全 文 ：· 综述与专论 ·
中药材品种高特异性 PCR 鉴别原理及其应用前景△
南京师范大学遗传资源研究所(2 10 0 9 ) 7
中国药科大学生 药学研究室
王义权.
徐洛珊
周开亚
徐 国钧
摘 要 中药材品种高特异 性 PR C鉴别是新近 报道的一种具有 实用价值 的中药材品种分 子遗传
标记鉴别方法 。 概述 了中药材 品种 高特异性 R C P鉴别的原理 , 归纳 了鉴别引物 的设计原则 , 展望
了该方法在 中药 材品种鉴定中良好 的应用前景 。
关键词 P C R 鉴别 原理 生药鉴定
随着分子生物学技术的迅速发展 , D N A
分子标记技术已越来越多地用于中药材品种
鉴别的研究 仁` 一` ’ 4〕 。 在已有的研究报道 中使用
的鉴别方法可归为三类 : 1) 基于 P C R 反应的
方法 , 包括 R A P D 、 A P 一 P C R 、 微卫星 D N A 和
扩 增 片 段 长 度 多 态 ( A m p l i f i e d F r a g m e n t
L e n g t h p o l y m o r p h i s m
,
A F L P ) 等 ; 2 ) 限制性
片段长度多态 ( R e s t r i e t i o n F r a g m e n t L e n g t h
P o l y m o r p h i s m
,
R F L P ) 和 P C R 产物的 R F L P
分析 ( P C R 一 R F L P ) ; 3 ) D N A 测序 , 已报道 了
5 5 r R N A 间隔区 、 I T S I 、 I T S Z 、 C y t b 和 1 25
r R N A 等基因片段的序列分析 2[, ” 一 ` ’〕 。 然而 ,
在中药材 品种鉴定的实际工作中 , 所有这些
D N A 分子标记鉴别方法都有一定的局限性 。
因此 , 国内外研究者们都在寻找更为实用 、 方
便的新方法 。 最近我们报道 了在蛇类药材的分
子标记鉴别 中 , 借助高特异性的鉴别引物 , 成
功地鉴别了金钱白花蛇及其伪品 。 这一方法适
用于动物类和植物类药材的 D N A 分子标记
鉴别 , 同时具有准确 、 快速 、 简便 、 价廉 、 重现性
好等优点 ,是一种有推广价值的分子标记鉴别
方法 z0[ ,川 。 笔者就已报道过的中药材分子标
记鉴别方法的不足和高特异性 P C R 鉴别方法
的原理及其应用前景讨论如下 :
1 几种中药材分子标记鉴定方法的局限性
A P
一
P C R 或 R A P D 标记 都是 用任意核
昔酸序列 的单 一引物 进行 P C R 扩增 , 比较
D N A 的多态性 , 从而区 分不同基源的药材 。
由于该方法在扩增反应时使用的是低温复性
(通 常为 3 6℃ ) , 特 异性 不高 , 引物 与模板 间
有较高的错配率 , 结果容易受 到多种 因素的
影响 ,不同的实验室之间有时不能重复 。 即使
在同一实验室内 ,每次检测样品时 ,均须用已
知的正品药材作为对 照 , 同时进行 A P 一 P C R
或 R A P D 扩增反应和电泳检测 , 才能比较正
品药材 与待检样品扩增产物 电泳图谱的异
同 ,得到较为准确的鉴定结果 。 此外 , 该方法
要求 P C R 模板 的 D N A 质量高 、 定量 准 , 操
作要求较严格 2[ 〕 ,检验成本相对较高 。
微卫星 D N A 、 A F L P 和 R F L P 分析只适
用于 D N A 未明显 降解 的新 鲜材料 , 中药材
在加工 、 贮运过程中 , D N A 一般均已严重降
解 , 因此这些方法也难用于商品药材的鉴别 。
虽然 P C R 一 R F L P 分析能通过 P C R 扩增出特
定的 D N A 片段 , 再经限制性 内切酶分析 , 以
寻找多态性位点 , 达到鉴别的目的 ,克服了商
品药材中 D N A 降解的困难 ,但 P C R 扩增的
片段长度有 限 ,通 常仅 能扩增 出 1一 1 . 5 k b
`
A d d r e s s
:
W
a n g Y iq u a n
,
N a n ji n g N o r m a l U n i v e r s i t y
,
王义权 男 , 1 9 5 7 年 1 2 月生 ,博士学位 , 教授 , 从事分子 记和生药鉴定研究 . 完成国家 “ 八 。 五 ” 攻关项 目 2 子专
题 , 国家自然科学基金 2 项 。 现主持国家自然科学基金 1 项 , 江苏省 “ 3 33 ” 人才培养基金 1 项 , 江苏省教委科学基金 1 项 。 已发表论文 4 0 篇 , 合编专著 1 部 ,发 明专利 1 项 。
△ 国家自然科学基金 ( N o . 3 9 5 7 0 8 6 5 )和 中国博士后科学 羞金 ( N o . 1 9 9 6〔2〕) 资助项 目 , 基金资助批准号 N o . 3 9 8 70 9 13
.
