全 文 ：HPLC-ESI /MS法分析大豆胚芽中的异黄酮
——大豆异黄酮和皂苷的研究 (Ⅲ )
无锡轻工业大学食品学院 ( 214036)　　谷利伟 　谷文英
无锡轻工业大学分析中心　　　　　　陶冠军　　秦　
摘　要　以 HPLC-ESI /M S对大豆胚芽中的异黄酮进行了定量和定性分析 ,表明 ESI /MS能够灵敏而准确地反应
色谱峰成分的结构特征 ,解决了 HPLC分析过程微量和不稳定的异黄酮的色谱峰的定性难题 ,以少数的标样即可
对所有结构的异黄酮进行定量。
关键词　大豆　异黄酮　 HPLC-ESI /M S
HPLC-ESI /MS Analys is of Isoflavones from Soy Hypocotyl (Ⅲ )
　　 Schoo l o f Food, Wux i Univ er sity o f Ligh t Industr y (Wuxi 214036)　 Gu Liwei and Gu Wenying
　　 Ana ly tical Cente r, Wuxi Univ ersity of Light Indust ry　 Tao Guanjun and Qin Fang
Abstract　 　 Various isof lav ones f rom soybean hypoco tyl w ere analy zed quanti ta tiv ely and
qualitativ ely by HPLC-ESI /M S. It rev ealed tha t ESI /M S could identi fy the unstable and minor isof lav one
isomer peaks with high sensi tivi ty and accuracy. All isof lav ones could be quanti tativ ely analy zed w ith the
aid of ESI /M S. The components of isof lav one in di fferent pa rts of soybean and i ts dif ference caused by
treatments w ere analy zed and compa red by means of this method.
Key words　　 so ybean　 iso flavones　 HPLC-ESI /M S
　　大豆异黄酮能降低乳腺癌、前列腺癌等的发病
率 ;缓解更年期因雌激素分泌减少而引起的更年期
障碍和骨质疏松症 ;是大豆食品使血液胆固醇下降
的关键物质 [1 ] ,对大豆食品中异黄酮的准确定性定
量分析是研究异黄酮生理作用的基础。
以常规的反相 HPLC结合 260 nm紫外检测的
方法测定大豆中的异黄酮有一定的难度。 大豆中的
异黄酮有 12种 ,其中约 68%以丙二酰化的糖苷形
式存在 ,但这种形式极不稳定 , 5℃贮存 5 d即自动
水解为糖苷 [2 ]。丙二酰糖苷干热处理后分解得到天
然大豆中不存在的乙酰化的糖苷。以上异黄酮成分
或不稳定或含量极少 ,不易得到标样进行定性。大豆
中异黄酮的组成成分因品种、加工方法的差异变化
极大 ,以紫外吸收检测时存在酚酸等化合物的干扰 ,
使紫外检测不易对微量的或不稳定异黄酮的色谱峰
作准确定性 ,可能使分析出现较大的误差。液质联用
技术解决了色谱峰的定性问题。 电喷雾电离 ( ESI)
是一种新的液质联用接口技术 ,色谱流动相通过一
个带电荷的毛细管喷入质谱的入口锥孔处 ,同向吹
入的氮气流将挥发的溶剂带走 ,带电荷的液滴在静
电力的作用下最终分散成单个分子进入质谱的下一
级入口锥孔中。 ESI是一种温和的“冷”电离方式 ,适
合分析热不稳定的化合物 [3 ]。
大豆胚芽是大豆的生殖器官 ,占大豆总重量的
2%～ 2. 5% ,组成成分独特 ,其中异黄酮的含量是子
叶中的 8～ 10倍 ,其中 glycitin和 so yasaponin A仅
分布于大豆的胚芽中 [4 ]。 本文以 ESI /M S做 HPLC
色谱峰的定性鉴定 ,对大豆胚芽中的异黄酮进行定
量分析。
1　实验方法与材料
1. 1　标样配制: daidzin, g enistin, g lyci tin, daidzein
和 genistein为 Sigma公司产品。取标样溶于适量的
95%乙醇中 ,取少量的标样溶液稀释到吸光度 0. 3
～ 0. 8之间 ,标样的浓度按最大吸收波长处的摩耳
消光系数计算 ( daidzein& daidzinλmax= 254 nmε=
10
4. 45
; g lyci tinλmax = 260 nmε= 104. 42 ; g enisten &
genistinλmax= 260 nmε= 104. 51 ) ,标样的纯度以各
