物碱产率可达 3 9 I/ J 培养
基口 。〕 。 日本黄连细胞发酵培养的研究中 ,许
多物理因子对细胞生长和小璧碱合成的影响
也有报道 [“ 〕。
1
.
3 提高细胞生长和小璧碱含量的方法 : 利
用 日本黄连的培养细胞进行细胞团来源的高
产无性系的筛选获得了成功 , 小璧碱含量可
达干重的 1 0 . 1% 〔2 〕和 1 3% 巨` ,」 ,产率可达 1 . 2
g I/
一 培养基 , 同时伴随着一些新技术的应用 ,
筛选的效率大为提高 。此外 , 细胞高密度培养
法 ,培养基的优化及合成前体的添加等对小
璧碱的形成也有促进作用 。 令人感兴趣的是 ,
利用黄连和黄柏的细胞融合体提高了小璧碱
的含量 ,这一实验表明利用体细胞杂交技术
提高小巢碱的含量是可能的 。 随着分子生物
学的迅速发展 。 许多相关的方法和手段也被
利 用 来促 进培 养细 胞 中生 物碱 的合成 。
K ut c ha n 等曾将 H 6 H 基因转移至大 肠杆菌
中使其高效表达 ,并且能使培养基中的蓑若
胺转化成东蓑若碱 仁` 3〕 ,这一结果吸引了人们
的注意 。 研究者们也试图通过基因调节和转
基因的方法来促进小璧碱的产生 。
2 小巢碱的生物合成
早在 1 9 1 0 年 , 人们就提 出了节基异哇琳
生物碱合成途径的假说 。 认为这类生物碱的
合成始于两个来自酪氨酸的芳香族单位 : 多
巴胺和 3 , 4一二轻苯 乙醛 。 后发现了一种能催
化 多 巴胺和 3 , 4一二轻苯 乙醛缩合形成去 甲
劳丹碱 ( n o r l a u d a n o s o l i n e ) 的酶 (去甲劳丹碱
合成酶 ) , 值得注意的是该酶与 3 , 4一二经苯
乙醛 、 4一经苯乙醛的 K m 值基本一致 , 故认为
该酶也能催化多巴胺和 4 一轻苯乙醛形成去
甲衡州乌药碱 ( n o r e o e l a u r i n e ) [“ , ` 5口。 研究认
为在节基异唆琳生物碱合成的早期阶段 ,去
甲劳丹碱合成酶能催化多巴胺和苯乙醛类物
·
1 2 9
-
质合成去甲劳丹碱和去甲衡州乌药碱这两个
合成途径中的重要中间体 l[ 6 〕。 但随后发现 ,
原来所认为的底物 3 , 4一二轻苯乙醛并不是
体内合成的前体 ,真正的前体应为 4一经苯 乙
醛 l7[ , ` 8〕 。经此酶作用 , 4 一经苯乙醛与多巴胺缩
合形成节基异座琳生物碱生物合成的第一个
中间体去甲衡州乌药碱 。 故现在将此认为是
节基异唆琳生物碱的生物合成途径 l[ 9〕 。
番荔枝碱 ( er it cu h n e )一直就被认为是节
基 异唆 琳生物碱合成的另一个重要 中间
体 20[ 〕。 由去甲衡州乌药碱形成番荔枝碱需经
过几次甲基化作用 , 它所接受的甲基由腺昔
甲硫氨酸提供 ,通过这些 甲基化作用及另一
特殊酚酶的作用 , 去甲衡州乌药碱能转化为
番荔枝碱仁2`〕 。
从小巢碱的结构上看 , 它有一个完整的
C 环 , 因此要形成小巢碱必须使番荔枝碱的
N
一甲基 形 成 所 谓 的 小巢 碱 桥 ( ber b er ien
br id ge )
。 分离鉴定了一种被称为小聚碱成桥
酶 ( B B E )的蛋白质 ,在此酶的作用下 ,番荔枝
碱 能 成 环 作 用 而 形 成 金 黄 紫 荃 碱
( s e o u l e r i n e ) [
, 2〕 。番荔枝碱必须先进入一特殊
的泡囊内才能完成这一步转化 , 有研究表明
小巢碱合成途径中后面所需的大多数酶均存
在于这一特殊泡囊结构中 2l[ 〕 。 金黄紫荃碱在
甲基转移酶的作用下从腺贰甲硫氨酸获得 甲
基 形 成 四 氢 非 洲 防 己 碱 ( t e t r a h y d r o -
e o l u m b a m i n e )
。 先前的研究曾认为 , 四氢非
洲 防己碱在四氢原小巢碱氧化酶的催化下脱
氢而形成对应的原小巢碱型生物碱非洲防己
碱 , 之后在亚甲基双氧环成环酶的催化下形
成 A 环上的特殊亚甲基双氧环结构 ,从而最
终形成小栗碱 le[ 几 但最近的研究卿〕表明 , 所
谓的亚甲基双氧环成环酶活力的增强实际上
是由该泡囊内过氧化物酶的脱甲基作用所引
起 ,而并不代表亚甲基双氧环的形成 ; 另外 ,
从小粟属 、 唐松草属 和黄连属等植物微体中
得到的一种细胞色素 P 45 。酶能使四氢非洲防
己碱形成亚甲基双氧环 , 而对非洲防 己碱则
不 起作用 21[ 〕。 正是 因 为这 种氢化可、 璧碱
·
1 3 0
.