6 2 8
.
以下 的 D N A片段 , 这样可找 到的能用于药
材品 种 鉴 别 的 限制 性 位 点 数 有 限 , 因此
P CR
一
R F L P 的应用 目前仍有困难 。 加之这些
检测方法需要价格较为昂贵的内切酶 ,操作
较繁琐 ,成本高 。
用 P C R 产物进行测序的方法 ,能对特定
的基因片段进行精确的序列分析 , 重现性好 ,
鉴定结果准确可靠 。 不足之处是 D N A 测序
成本高 , 目前一个约 4 0 0 b p 的 D N A 片段测
序所消耗的试剂至少为 50 一 10 元 /样 , 这 尚
不包括 D N A 提取和 P C R 扩增的费用 , 用 自
动测序仪测序则需 4 0 0 元 /样 。 D N A 测序实
验操作复杂 ,任何少量的 D N A 污染 ( 如空气
中的花粉 、 抱子 和细菌 , 操作人员的头屑等 )
都会造成假 阳性扩增 , 致使测序 的片段来 自
D N A 污染物 , 出现鉴定错误 。 如 P C R 产物经
克隆后测序 ,无论是实验周期还是费用上都
还将大大增加 。 因此 D N A 序列分析方法由
于检测成本和仪器设备等要求都很 高 , 在药
材鉴定的应用 中 , 特别是在药检部门进 行常
规检验的应用中目前不易实现 。
2 中药材高特异性 P C R 鉴别
2
.
1 基本原理 : 常规 P C R 的 目的是 扩增 出
研究对象的某一特定基因片段 。 这需要在待
扩增的特定基 因片段的上 、 下游 找到一个 高
度保守的区域 , 根据此 区域 中的 D N A 序列
资料 , 设计一对引物 ,这对引物通常称 为通用
引物 ( u n iv e r s a l p r im e r s ) 。 用此引物就可 以对
研究对象的特定基因片段进行有效 的扩增 。
在特定的基 因片段得到大量扩增后 ,将 其分
离纯化 ,进而对该基因段进行克隆 、 测序等方
面的研究 。
中药材高特异性 P C R 鉴别则是根据正
品及其伪 、 混品药材 生物 特定 区 域 的 D N A
序列数据 , 设计有高度特异性的某种正 品药
材的鉴别引物 。与通用 引物不 同的是 ,这对引
物在 P C R 扩 增 时只 能对 来 自正 品药材 的
D N A 模板 中特定的区域进行有效 的扩增 ,而
对来 自伪 、 混 品或其他 生物的 D N A 模板 中
的该区域不能进行扩增 。 当有样品待鉴定时 ,
《中草药 》 1 9 9 9 年第 3 0 卷第 8 期
从 待鉴定样 品 中提取少 量 D N A , 以 此 为
板 , 用高特异性的鉴别引物在适 当的条件 l
进行 P C R 扩 增 , 然后 电泳检测扩增结果 , 如
为阳性 , 则为正品 药材 ,否则 即非正 品药材 ,
这样便可准确地判断被检物的真伪 。 高特异
性 鉴别 引物设计 所依 据的 D N A 序列 资料 ,
一方面可 以通过对相关物种的 D N A 进行测
序研究 得到 , 另一方面有些物种的 D N A 序
列资料可以通过计算机网络 , 从 G e n B a n k 或
EM B L 等 D N A 数据库 中直接查得 。
2
.
