全 文 ：灵 芝 肤 多 糖 的 化 学 研 究△
北京医科大学药学院 (1 0 00 83 ) 何云庆 . 李荣芷 蔡廷威 吴家文料庞吉海料辛
摘要 从 灵 芝 子 实 体热水提取物中分 得 2 种葡聚糖肤G L SP :及 G L S P : , 凝胶层析及高效液相
层析法证明均为单一的多糖均一体 , 测得分子量分别为1 2 80 0及 1 4 1 0 0 。 完全酸水解 、 过碘酸盐氧
化、 S m it h降解、 光谱分析、 气相色谱及 甲基化分析证明 , G L SP : 为含有卜 (1、 3 ) (1 , 6 ) 及
(l, 4 ) 试键的葡聚糖肤 , 肤的含量占2 6 . 6 % ; G L S P 3为含有卜 ( 1、 6 )及 (1~ 4 )贰键 的 葡
聚糖肤 , 两类式键糖基组成比例为 1 : 1 , 业有分枝 , 肤的含量占1 2 . 3 % 。 碱性日一消去反应证明 ,
2种葡聚糖肤的糖基与肤键中的丝氨酸及苏氨酸以O 一糖试键相连接。
关健词 灵芝 灵芝肤多糖 葡聚糖肤 化学研究
中医临床应用灵芝有悠久的历史 , 历代医药学家视为磁补强壮 、扶正固本的珍品 。 现代药
理学和 临床研究表明 , 灵芝具有多种生理活性〔‘〕。 作者与基础医学 、 药理学 、免疫学 、分子生
物学 、 细胞生物学紧密配合 , 证明灵芝多糖为灵芝扶正固本有效成分〔2〕。 现从具有免疫调节
作用及抗氧自由基活性的灵芝多糖G L A 中〔3〕, 分离2种葡聚糖肤进行结构研究 , 深入探讨 多
糖的构效关系 。
1 试剂和仪器
1
.
1 原料 : 灵芝购 自北京市药材公司 , 为人工栽培赤 芝 G o no d er o a luc 记“。 ( L e y s s .
x F r
.
) K ar s t子实体 , 外形呈鹿角状 。
e l
.
2 试剂 : 葡聚糖凝胶G 一 5 0 、 G 一 10 0 , 标准多糖D e x t r a n 及标准单糖均为Ph a rm a e ia Sw -
“d e n 产品 , D E A E 离子交换纤维素为B u d a p e st H u n g ar y产品 , 其它化学试剂为国产分析纯 。
1
.
3 仪器 : 岛津U V 一2 6 0型紫外光谱仪 , p e r k in 一E lm e r 9 5 3型红外光谱仪 , P一 E Z连oC 型
元素分析仪 , SQ一2 0 6型气相色谱仪 , w a te r s 2 4 4 型高效液相层析仪 , V G Zo一 2 5 3 G C /M S
/ D S气质联用仪 , 配有H P一5 8 3 oA 型G C仪 , p D P l x / 7 3型微机及 V G 1 1 一2 5 0数 据 处 理 系
统 。 日立 8 3 5 一 5 0型氨基酸自动分析仪 。
2 实验部分
2
.
1 肤多糖的分离 、 纯化 : 赤芝子实体热水提取 , 乙醇分级沉淀 , 大分子部位经透析 、 S e-
v ag 法除游离蛋白质 , 得灵芝多糖G L A 。取 1 . 79 G L A 以硼酸型D E A E 纤维素柱层分离 , 水 -
硼 砂 一 氢 氧 化 钠溶液梯度洗脱 , o . o sm ol / L洗脱部分经透析 、S o p h a d ex G 一50 脱盐 , 冷冻千
燥 , 得 G L S P : 6 Om g 。 0 . 0 5m ol / L氢氧化钠洗脱部分 , 除透析脱盐外 , 再用过氧化 氢脱色〔‘〕,
透析 , 冷冻干燥 , 得G L sp 。 2 3 3m g 。
2
.
2 纯度及分子量测定:
2
.
2
.
1 凝胶过滤法测定纯度 : s e p h a d e x o 一 1 0 0柱 (一 o e m 又 4 o e m ) 层析 , 0 . 1 %氯化钠洗
脱 , 上样量 1一Z m g 。
2
.
2
.
2 高效液相层析法测定纯度及分子量〔5〕: sh o d e x Io n p a k S一 5 0 4柱 , 进样量 5 0 协g , 流
动相 o . Zm o l/ L 硫酸钠 , 流量 o . sm l/ m in , 标准分子量葡聚糖系列 : 4 9 . 4 x l o4 , 2 2 . l x 1 0 4 ,
7
.