自最大吸收波长处的 HPLC峰面积除以总峰面积
得到 ,标样的最终浓度根据其纯度校正。丙二酰及乙
二酰基异黄酮糖苷以相应的糖苷为标样定量 ,以分
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Address: Gu Liw ei, Sch ool of Food, Wuxi University of Light Ind us try, Wuxi谷利伟　男 , 1972年生 ,博士研究生 ,研究方向为中草药与功能食品。 参加一项国家自然科学基金研究 (抗氧化中草药的筛选与成分研究 ) ,目前的研究题目是大豆异黄酮和皂苷 ,已在国内外发表论文 10余篇。
子量差异校正峰面积的响应因子 [5 ]。
1. 2　样品提取:单一品种东北大豆的胚芽粉碎后过
80目筛 ,准确称取胚芽约 250 mg 3份。第一份放入
25 mL容量瓶中 ,加 80%乙醇到接近刻度 , 80℃保
温热浸 6 h;第二份直接放入 25 mL容量瓶中超声
波发生器中冷浸 6 h;第三份胚芽样品 120℃烘 2 h
后放入 25 m L容量瓶中超声提取 6 h。全部 3份样
品提取后 ,冷到室温定容 ,静置过夜 ,取上清液以
0. 45μm膜过滤后做 HPLC分析。来自同一品种大
豆的子叶、豆皮的提取方法同胚芽的冷浸法。
1. 3　 仪器与方法: 分离单元 为 Waters 2690
separation module。 Supelcosi l C18色谱柱 25 cm×
4. 6 mm, 30%～ 60%的甲醇直线梯度 (流动相中含
乙酸 0. 5% )洗脱 ,分析时间 40 min,进样量 20μL。
使用 Waters 996二极管阵列检测器 ,扫描波长 200
～ 450 nm。Micromass电喷雾质谱仪作柱后检测 ,分
流三通分流比 1 /10。 ESI /M S : capilla ry v ol tage
4. 05 kV , cone 110 V , ex tracto r 5 V , source blo ck
tempera ture 120℃ , desolv ation temperature 250
℃。 ESI-/M S: capi llary v ol tage 3. 7 kV, cone 90
V。 分析系统: Masslynx chroma tog raphy analytic
system on Digi tal personal w o rksta tion。
2　结果与讨论
2. 1　异黄酮的 HPLC分离与 ESI /M S特征: 大豆
子叶与胚芽中异黄酮以 260 nm紫外检测的 HPLC
分离结果如图-1A, B所示 ,冷浸大豆子叶的异黄酮
组成比较简单 ,而胚芽的异黄酮组成相对复杂。胚芽
HPLC谱中保留时间最长的 3个微量组分是 3种异
黄酮的苷元。异黄酮的糖苷、丙二酰化及乙酰化糖苷
的极性相当 ,比例受样品处理方法的影响大 ,微量的
乙酰化异黄酮糖苷的色谱峰常混杂在丙二酰化异黄
酮之间 ,在没有糖苷标样或标样种类有限的情况下
很难对它们的色谱峰进行定性。 冷浸大豆胚芽异黄
酮的总离子流色谱图 (图 -1C)与 260 nm检测的
HPLC图相似 ,以 ESI /M S的 m /z 255. 3为选择离
子检测色谱峰中以 daidzein(分子量为 254. 3)为苷
元的异黄酮色谱峰位置 ,得到 4个色谱峰 (图 1-D)。
图 2是图 1-D中前 3个非苷元异黄酮色谱峰相对应
的 ESI /M S图谱 ,这三种组分的 [M+ H ]+的准分子
离子峰分别为 m /z 417. 2, 503. 2和 450. 2,很容易
地判断其结构是 daidzin, 6″-malonyldaidzin和 6″-
acety ldaidzin。二极管阵列检测显示它们的紫外吸收
光谱相同 ,最大吸收为 254 nm,与 daidzein的标样
相同。它们的分子式与结构变化关系如图 3。以上 3
种糖苷型异黄酮组分的 ESI /M S都以苷元 daidzein
的 [M+ H]+离子 m /z 255. 3为基峰 ,表明异黄酮苷
的糖苷键键能较低 ,在电场中被加速和电离的过程
中容易发生断裂 ,而断裂得到的苷元很稳定 ,形成基
峰。在质谱中未观察到 6″-malony ldaidzin脱羧形成
的 [M - 44]+ 峰 ,表明在电喷雾电离过程中样品受
热不明显 ,未发生脱羟反应。以 m /z 285. 3和 271. 3
为选择离子可以鉴别出以 g lyci tein和 genistein为
苷元的异黄酮的色谱峰 ,它们的乙酰化糖苷含量少 ,
在本实验中未检出。
A-冷浸大豆子叶异黄酮　 B-冷浸胚芽异黄酮　 C-冷浸胚芽
异黄酮 ESI /M S总离子流谱　 D-冷浸胚芽异黄酮的 m /z