2 引物设计 : 高特异性 P C R 鉴别引物的
设计 , 除遵循一般引物设计原则外 ,还须考虑
到以下原则 : 1) 要在被鉴别的物种种内变异
很小 ,但与伪 、 混 品间差异较大的 D N A 分子
区域寻找标记 。 如我们在金钱白花蛇的 P C R
鉴别研究中的 C yt b 基因片段脚〕 。 2) 设计的
鉴别引物与正品物种在上述 D N A 分子区域
内有合适的引物结合位点 , 与模板 D N A 在
此位点上的碱基配对 比例极高 , 并确保 引物
3’ 端与模板完全配对 ; 而引物与伪 、 混品间在
此 D N A 分子 区域 内无合适 的结合位点 , 即
引物的碱基与伪 、 混品 的 D N A 碱基 间能够
配对 的 比 例尽 量低 , 特 别是 引物 的 3`端 与
伪 、 混品模板间的碱基不能配对 。 3) 由于药材
中的 D N A 多 已发生不 同程度 的降解 。 因此
设计的引物在上述分子区域 内扩增的片段不
易过大 ,在便于检测的前提下 以小一些为好 ,
一般为 10 0一 3 0 b p , 以保证 阳 性样品 的有
效扩增 。 4) 设计的引物 T m 值以高一些为好 ,
即引物应有足够长度的同时尽量提高 G C 含
量 。 并且两引物 T m 值要匹配 , 以便达到高严
谨条件下扩增的 目的 。 T m 值的计算方法为 :
T 二 一 (G + C ) X 4 + ( A + T ) X Z ,
其中 G , C , A , T 分别为 引物中 G , C , A , T 的数
目 。
5 ) 31 端最好选择 A ,而尽量避免用 T 。 在
同样条件下 , 当 3’ 端错 配时 , 末 位碱基是 T
时引发效率最高 , 而末位碱基是 A 时引发效
率 最低 23[ 〕 , 这样可 以 降 低假 阳性 的 出现 概
率 ,提高鉴别的准确性 。
.
6 2 9
.
新设计 的鉴别引物是否有效 , 要通过鉴
别试验来检验 。 当用鉴别引物对正品和伪 、 混
样品的 D N A 进行高特异性 P C R 鉴别 时 , 如
仅能扩增 出正 品药材 的特定 D N A 片段 ,而
伪 、 混品种无相应的扩增片段 , 则该鉴别引物
可用于该 正品药材的高特异性 P C R 鉴别 ; 如
两者都扩增出特定 D N A 片段或都没有扩增
出 D N A 片段 , 则该鉴别 引物 尚不 能对这种
药材进行高特异性 P C R 鉴别 , 需修改引物 的
设计 ,直至鉴别引物只能特异性地 扩增 出正
品药材的特定 D N A 片段为止 。
2
.
3 反 应 的条 件 和 结 果 检 测 : 高 特 异性
P C R 鉴别反应条 件与普通 P C R 基 本一样 ,
但 在 P C R 循 环 中复 性 温 度 较 高 , 一 般 在
6 0 ℃左右 。 在这样的 P C R 扩增条 件下 , 如果
引物设计合理 ,假 阳性出现概率可以 降至 O ,
而不影响正品药材的 P C R 扩增 。 P C R 产物
用 0 . 8% ~ 1 . 2%的琼脂糖凝胶电泳 , 紫外灯
下观察有无特定 D N A 片段 的扩增 , 如有则
为正品 , 否则为其他品种 。 可见只要有 了鉴别
引物 ,样品检验将非常简单咖〕 。
3 前景展望
分子遗传标记用于中药材品种鉴别首先
遇到的是实用性 问题 。 分子生物学研究 中的
各种试剂和其他消耗 品一般都较 昂贵 , 因此 ,
鉴别试验的步骤越多 , 过程越复杂 , 其鉴别成
本就越高 。 其次 ,是鉴别实验的操作是 否易于
掌握 ,鉴别结果的准确性如何 。
在一定研究积累的基础上 , 设计 出某种
药材品种的鉴别引物后 , 当有样 品待检时 , 只
需经 D N A 提取 、 高特异性 P C R 扩增和 电泳
观察三步即可完成鉴别 。 用鉴别引物开发出
药材品种鉴定用 的检测试剂盒后 , 一个熟练
的检验人员 3 ~ s h 便可检验数十个样 品 ,而
全部成本按现行各种试剂和消耗品的平均价
计算 ,也不会超过 5 元 /样 。 可见中药材的高
特异性 P C R 鉴别有很 高的实际应用价值 。
由于步骤简化 ,操作简单 ,有一定专业基
础的人 ,无需任何训练即可掌握 。从我们对金
钱 白花蛇及其伪品的 P C R 鉴别试验结果看 ,
对正 品与伪品的鉴别 正确率达到 10 0% 2l[ 〕 ,