9 x 1 0 4 , 7
.
3 x 1 0 4 , 4
.
O x 1 0 4 , 1
.
0 x z0 4及 0 . 9 7 x lo 4 。
.
^ d d r e s s
:
H e Y o n q in g
,
s。 h o o l 、f P h a r m a e y , B e ijin g M e d ie a l u n sv e r s ity
,
B e iji
n g
二 现在天津市氨基酸总公司
* 二 北京医科大学波谱分析室
△ 国家自然科学基金及国家教委博士点基金资助项目
《中草药 》 19 9 4年第 25 卷第 8 期 3 9 5
2
.
3 肤链的氨荃酸组分定性定量分析 : 精确称取肤多糖各2 一 3 m g , 加6 m ol / L 盐酸 , 氮气保
护下 1 10 ℃加压水解40 h 。
2
.
4 完全酸水解及水解产物鉴定 :精确称取肤多糖各10 m g , Zm ol / L硫酸加压 10 ℃水解 l lh 。
水 解产物进行以下鉴定 : 纸层析 a ) 正丁醇一乙酸一乙醇一水 (4 : 1: 1 : 2 ) b ) 乙酸乙醋一乙醇-
毗咙一水 ( 5 : 2 : 2 : 1 ) ; 气相层析 : 水解产物硼氢化钠还原 , 醋配一毗咤乙酞化 。气层条 件 : 石
英毛细管柱 S E 5 4 , O v 一 l , 7 . sm 又 o . 3m m 。
2
.
5 过碘酸盐氧化反应 : 取2 一 3 m g 肤多糖溶于 o . 0 0 7 2 2 m ol / L 过碘酸钠中 , 4℃ 暗处放置 , 每
2 4 h取样 , 分光光度法〔“〕测定过碘酸钠消耗量 。以o . o l o 8 6 m ol / L氢氧化钠测定甲酸生成量 。
2
.
6 Sm it h降解反应 : 上述氧 化完全的多糖加入 2 m l乙二醇 , 放置 30 m 。 , 透析 , 硼氢化
钠还原 , 乙酸调 p H 至 5 , 再透析 , 冷冻干燥 , 业依上述水解 , 纸层析〔溶剂系统 : 正丁醇一乙
醇一水 ( 4: 1 : 2 ) 〕检识 , 澳甲酚紫显色 。 另取水解物制成 乙酞化衍生物 , 气相层析检识 。
2
.
7 甲基化反应 : 以改 良的H ak o m or i法〔7 〕业以正丁基锉代替氢化钠〔的 , 分别对 G L S P : 及
G L SP 3进行甲基化 , 红外光谱检识在 3 4 0 0 c m 一 ’处无经基吸收 , 加90 %甲酸 1 0 ℃水解sh , 再
加Zm ol / L三氟乙酸水解 1 Oh , 除尽酸 , 硼氢化钠还原 , 乙酸化 , 产物进行气相层析及气质联
用分析 。 条件 : G C条件 : O V 一 10 1石英毛细管柱 , 2 5 m x o . 2 5m m , 柱温 1 3 0一Zso oc , 进 样
口 2 5 0 ℃ , G C /M S接 口温度 一7 0 ℃ 。 M S条件 : E l , 源温Z 0 0 0c ; 7 o e V , 质量范围5 0 一 3 5 oa -
m u
, 扫描速度 15/ 全程 。
2
·
8 碱性卜消去反应〔9, 功〕 :
2
.
8
.
1 稀碱反应后紫外光谱分析 : 各取Zm g G L s p :及 G L sp 3 , 加 o . Z m o l/ L zo m l氢氧化
钠 , 45 ℃保温 3 0 m in , 测定紫外吸收光谱 , 同时测定相同浓度肤多糖水溶液的紫外吸收光谱 。
2
.
8
.
2 氮基酸测定 : 各取2 ~ 3m g肤多糖 , 溶于。 . 2 m ol / L氢氧化钠 (内含 lm ol 硼氢化钠 )
中 , 在氮气保护下 45 ℃保温2 4 h , 加2 m l浓盐酸 , 通氮气后封管 , 1 10 ℃水解 3 o h , 水解物进行
氨基酸定量分析 。
3 结果与讨论
3
.
t 从赤芝子实体中分离得到具有抗衰老活性的多糖G L A , 从中分取总肤多糖进行混合淋
巴细胞培养 (M L C R ) 反应 , 结果发现具有较强的活性 (药理结果另文发表 ) 。 G L A 中共
分离得到 3种肤多糖 ; G L S P , , 经鉴定为杂多糖肤 ; G L S P : 及 G L S P 3 为葡聚糖肤 。 它们均溶
于水 , 凝胶层析及高效液相层析证明为均一组分 。 G L S P : 及G L SP3 元素分析除含碳氢外 尚
含氮 , 完全酸水解的水解产物分析 , 仅检出葡萄糖 , 说明它们为水溶性葡聚糖肤。 肤键的氨
基酸组成类似 , 含量不同 。
3
.