( c a n a id n e )合成酶的底物特异性 , 四氢非洲
防己碱能在其作用下形成氢化小巢碱 。 小巢
碱合成的最后步骤由四氢原小巢碱氧化酶或
氢化小璧碱氧化酶催化 ,利用氢化小巢碱为
底物氧化脱氢而最终形成小璧碱 。此外 ,许多
研究也发现小巢碱并非代谢的终产物 l0[ 〕 , 它
还能进一步转化为药根碱 ( ja t r o r r h i z i n e ) 。
现将当前认为的小巢碱生物合成的主要
途径概述于图 1 。 此途径已在黄连属〔川和唐
松 草属 25[ 〕中发 现 , 在 小璧属 中可能 也存
在 阳 ` 〕 。 小璧碱生物合成途径的阐明及途径中
控制各步 反应的酶的分离鉴定 , 为人们从底
物和酶水平调节其代谢途径打下了基础 。 按
次生物质合成途径的模式 图嘟〕来看 , 小巢碱
生物合成的重要中间体应为番荔枝碱 。 番荔
枝碱能在 B B E 的作用下 ,通过氧化成环作用
而形成所谓的小巢碱桥 , 从而构成原小巢碱
生物碱 的基本骨架— 金黄紫荃 碱 , 因 此
B B E 被认为是小栗碱合成途径中的第一个
关键酶 ,将 。 D N A 克隆得到 的编码 B B E 的基
因转入昆虫培养细胞中获得了高水平的表
达卿〕 ;此外还认为四氢原小粟碱氧化酶也可
能是一个关键酶 , 因为它在使 C 环芳香化中
起重要作用 , 只有经过这一步氧化后才能最
终形成小梁碱 28[ 〕 。
3 结语
通过对控制各步骤的酶的深入研究 ,将
外源克隆的生物碱代谢基因转入植物体或培
养细胞中也许会为植物生物工程的商业化应
用提供一个机会 ,但总的来说 ,一种生物碱的
合成是由多种酶在时空顺序上表达所控制的
多级代谢所构成 , 因而单独某一基因的过表
达并不总是能导致代谢终产物的产量 明显增
加 sz[ , 2 9 〕。 提高限速酶活力的转基因方法仅能
使有限的代谢步骤得以改进 , 用次生物质的
植物生物工程的应用 , 可能主要应依靠对控
制一系列合成基因的调节基因的分子克隆来
实现 仁2 ,〕 。 相信随着对代谢调节基因和生物碱
合成胞 内定位研究的深入 , 植物次生代谢生
物工程必将发生深刻的变化 , 人为控制 目的
物的生产将不再是一个遥远的梦 。
多 巴玻
自谧夕HO 、 ` 尹
璐氮徽
4一 轻笨乙筱 去甲衡州 乌药被 衡州乌药喊 N 一 甲羞衡州乌药孩
3一轻羞 . N 一 甲羞衡州乌药碱 番芬枝喊 金黄紫盆银 四氢非州 防己碱
H .呈黔讯户愧 、碎丫 , `丫J c H · 、 尹丫c H · \ 产丫 c H 。\ 子外。 e H , 恢洛少与e H . 、 声。 c H :
药根孩
图 1
小雄雄
小果碱的生物合成途径
公化小维孩
注 : 1一去甲衡州乌药碱合成酶 2一去甲衡州鸟药碱一 6 ` 一 O 一甲基转移酶 3一衡州乌药碱 N 一甲基转移酶 4一酚酶 ( ?) 5 -
4 ’ 一 O 一甲基转移酶 6一小粟碱成桥酶 7 一金黄紫茧碱 一 9 ’ 一 O 一甲基转移酶 8一氢化小巢碱合成酶 9一四氢原小巢碱氧化酶或
氢化小粟碱氧化酶
参 考 文 献 1 7 R u e f f e : M , e : a z . 2 N a t u r fo r s e h , 1 9 5 7 , 4 2 2 : 5 1 9
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手册 . 北京 : 人民卫生出版社 , 1 9 5 6 . 1 2 0 s u e C u l t u r e · Y a m a d a Y ( e d s ) C h i e h e s t e r : W i l e y , 1 9 8 8·
2 F u j iw a r a A ( e d s )
.
I n P l a n t T i s s u e C u l t u r e 1 9 8 2
.