重现性很好 ,表明鉴别结果准确可靠 。 此外 ,
还能在混合粉末中检测出有无正品金钱 白花
蛇成分的存在 。 这一方面表明该方法能抗生
物源的污染 , 对实验环境条件的要求较简单 ,
不会 因为有少量的 D N A 污染而对鉴定结果
的正确性产生影响 。另一方面也提示 ,该方法
有可能成为中药复方制剂中用药组分的检测
手段之一 。
与其它 D N A 分 子标记 鉴别方法一样 ,
由于生物体 内的遗传信息不随生物发育的不
同阶段而变化 , 同一个体的成 、 幼体阶段和同
一个体的不同器官具有 同样的遗传信息 , 因
此 高特异性 P CR 鉴别不能区别 出个体的发
育阶段 (即成 、 幼体 )和同种 的器官组织的差
异 。此外 , 这种方法虽能在混合组分中检测出
是否有正品药材成分的存在 , 但尚不能确定
混合成分中被检测组分的含量 。
参 考 文 献
l 王义权 ,等 . 中国中药杂志 , 1 9 9 7 , 2 2 ( 1 0 ) : 58 3
2 S h a w P C
,
et a l
.
J F
o o d a n d D r u g A n a l
,
1 9 9 7
,
5 ( 4 )
:
2 7 3
3 王义权 ,等 . 药学学报 , 1 9 9 7 , 32 ( 5 ) : 3 8 4
4 吴 张 ,等 . 中草药 , 1 99 8 , 2 9 ( l ) : 3 7
5 张 荣 ,等 . 中草药 , 1 9 9 6 , 2 7 ( 1 1 ) : 6 8 6
6 张 荣 ,等 . 中国中药杂志 , 19 9 7 , 2 2 ( 2 ) : 7 2
7 曹 晖 ,等 . 中药材 , 1 9 96 , 1 9 ( 12 ) : 6 0 8
8 曹 晖 ,等 . 中国中药杂志 , 19 9 7 , 2 2 ( 4 ) : 1 9 7
9 C a o H
, e t a l
. 药学学报 , 19 9 6 , 3 1 ( 7 ) : 5 4 3
10 C h e u n g K S
, e t a l
.
J E t h n o p h a r m a e o l
,
1 99 4
,
4 2
:
6 7
11 N a k a i R
, e t a l
.
B io l P h a r m B u ll
,
1 9 9 6
,
19 ( l )
:
6 7
12 S h a w P C
, e t a l
.
P l a n t a M e d
,
19 9 5
,
6 1
: 4 6 6
13 Y a m a z a k i M
, e t a l
.
B i o l P h a r m B u l l
,
1 9 94
,
17 ( 1 1 )
:
1 52 9
14 K o h jy o u m a M
, e t a l
.
iB o l P h a r m B u l l
,
1 9 9 7 ; 2 0 ( 5 )
:
50 2
15 王建云 , 等 . 中国药科大学学报 , 19 96 , 2 7 (8 ) : 4 71
1 6 王建云 , 等 . 中国中药杂志 , 1 9 97 , 22 ( 10 ) : 5 7 9
1 7 吴 平 , 等 . 药学学 报 , 1 9 9 8 , 3 3 ( 3 ) : 2 26
1 8 吴 平 , 等 . 药学学报 , 1 9 9 8 , 3 3 ( 4 ) : 3 0 4
1 9 M i z u k a m i H
.
B io l P h a r m B u l l
,
1 9 9 5
,
1 8 ( 9 )
:
1 29 9
20 王义权 , 等 . 南 京大学学 报 ( 自然 科学版 ) , 19 97 , 3 3( 博
士后专辑 ) : 13 6
2 1 王义权 ,等 . 药学学报 , 1 9 98 : 3 3 ( 12 ) : 9 4 1
2 2 M u ar lid h a r a n K
,
et a l
.
B io T e c h n iq u e s
,
1 9 9 3
,
1 4 ( 3 )
:
3 6 2
2 3 K w o k S
, e t a l
.
N u e l A e id s R e s
,
1 9 9 0
,
1 8 ( 4 )
: 9 9 9
( 1 9 9 8
一
0 8
一 1 4 收稿 )
.
6 3 0
.