255. 3的选择离子谱　峰 a、 b、 c、 d、 e、 f、 g、 h、 i、 j见表 1
图 1　样品检测图谱
A为 d aid zin　 B为 6″-malony1daidzin　 C为 6″-acetyl-daid zin
图 2　以 daidzin为苷元的 3种糖苷型异黄酮的 ESI /
MS图
异黄酮的紫外吸收是由苷元部分决定的 ,受糖
苷的影响不大 ,所以在能确定各个异黄酮色谱峰的
位置后 ,可以以容易分离的 3种异黄酮苷元为标样
对所有结构的异黄酮进行定量。
2. 2　不同处理方法对胚芽中异黄酮组成的影响: 大
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豆子叶与胚芽的异黄酮组成差异明显 ,子叶中不含以
g lyci tein为苷元的异黄酮 (表 1) ,主要组分以
daidzein和 genistein计算的比例约为 35∶ 65。胚芽
中异黄酮的含量达 3. 33% ,是子叶含量的 6倍 ,主要
成分以 daidzein, gly citein和 genistein计算的比例约
为 55∶ 30∶ 15, Kudou( 1991)报道 3种成分的比例
为 4∶ 5∶ 1,这种差异可能是由于所分析的大豆的品
种不同 [ 4]。豆皮的提取物中未检出异黄酮的存在。
图 3　以 daidzein为苷元的 4种异黄酮的结构变化
表 1　不同处理方式对胚芽中异黄酮组成的影响
(单位 mg /100 g)
成分 冷浸胚芽热浸胚芽 干热处理胚芽
冷浸大
豆子叶
daidzin( a) 368 1210 239 43. 1
glyci tin( b) 249 656 252 -
genist in( c) 154 201 256 63. 8
malonyldaid zin( d) 145 280 452 121
malonylg lyci tin (e) 534 430 194 -
acetyldaid zin( f ) 82. 4 278 941 -
malonylg enisi tin( g) 475 228 516 237
daidzein(h ) 59. 5 31. 0 65. 2 4. 8
glyci tein ( i ) 10. 4 11. 5 24. 1 -
genistein( j) 0. 6 14. 6 30. 6 -
Total 3331 3341 2971 469
　　冷浸的大豆胚芽中丙二酰型异黄酮的含量为
73% ,乙酰型糖苷和苷元的含量仅为 2. 5%和
0. 5%。胚芽以溶剂热浸后丙二酰糖苷型异黄酮的比
例下降到 28% ,而相应糖苷的含量由 23%升高到
62% ,表明丙二酰糖苷型异黄酮是天然异黄酮的主
要存在形式 ,在溶剂中受热后分解成糖苷。胚芽干热
处理后丙二酰糖苷型异黄酮的含量下降 34% ,乙酰
化糖苷的量上升 28% ,显然乙酰糖苷型异黄酮是由
丙二酰干热处理后脱羧的产物。
大豆异黄酮结构的变化使不同豆类食品中的异
黄酮的组成差异较大 ,豆浆和醇法浓缩大豆蛋白中
以异黄酮糖苷为主 ,在膨化大豆制品和烘烤的小食
品中乙酰化糖苷的比例较大 ,发酵大豆食品中的异
黄酮几乎全部是苷元 [2 ]。 这种组成的差异可能会影
响到食品的风味 [6 ]及异黄酮的生物利用度 [ 7]。
参 考 文 献
1　 Kenneth P R. Am J Clin Nut r, 1998, 68(suppl ): 1338s
2　 Wang H J, Mu rph y P A. J Ag ric Food Chem, 1994, 42: 1666
3　 Barnes S. Proc Soc Exper Bion Med , 1998, 217: 254
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1991, 55( 9): 2227
5　 Song T T, M urphy P A. Am J Clin Nut r, 1998, 68 ( suppl ):
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6　 Seo A, Mo rr C V. J Ag ric Food Ch em, 1984, 32: 530
7　 Xu X, Wang H J, M urphy P A, et al . J Nut r, 1994, 124: 825
8　大久保一良 ,吉城由美子 ,吉越昌树 ,等 . 食品开发 (日 ) , 1991,
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( 1999-12-29收稿 )
2001年《解放军药学学报》征订启事
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