全 文 ：能与其刺激 件胰岛细胞释放胰岛素有关 。
参 考 文 献
1 徐叔云 ,等主编 . 药理实验方法学 (第 2 版 ) . 北京 : 人 民
卫生出版社 , 1 9 9 1 . 1 1 2 1 、 1 2 7 2
2 C h a n d l e r A B
.
L a b l n v e s t
,
1 9 5 8
,
7
:
1 1 0
傅方浩 ,等 . 白求恩 医科大学学报 , 19 87 , 1 3 (l ) : 1
A w o x d A B
, 等 . Bi o e h e m iB o p h y s R e s oC m m u n , 19 7 9 ,
8 6
:
13 8
( 1 9 9 7
一 0 1
一
0 2 收稿 )
小果胺及其衍生物对恶性黑色素瘤细胞增殖的影响△
南开大学分子生物学研究所 (天津 3 0 0 0 7 1)
天津市肿瘤研究所
张金红 带 段江燕 耿朝晖 陈家童
黄建英 李 希
摘 要 观察小粟胺及其衍生物 ( B Z 、 B 4 、 B B 、 E B )B 对培养的恶性黑色素瘤细胞 ( B o w es C el )增殖
都有 明显的抑制作用 ,其抑制增殖的 I C S。值分别为小粟胺 ( oB ) 9 · 5 拌m o l 、 B : ; 3 · 3 4 拌m o l、 B 魂 : 3· 0 4
拌m o l 、 B B : 4 . 5 拌m o 一、 E B B : 1 . 5 拜m o l 。 对 3H 一 T d R 掺入和单细胞集落形成 (克隆 )以及脱氢酶活性同
样有明显的抑制作用 ,其作用特点是经化学修饰后的小粱胺的作用比母体小粟胺强 ;而 4 种衍生
物中 , E B B 的抑制效果最强 。
关健词 小璧胺 衍生物 B o w e s 细胞 增殖
小璧胺是一种具有多种药理作用 (如升
高白细胞 、抗结核 、抗矽肺及调节机体免疫功
能 )的双节异 咬琳类化合物 〔, , 。 过去 ,我们首
先发现小璧胺是一种新型钙调蛋 白 ( C a M )
拮抗剂 ,还发现对它的结构进行化学修饰后 ,
拮抗 C a M 的能力比小巢胺高出几倍至一百
多倍 ,其中 E B B : 〔O 一 ( 4一乙氧基 ) 一丁基 ) 小巢
胺是目前为止国 内外发现的最强的 C a M 拮
抗剂之 一 , 其拮 抗 C a M 的 IC S 。值 为 0 . 35
拜m ol 〔2〕 ;且专一性系数比小璧胺高出 6 . 5 倍
之多 ,说明 E B B 的特异性 (对 C a M )更高 。
C a M 作为细胞 内多种生理功能的调节
齐l] 〔3 〕 , 在细胞 生长增殖过程 中起着重要的作
用 `4 〕 。 研究表明 ,恶性增殖的细胞中 C a M 的
含量和活性往往高出正常细胞 。 已有许多实
验证明 〔 5〕 , C a M 拮抗剂对肿瘤细胞的增殖有
一定的抑制作用 。
我们以体外培养的 B o w e s 细胞为材料 ,
观察了改性前后 , 小璧胺及 4 种衍生物对该
细胞生长增殖的影响 ,探讨了这类化合物的
结构与抑制增殖能力的关系 。
1 材料
D M EM 培养基 : 购 自 G I B C O 公司 , 3H -
T d R
: 为北京 4 0 1 所产品 , M T T : S ig m a 产
品 ,小聚胺 : 北京东升制药厂 , 小璧胺衍生物
B
:
( O
一 e t h y lb e r b a m i n e )
.
B ; ( O
一
b u t y lb e r
-
b a m i n e )
,
B B ( b e n z o y lb e r b a m i n e ) E B B 均 为
本室合成 。 B o w es 细胞 : 天津市肿瘤研究所提
供 。
2 方法
2
.