2 G L S P : 白色粉末状结晶 , 分子量 12 8 0 0 , 红外光谱在 8 9 o c m 一 ’处有吸收峰 , 表明有 卜贰
键特征峰 , 业有34 10 、 16 3 1 、 14 5 0 c m 一 ’吸收峰 , 提示有酸胺基存在。 水解产物鉴定 为 葡 萄
糖 , 经过碘酸氧化 , 需 1o o h完成 , 业有甲酸生成 。 S m it h降解反应产物经纸层析及气相层析
检识 , 有丙三醇 、 赤鲜醇 、 葡萄糖存在 , 表明含有 ( 1* 6 ) 、 ( l , 4 )及 (l、 3 ) 贰 键 。
G L SP
: 在氮气保护下加压水解 , 氨基酸定性定量分析结果证明 , 肤键由16 种氨基酸组 成 (m ol
% )
, 其中以谷氮酸 ( 1 7 . 3 ) 、 颗氨酸 ( 12 . 4 ) 、 亮氨酸 ( 10 . 6 ) 、 丙氨酸 ( 9 . 2 ) 、 甘氨酸
( 8
.
6 )
、异亮氨酸(7 . 8 ) 为主 , 业含有丝氨酸 ( 5 . 5 ) 、 苏氨酸(4 . 7 ) , 肤占总糖肤的2 6 . 6 % 。
经稀碱卜消去反应 , 紫外吸收光谱测定在2 4 0 n m 处有明显吸收峰 , 定量氨基酸测定结果 , 丝
氨酸由1 . 2 4 9石降到门 . 2 5 % , 苏氨酸由 1 . 20 %降到0 . 14 % 。 以上证明 , (i L S P Z是含有卜 ( 1。
,
3 9 6
.
3 ) ( 1 0 6 )及 (1 0 4 )贰键的葡聚糖肤 , 肤链中以丝氨酸及苏氨酸以O 一贰键与糖基相连接 。
3
.
3 G L sP云为自色片状结晶 , 分子量 14 1 0 , 红外光谱在 8 9 5c m 一 ’处存吸收峰 , 表明 有 日一
贰键 , 而不存在 a 一贰键吸收峰 。 业在 3 3 9 4 、 1 6 0 9 , 1 4 1 5 c m 一 ’处有酞胺基特征峰 。 完全酸水
解仅检出葡萄糖 , 过碘酸 盐 氧 化 , lo oh 完成 , 业有甲酸生成 , Sm it h降解产物检出丙 三
醇和赤醉醇 , 说明含有 ( l , 6 )及 ( 1、4 )贰键的糖基组成 , 肤链的氨基酸组成 (m ol % )
以谷氨酸 ( 1 6 . 2 ) 、 撷氨酸 ( 1 3 . 1 ) 、 亮氨酸 ( 10 . 5 ) 、丙氨酸 (9 . 3 ) 、 甘氨酸(9 . 2 ) 、天冬
氨酸 (7 . 6 ) 等为主 , 亦有丝氨酸 (5 . 6 ) 及苏氨酸 (5 . 0 ) 存在 , 肤含量占总糖肤的 1 2 . 3%。
卜消去反应证明 , 除在紫外光谱2 4 o n m 处 出现吸收峰外 , 氨基酸定量分析结果 , 丝氨 酸 由
0
.
