全 文 ：补肾活血方抑制胶原蛋白交联、
透明质酸解聚和脂质过氧化作用的研究△
北京心肺血管医疗研究中心 金 鸣
摘要 研究补肾活血方 简称补方 水煎液的体外抗氧化作用 。 细胞色 素 氧 化 法 证 明 , 终浓
度 时 , 补方 · 清 除 率为 。 比色法观察到 , 补方终浓度
时 , 大 鼠肝匀浆 抑制率为 肠 粘度测定法发现 , 补方终浓度一
时透明质酸解聚抑制率为 纬 , 一 分析结果表明 , 补方可显著抑制
胶原蛋白交联 。 还比较了复方及各单味药抗氧化作用的强度 。
关键词 补肾活血方 经自由基 脂质过氧化 透明质酸 胶原蛋白
补肾活血方 简称补方 补肾活血 , 主治老年慢性痛血 , 是北京中医学院老中医王玉川
教授临床经验方 , 含干漆 、 肉桂 、 构祀子 、 冤丝子 、 蛇床子 、 生地 、 肉从蓉 。 · 是体内最
活泼的活性氧 , 可进攻生物大分子 , 导致脂质过氧化 、 透明质酸解聚 、 胶原蛋 白交 联 等损
伤 , 是老年期血管硬化 、 心肌顺应性下降 , 动脉壁脂质沉积等现象的起因之一 。 血液循环障
碍常与 自由基损伤共存 , 为了探讨补方治疗老年慢性潦血的机理 , 本文观察了其水煎液在离
体条件下清除 · 、 抑制大鼠肝匀浆脂质过氧化和抑制 · 诱发的透明质酸解聚 与 胶 原蛋
白交联的作用 。
材料与方法
动物 健康 大鼠 , 雄性 , 体重 胶原蛋白实验 及 脂 质
过氧化实验 , 中国中医研究院动物房提供 。
药材 药材饮片均购自北京同仁堂药店 , 经北京中医学院中药鉴定教研室李家实教授鉴
定 。 干漆为漆树 碑 叮 树脂加工后的千燥品 。 拘祀子 。 一
, ‘。 。 肉从蓉 对 公‘ 。 蛇床子 ‘ ‘
。 生地 ￡ 才‘ 。 肉桂 ‘ ‘ 。 冤丝 子 “
坛 儿 玄 。
试剂 双丙烯酞胺 , 甘露醇 为 国 产 化 学纯 , , , , 一
为 公司产品 , 硫代 巴比妥酸 为国产化学纯经重
结晶处理 , 甘氨酸为生物试剂 , 考马斯亮 蓝 为 公 司 产 品 。 透 明 质酸 。
, 、 三经甲基氨基甲烷为生化试剂 , 马心肌细胞色素为 公司产品 , 其它试剂
均为国产分析纯 。
仪器 岛津 一 型紫外可见分光光度计 日立 一 一 型冷冻离心 机 , 毛 细 管粘
度计 , 电泳仪 。
一 方法 参考 方法山 , 浓缩胶及分离胶均为 。
中药水煎法 中药饮片以蒸馏水冷浸 以上 , 第一煎 , 第二煎 , 合并两煎
药液 , 离心除去药渣 , 浓缩至每毫升药液含生药 , 过滤备用 。
药物清除 · 方法 参考王成莲等比色测定 · 方法〔“〕, ‘改为 , · 损伤
管不加中药 , 保护管加定量中药液 , 每一中药浓度设一不加抗坏血酸管为比色空 白 , 以无中
, ,
△本文工作为作者次读博士学位研究生期间完成 , 导师为北京中医学院陈文为教授。
《中草药 》 年第 卷 第 期
药 , 无抗坏血酸管为对照 , 心清除率计算公式
一 〔 对照 一 保护 对照 一 保护 〕
药物抑制大鼠肝匀浆脂质过氧化 ! , 方法 参考文献〔〕比色
测定法 , 损伤管不加中药液 , 保护管加定量中药液 , 每一组剂量相同的实验管设一比色空 白
于脂质过氧化反应前加三氯醋酸 。 脂质过氧化抑制率计算公式
〔 损伤 一 保护 损伤〕
药物抑制 · 所致 解聚方法 反应液总体积 , 内含 ! ∀ , 50 m m ol / L 磷酸盐缓
冲液 , H A 1 9 / L , C u C I : o . o l m m o l / L , 抗坏血酸zm m o l/L , 预热sm in后加抗坏血酸 ,