1 B o w e s 细胞培养在含有 10 %新生牛血
清 ( F B S ) 的 D M E M 细胞 培养液中 , 置 5%
C O
: , 3 7 ℃的培养箱中培养 B o w e s 细胞 , 3 ~ 4
d 后传代 。
,
A dd
r e s s : Z h a n g J in h o n g
,
I
n 、 t it u t e o f M o le c u la r B il o l g y
,
N
a n k a i U n iv e r , i t y
,
T i
a n j in
张金红 副研究员 , 1 9 7 5 年毕业于南开大学生物系 . 主要研究方向 ,
钙调素 (细胞内激活 因子 )的金属酶 ( C a 吕+ -行了钙调 素拮抗剂抗肿瘤方面的研究 。 共
M g Z + A个 P a s e )和人红细胞膜 N a发表相关论文近 30 篇 。
酶学及生物 活性物质 。 主要进行稀土离子对依赖
+ / K + A T P as e 活性影响的研究 , 此外还系统地进
△ 夭津市自然科学基金资助项目
.
4 8 3
.
0 2106ǎ乞工xà豁纂思
2
.
2小巢胺类化合物对 B o ws e细胞生长增
殖 曲线的影 响〔6 〕 : 将接种量 ( x l 少c el l /m L )
一定的细胞分成实验组和对照组 ,培养 24 h
后 , 加入不同浓度的小巢胺或衍生物到实验
组 ,对照组以相应培养液代之 。 每 24 h 进行
活细胞计数 ,绘制各种化合物作用后 , B o w es
细胞的生长曲线 ,计算相对存活率 。
2
.
3 集落形成试验 〔 6〕 : 将 2 又 i o Z e e l l /m L 对
数生长期的个形态细胞接到 6 孔细胞培养板
中 (培养液含 20 % F B S ) ,待细胞开始分裂时
加入不同浓度的待测物 。 继续培养 1 周后 ,更
换培养液和相同量化合物一次 ,两周后 ,用氨
基黑染色 , 计算集落形成率和存活率 。
.2 4 3H
一
T d R 掺入试验 〔7 〕 : 接对数生物期的
细胞 ( x l o 4 /m L ) 到 2 4 孔板中 , 培养 2 4 h 后
加药 ,继续培养 2 4 h 后 ,吸除并用磷酸缓冲液
洗去未掺入的 3H 一 T d R ,处理后记数 cP m , 以
对照组 cP m 数为 1 0 % , 计算药物对 3 H 一 T dR
掺入的抑制率 。
2
.
5 M T T 法测 活细胞存活率 : 采用 M os -
m a n n 法 〔”〕 。 以 未加药 组 5 7 0 n m O D 值 为
1 0 0 %
,计算药物对细胞降解 M T T 的相对抑
制率 。
3 结果与讨论
3
.
1 小梁胺及衍生物对 B o w e s 细胞生长曲
线的影响 : 如图 1 所示 , 对照组细胞增殖旺
盛 , 一直处于对数生长期 ;实验组伴随化合物
种类和浓度的不同 , 细胞增殖受到抑制的程
度也不同 。 0 . 25 拜m ol / L 各种化合物作用细
胞 48 h 后 , 细胞增殖的抑制率分别是 : E B B
8 5
.
8%
、
B B 6 8
.
7%
、
B
4 3 2
.
7%
、
B
: 2 4
.
5%
、
B o 7
.
4% ;化合物作用 7 2 h 后 , 对 B o w e s 细
胞增殖抑制的 IC 50值见表 1 。 这些结果说明
化学修饰后的小璧胺衍生物抑制 B o w e s 细
胞增殖的能力比小粟胺明显增强 。 而衍生物
的 取 代 基 不 同 ( B Z一e ZH S 、 B 4一 e 4 H , 、 E B B -
( C H
:
)
4 一
O
一
C
Z
H
S 、
B B
一
O C C
6
H
S
)
, 分子 的疏水
J隆和空间结构也略有不同 , 所表现出的抑制
效果也不同 , 4 种衍生物中 E B B 的效果最显
著 ,与酶学实验的结果相符 〔2 , 。
.
4 8 4
·
5 0
3 0
4 0
时间 亡 ( d )
图 1
1
-
2
,
3一
4 一
5
-
6
-
B o 和 E B B 的浓度对 B o w e s 细胞
生长的影响
B o E B B
对照 对照
2
.
5 拜m o l / L 0 . 2 拜m o l / L
5
.
0 拌m o l / L 0 . 5 件m o l / L
2 0
.
0 拜m o l / L I , o 拜m o l / L
1 5
.