59 %降到 0 . 26 % , 苏氨酸由0 . 60 %减少到微量 。 G L S P。按改 良的 H a k o m or i法甲基化 , 全
甲基化多糖产物经水解 、 还原、 乙酞化 , 进行气相层析及气质联用分析 , 与标准品对照 , 可
见 有2 , 3 , 4 , 6 weM e‘一G lc (质谱碎片峰m / z : 2 0 5 , 1 6 1 , 14 5 , 1 2 9 , l r 7 , 1 0 1 , 5 7 , 7 1) 、 2 ,
3 , 6一M es一G le (2 5 3
、
1 1 7
、
1 13
、
20 1
、
9 9
、
5 7 ) 及 2 , 3 , 4 一M e : 一G le ( 18 9 、 16 2 、 22 9 、
1 1 7
、
1 0 1
、 ”、 87 ) 主要产物, 业以峰面积校正后计算其摩尔质量比为3 : 1 : l 。 以 上 证 明
G L S P 3为含有卜 ( 1 , 6 )及 ( 1 * 4 ) 贰键的葡聚糖肤 , 2 种贰键糖基组成比例为1 , 1 , 且有
分枝存在 。 肤链与糖的连接方式为以丝氨酸及苏氨酸以O 一贰键方式相结合 。
致谢 : 沁京医科大学药学院实验仪器中心测 光谱及元 素分析 ; 军事医学科学院放射 医学
研 究所测分予量 , 湘京市 中药研究所作 氛基酸分析 。
今 考 文 献
l 林志彬, 等 . 灵芝 . 第二版 . 北京 . 科学出版社,
1 9 8 5
。
9 3
2 李荣芷 , 等 . 北京医科大学学报 , 1 0 8 7 , 1 9 ( 6 ) : 4 3 1
3 李荣芷 , 等 . 北京医科大 学学报 , x。, l , 2 3 ( 6 ) : 通7 3
4 张翼伸 , 等 . 吉林师范大学学报 , 1 9 7 9 (2 ) 8 0
5 方积年 . 药物研究, 19 79 , 25 : 23
6 D ix o n J S
, e t a l
.
A n a l C h e m
,
1 9 5 4
,
2 6
:
1 0 9 2
7 H a k o m o r i 5 1
.
J B io e h e m
,
19 6 4
,
5 5
:
2 0 5
S A , t h o n y B
, e t a l
.
C a rb o h yd r R e s
,
1 9 8 5
-
1 4 0 : 3 1 9
9 N a k a j
a 位 a J , e t a l . J B i, I C h e m , 19 7 4 ,
2 49 . 76 9 7
1 0 戈苏 国, 等 . 微生物学报 , 1 9 8 3 , 2 3 ( 3 ) 2 6 5
( 1 9 9 3
一 0 4 一2 0收稿 )
辛 夷 花 有 效 成 分 研 究
军事医学科学院毒物药物研究所 (北京 10 0 8 5 0
辛夷为木兰科植物辛夷 M a g n o l‘a 111‘flo ra
D es r
. 的花蕾 , 具有祛风通窍的作用 , 用 于 治疗
头痛 , 鼻渊 , 鼻塞不通等症 。 化学成分主含挥发油
(江苏新医学院 . 中药大辞典 . 下册 . 19 7 . 2 34 5 )。
早在洲年代 , 国外曾对木兰属植物的树皮及根皮进
行生物碱成分的研究 , 近年来对辛夷花蕾中木脂素
成分的研完 , 国内外报道较多。 但对该花蕾水溶性
成分的研究 , 国内外未见报道 。 作者从辛夷花蕾的
乙醇提取物中分出一种水溶性生物碱 , 经紫外 、 红
外 、 氢谱 、碳谱 、 质谱等光谱分析 , 确定其为水溶性
季钱碱一木兰碱 (m a g n o f lo r in e ) 〔N a k a n o .
顾 国明 周 宇红 于桂华 贾 玲
C h e m P h a r m B u ll
,
1 9 5 4
,
2 (2 )
:
3 2 9 〕。药理
实验表明 , 该化合物具有显著的肌肉松弛的作用 。
1 提取和分离
辛夷花蕾粗粉 , 以乙醇回流提取 。 提取液减压
浓缩后 , 用 2纬酒石酸溶解 。 酒石酸提取液以 氨 水
碱化至p H g ~ 10 , 乙醚萃取 。 母液减压浓缩至小体
积 , 加乙醇至醇浓度为90 % , 得醇溶和醇不溶 2 部
分。 取上清乙醇溶液 , 减压浓缩至千 , 水溶后经反
复硅胶柱层析 〔溶剂为甲醇一氨水 (洲 , 6 ) 〕 , 制
备性 纸层 析 〔溶 剂为正丁醇一冰醋酸一水 ( 4 : 1 :
5 ) 〕最后将制备液冷冻干燥得类白色粉状物。该物
(下转 第4 1 1 页 )
《中草药》 1 9 9 4年第25 卷第 8 期 · 3 9 7 .