P
r o 一 2 1 3
e e e d i n g
s . s t h I n t l C o n g p la n t T i s
s u e & C e l l C u l t u
e ,
1 9 H e r b e r t R B
.
I n T h e B i o s y n t h e s i
s o f S e e o n d a r y
T o k y o
:
J
a Pa n , 1 9 8 2
.
3 1 1
、
3 1 3
、
3 15
、
3 1 9 M e t a b o li t e s
.
L o n d o n
:
C h a p m a n a n d H a l l
,
1 9 8 9
.
1 4 1
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4 茵和恺 ,等 . 中药材 , 2 9 90 , 1 3 ( 3 ) : 3 n o lin e A lk a o id s . p h i l l i s o n J D , e t a l ( e d s ) . Be r li n :
5 李启任 ,等 . 云南植物研究 , 1 9 9 5 , 2 7 ( 3 ) : 3 2 5 S p r i n g e r 一 V e r l a g , 1 9 8 5 · 2 1 3
6 J k u t a A
, e t a l
.
P h y t o e h e m i s t r y
,
1 98 2
,
2 1
:
1 4一9 2 1 H a s h i m o t o T . e t a l . A n n u R e v P la n t P h y s i o l M o l B i o l ,
7 N a k a g a w a K
, e t a l
.
P la n t C e ll R e p
,
1 9 8 6
,
5
:
6 9 19 9 4
,
4 5
:
2 5 7
8 H a k a g a w a K
, e t a l
.
P la n t C e ll R e p
,
1 9 8 4
,
3
:
2 5 4 2 2 S t e ff e n s P
,
et a l
.
T e t r a h e d r o n L e t t
,
1 95 4
,
2 5
:
9 5 2
9 M o r im o t o T
,
et a l
.
A g r i e B i o C h e m
,
1 9 8 8
,
5 2 ( 7 )
:
1 8 3 5 2 3 aB
u e r
W
,
et a l
.
BO
t A e t a
,
1 99 2
,
10 5
:
3 7 0
1 0 K e r i s W
, e t a l
.
P la n t a M e d
, 1 9 8 9
,
2 5 7
:
12 7 2 4 M u l le r M J
, e t a l
,
P l a n t a M e d
,
1 9 9 2
,
5 8
:
5 2 4
1 1 F u ji t a F
, e t a l
.
In A p p l i e a t l o n o f P l a n t C e l l a n d T i s s u e 2 5 G a l n e d e r E
.
e t a l
.
In P r o g r e s s i n p la n t C e llu la r a nd
C u l t u r e
.
Y a m a d a Y ( e d s ) C h i e h e s t e r
:
W i l
e y , 1 9 5 5
.
2 2 5 M o l e c u la r B i o lo g y
.
N ijk a m p H J J
, e t a l ( e d s )
.
D o r
1 2 Y a m a d a Y
,
et a l
.
P h y t o e h e m i
s t r y , 1 98 5
,
2 4
:
6 3 d r e e h f
:
K lu w e r
,
1 9 9 0
,
7 5 4
1 3 K u t e h a n T M
.
F E B S L e t t
,
1 9 8 9
,
2 5 7
:
1 2 7 2 6 Y e o m a n M M
.
et a l
.
I n P la n t C e ll C u l t u r e
:
R e s u l t s a n d
1 4 R u e f f e r M
, e t a l
.
F E B S L e t t
,
1 9 8 1
,
1 2 9
:
5 P e r s p e e t i i v e s
.
S a la F
.
e t a l ( e d s )
.
E l s e v i e r N o r th
一
H o l
-
1 5 A n de r s o n L A
, e t a l
.
I n A d v a n e in g in B i o e h e m i
e a l E n g i
一
la n d B i o e h e m i e a l p r e s s
,
1 98 0
.
3 2 7
n e e r in g / B i o t e e h n o lo g y
.
F i e e h t e r A ( e d s )
. 氏 r lin : 2 7 K u t e h a n T M . J p la n t p h y s i o l , 19 94 , 4 2 ( 4 ) : 5 0 2
S p r in g e r
一
V e r la g
,
1 9 8 5
.
3 1
:
8 2 8 eD
s e e n z o R A
, e t a l
.
P l a n t M o l B i o l
,
1 9 9 3
,
2 2
:
1 1 3
1 6 z e n k M H
,
et a l
.
I n T h e C h e m i s t r y a n d B io lo g y o f xs o
一
2 9 S o n k s t a d D D
.
e t a l
.
p l a n t p h y s i o l
,
1 9 9 0
,
9 4
:
1 4 1 0
q u in o lin e A l k a o id s
·
p h i lli s o n J D
,
et a l ( e d s )
·
eB
r l in
:
( 1 9 9 7
一 0 6一 1 0 收稿 )
S p r i n g e r
一
V e r la g
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1 98 5
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《中草药 》 2 99 8 年第 2 9 卷第 2 期 . 1 3 1 .