37 ℃反应3om in , 加0.lm ol /L E D T A o.05 m l终止反应 , 37 ℃测定反应液相 对粘度月。 损
伤管不加中药液 , 每一中药浓度设一不加抗坏血酸的空白管 , H A 解聚抑制率计算公式:
d = 〔( n空白 一 月保护)/ (月空白 一 ”损伤 ) 〕又 1 0 0 %
胶原蛋白 ( C ol la g en , C ol ) 制备方法 : 取大鼠尾部肌键 , 冰浴中去除肌肉及残血 , 剪
碎 , 加20~ 30倍量o .sm o l/L H A e匀浆 , 匀浆液置4℃冰箱 , 经常振 摇 , Z d 后 4℃ s 00 0r/
m in离心3om in , 取上清液 , 加 2一 3倍量冷丙酮 , 4 ℃ 放 置 20一 12h , 连℃ s000 r/m in 离 心
60 m in , 取沉淀真空干燥即得 。 此胶原蛋白的SD S一P A G E 图谱与文献〔4〕结果一致 。
药物抑制 .O H 所致C ol 交联方法 :参考Y u ko K an o的方法诱导C ol交联作为损伤模型 ,
反应体系中加入药液0.01 m l进行保护 , 观察保护前后 C ol 一S D S 一P A G E 行为的变化 , 以双缩脉
法测定反应体系中C ol 含量为5g /L 。
除特别注明外 , 本文数据均为3个平行测定管的均值 。
2 结果
2 .1 补方水煎液清除 · O H 的作用: C u C I:/抗坏血酸体系可通过F ent on 反应 产生 · O H , 氧
化还原型细胞色素C , 使其吸收光谱改变 。 当补方水煎液终浓度为3.56 ~ 14 .29 / L 时 , 心H
清除率逐步上升 , 为2 1.8 士0 .6 % 至43.5 士 6 .5% , 呈明显的剂量效应关系 ( 图 l ) 。
2
.
2 补方及肉桂水煎液抑制大鼠肝匀浆L P O 的作用: 大鼠肝匀浆中脂质受 自由 基进攻 , 生
成丙二醛等物质 , 与T B A 反应后532 n m 吸光度升高 。补方及其壮阳主药肉桂水煎液终浓度各
为6.1~ /195 .2m g/L 时 , 离体条件下大鼠肝匀浆L P O 抑制 率为 11.3士1 .9 % 至89 .5土 5 .1 % 和
18 .1土5 .8 % 至84 .5 士。.4 % ( 图2) , 呈明显的量效关系 。 从图2可见 , 补 方的作用较肉佳略强 。
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图1 补方煎液清除 · O H 的作用 图 2 补方及肉桂水煎液抑制大鼠肝匀浆LP O 的作用
1一补方 2一肉桂
2 . 3 补方及肉桂水煎液抑制 · O H 诱导H A 解聚的作用: H A 是一氨基多糖 , 被自由基裂解为
小分子量片段后 , 其溶液粘度下降 。 本实验条件下 , C u C h 终浓度。. l m ln ol / L , 抗 坏 血酸
讨论
本文结果表明 , 补方水煎液可清除 · O H , 抑制大 鼠肝匀浆脂质过氧化 , 缓解 · O H 诱发的
透明质酸解聚和胶原蛋白交联 。
自由基损伤是衰老的重要起因之 一 , 它引发胶原蛋白交联 、 脂质过氧化等改变是老年期
心肌顺应性下降 , 血管硬化 , 动脉壁脂质沉积等现象的起因之一 。 透明质酸解聚是 自由基损
伤造成老年期结缔组织弹 ;’犯下降的重要机理 。 这些变化均 可加居J血液循环障碍 。 补方 主治老