AB S了R ACT S OF OR 16 lNAL AR T IC LES
C he m ie a l St u d ie s o n 尸ePtid e一Po lysa c e ha r ide s o f L in g z hi ( G a n o d e , 。a l“e id u。 )
H e Y u n q i n g
,
Li R o 皿g z L i, C a i T in g w o i, e t a l
T w o g ly c a n Pe Ptid e s
,
G L S P : a n d G L SP . w e r e o b ta in . d fro m th e h o t
一
w a te r e x tr a c t o f th e
fr u it
一
b o d y o f G a ”o d e r m a l“e id u 爪。 G e l c h r o m a t o g r a p h y a o d H P L C s h o w e d th a t th . y
h o m o g e n e o u s Po ly s a e c h a r id e s
,
w it h m o l. c u la r w e ig h rs o f 1 2 5 0 0 a n d l透1 0 0 r e sPe e tiv e ly 。
th e P r o c e d u r e s o f to ta l a c id ic h y d r o ly s is
,
Pe r io d a to b x id a ti o 。, S m it h de g r a d a tio n , a n d
d e t . r m in a tio n
,
G L S P : Pr o v e d t o b 。
lin k a g e
,
2 6
.
6 写 o f w h ic h 1 5 Pe Ptid 。 ,
a g ly c a n P ePtide w it h
Pr o v e d t o b 。
日一 ( 1 , 3 ) ( 1 , 6 ) a n d
a r e bo th
T h r o u g h
s Po c tr a l
( 1争4 )
w h ilo G L S P :
a g ly c a n p o p tid e , it h p
一
( 1 ,
6 ) a n d ( 1今4 ) lio k a g e , a n d t五e s u g a r r e s idu e ra ti o i n
G L SP: h a s b r a n c h . s
, a n d P . Pride ta k o s 12
.
3%
o f it
.
th a t t h e su g a r r e sid u e s in th e t w o g lyc a n Pe Ptid o s a re
o n in o o n th o Pe Ptid o c h a in
。
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tw o b o n ds 15 1 *
日一e lim i n a tio n
1
。
T h e
re a c tio n
li n k e d w i th o
一
b o n d to se ri n e
o h a in o f
i n dic a te d
a n d t h re
-
( O r ig i n a l a r tic le o n p a g e 3 9 5 )
St u d ie s o n th e Ch e m ic a ! C o n stit u e n ts
o f C hin e s e S e a la v e n d e r (L fm
o n fu m s in e n s e )
G u o H o n g z h u
,
Y u a n Ji u r o n g
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一 r k n o w n fla v o n o id s w o r o is o la te d fr o 位 th e a e r ia l Pa rt o f L i用 。” iu 南 : i”e ”s e ( G i ra ld )
·
K u n tz e
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o n t h e b a si s o f U V
, ’H N MR
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M S s Pe c tr o s c o Pic a n a ly si s
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i‘le n tifie d a s m y r ie e tin 一 3 一0 一 p
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.
T h is s e e m e d to b e th e fir s t r e Po r t d e sc rib in g t h e ir
屯. o la ti o n fr o m L 。 si n e n ‘e 。
( o r ig i
, ‘a l a r tie le o n Pa g e 3 0 5 )
Stu d ie s o n t h e R e le a s e R a te s o f X in lu n in g T a ble t in V it r o
C h o . X i n g c a n
,
Y u X is h u i
, 。 t a l
T h e m a in a c tiv e c o m p o n e n t of X in lu n in g ta b le t , a n a n ti a r r h y th m ic Pr o P a r a tio n
, a r e
m a tr i n e
, o x ym a tr in e
, s o Ph . r a n o l, a n a g yin e
,
b a Ptifo lin e e t c
.
I n t h is s tu dy
, to ta l a lk a lo ids in
t h e ra b le t w e r e d e te r m in e d by a c id c o m Ple x in g
, a n d th e ir r o le a se r a te fr o m th o ta b le t de te r m
-
in e d i n a r tific ia l g a st r ic ju i e .
。
( O r ig in a l a r t ie le o n Pa g e 40 5 )
D e te rm in a t io n o f Pa e o n if!o rin in 、M o lu o G r a n u le s , by R e v e r se d Pha se H PLC
L i Y a n g
P a e o n iflo r in i n C h i n . s e tr a di ti o n a l Pa to n t
r e v e r s e d Ph a s。
ti o n a r y Pb a s e
,
H P LC
.
O Ptim u m s . Pa r a tio n 军r a 3
m e d ic i n e
I,
M o lu o g r a n u le s l,
a c 五ie v e d b y e m Plo yi n g C : .
w a s d e te r m in e d b y
c o lu m n a s th e
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( CH : ) : CH OH
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.
0 6%
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.
0 4 %
。
T h e e x t ra c ti o n 15 sim Ple
,
th o a n a ly tic a l m e th o d 15 r a Pid a n d a e c u ra t . w ith g o o d re Pr o d u c ib ility
.
( o ri g i n a l a r tic le o u Pa g o 4 0 7 )
.
4 4 6
·