年慢性痕血 , 从本文结果分析 , 其抗氧化效应可能对缓解老年期血液循环障碍有所帮助 。
自由基损伤反应的特异 欢表现在疾病发展的特定阶段 , 特定的组织及生物大分子受损所
产生的特殊效应 , 离体实验档型不易体现这种特异性 。 口服中药成分透过体内多重屏障 , 被
种种代谢酶作用 , 到达靶组织 后还能否保持原有的结构很多尚属未知 。 因此 , 虽然本文许多
药物有较明显的抗氧化作用 , 但这些结论还有待于整个实验的证实 。
体内自由基损伤厂补乍是导致血液抵环障碍及产生继发损伤重要因素之一 , 活血化疚药物
的抗 自由基损伤作用与其活血效应可能有关 。 教坑寸中药活血化流与抗 自由基损伤的关系 , 对
进一步阐明活血化疮治则的实质 , 探索抗衰老的折途径 , 有重要的意义 。
参 考 文 献
l aem m li U K , e t a l 。 N a t u r e , 1 9 了0 , 艺2 7
( 1 5 ) : 6 8 0
王成莲 , 等. 生物化学与生物物理 进展 , 19 89 ,
1 6 ( C )
: 遇7 3
陈文为 , 等 。 中国医药学报 , 1 9 8 6 , 1 ( 2 ) : 2 5
K
a n o
Y
, e t a l
。
J B i o c h e m
,
1 9 8 7 ( 1 0
2
)
:
8 3 9
(
1 9 9 2 一 1 1 一0 6
一收稿 )
(上接 第69 页)
4 。 2 稳定性实验 : 依上法操作 , 每隔一定时间测定斑点的积分值 , 结果在 l h 内稳定性良好 。
样品溶液的制备及测定 : 精密吸取抗病毒口服液50 m l, 加盐酸5m l, 置水 浴水 解Zh ,
放至室温 , 滤过 , 容器及滤渣多次加少量水洗涤 , 至滤液无色 。 滤渣置烘箱中10 ℃干 燥 1h
后 , 置索氏提取器中用石油醚 ( 30 一 60℃ ) 回流提取 3 h 。 提取液回收石油醚至干 , 用 石油
醚转移至具塞试管中 , 挥千石油醚 。 精密吸取 lm l氯仿一乙醇 ( 1 : 1 ) 混合液溶 解 残 渣 ,
拐样品溶液 。 精密吸取供试 尸:液20时 , 对照 品溶液2 、 4 时分别点于 同一薄层板上 , 按标准曲
线项操作 。 由测定的峰而积积分值得出抗病毒 口服液按筱葵皂贰元计算其含量 , 结果见表 。
5 加样回收率试验
取抗病毒 口服液制成灼样品2。卿 , 加入
对·照 品溶液 5 时 (含获奠皂贰元 5 !、g ) , 并
用对照品及样尸;溶液随行点样层析 。 按样品
测定项干‘操作 , 汁算含量结果 , 平均 回收率为
1 02 .8 ;石, C V = 3 . 7 0 % ( n = 6 ) 。
6 结果
表 各厂家生产的抗病毒口 服液含量
测定结果
厂家 批 号 含量印g/m l) 平 均 C V %
本溪 9 2又0 0 1 1 。 0 9 0 1 1 。 0 5 3 1 ) 。 2 0 2 9 1 。 1 二54 5 。 7 1
广州 9208 03 2。 2 3 7 9 2 。 2 4 7 0 2 . 2 8 3 7 2 。 2 5 6 2 夕. 0 1
6 . 1 本法测定抗病毒 口 服液 中获羹皂成元的含量 , 方法简便 , 结果稳定 , 重现性好 , 可作为
质量检验的一 个定量方法 。
6
.
2 从不同厂家生产的抗病毒 口服液中菠夔皂俄元的含量结果看出 , 本溪生产的口服液含
量要比广州生产的低些 。
致谢 : 本实验的数据承蒙沈 阳药学院 测试 中心孙 秀艳老师 刚试部分工作 。
( 1 9 9 3
一 0 3 一2 1 收稿 )