0 拌m o l / 1 2 . 5 群m o l/ L
20
.
0 拜m o l / L 5 . 0 拜m o l/ L
表 1 5 种小桑胺类化合物作用 72 h 后 ,
对 B o w es 细胞增殖的影响
化合物 B o B Z B ` B B E B B
I C 5 o (拌m o l / L ) 3 . 3 4 3 。 0 4 4 .
3
.
2 B o 和衍生物 ( B B 、 E B B )对 B o w e s 细胞
集落形成 的影 响 : 3 种小璧胺类化合物对
B o w e s 细胞的集落形成都有明显的抑制作
用 。 o · 2 5 拜m o l / L 的 E B B 对 B o w e s 细胞集落
形成的抑制率达 43 . 7 , 而 2 . 5 拜m ol / L 的小
璧胺的抑制率也只有 45 . 2 % , 作用效果相差
近 10 倍 。 而取代基碳原子数比 E B B 还多一
个的 B B 效果与小巢胺近似 ,为 48 . 2% ,说明
化合物的空间构象不同 ,其生物效应也不尽
相同 。
3
.
3 小璧胺类化合物对 B o w es 细 胞 3H -
T d R 掺入的影响 : 表 2 所示 ,几种化合物对
B o w es 细胞 3 H 一T dR 掺入都有 明显的抑制作
用 ,与抑制增殖相似 ,小璧胺的作用不及它的
衍生物 。
表 2 5种小果胺类化合物对 B o w。
细胞 3 H一 d TR接人的影响
化合物 B oB : B ;B EB
I C o 5(林 mol /L )1 51 2. 3 5. 5 5. 0 3 . 5
3
.
4小巢胺类化合物对 BO ws e细胞能量代
谢的影响 :采用 s o Mma n n根据活细胞和生
长 旺盛细胞能代谢 M T T产生 甲瞻原理的
M T T比色分析法 , 测 定 了 5 种化合物对
B o w es 细胞能量代谢的影响 , 结果如表 3 。 几
种化合物对 B o w e s 细胞降解 M T T 都有抑制
作用 , 且与浓度呈正相关 。结果还显示出衍生
物的作用强 于小聚胺 ,而 E B B 对 B o w e s 细
胞代谢 M T T 影响最大 ; E B B 在 1 拜m ol l/ ` 时
对 B o w e s 细胞降解 M T T 的抑制率达 7 2写
( E B B 对 B o w e s 细胞增殖抑制的 I C 、 。值为
2
.
5 拼m o l ) ,说明 E B B 不仅能抑制 B o w e , 细
胞的增殖 , 也对活细胞 内代谢水平有一定 的
抑制作用 。
表 3 小架胺类化合物对 B o w e : 细胞
降解 M T T 的影响
浓度 。。 。 。 “ 制霆`% , B。 E。。
1
.
0拌m o l / 1 1 4 3 2 . 5 6 6 17 7 2
5
.
0 拜 m o l / L 2 2 . 5 4 7, 5 8 1 . 6 2 9 8 3 , 5
C a M 是一种酸性小分子钙结合蛋白 ,含
有苯丙和甲硫氨酸等疏水性氨基酸 。 而 C a M
拮抗剂又多具 有疏水结构和带正 电荷的特
点 〔的 。 C a M 与 C a Z 一卜结合后暴露出的疏水结构
与细胞内靶酶结合 ,进而调控细胞的生理功
能和细胞 的生长和增殖 。 C a M 拮抗剂靠其疏
水结构 和带正 电荷与 C a Z + 一C a M 复合体结
合 , 达到拮抗 C a M 活性的目的 ,这一观点己
被许多实验所证实 。 小璧胺具有拮抗 C a M 的
作用 ,而经化学修饰后的衍生物 ,无论是烷基
化的 ( B : 、 B ; 、 E B B ) , 还是酞基化的 ( A B 、 B B )
其疏水性均大于 小璧胺 , 所表现 出的拮抗
C a M 活性的能力也强于小璧胺明 。 从本实验
结果看 , 小璧胺衍生物抑制细胞增殖的能力
均强于小巢胺 , 说明 C a M 参予 细胞增殖 ; 而
C a M 拮抗剂能抑制细胞内 C a M 对酶系统的
调控 ,使细胞的增殖受到抑制 。在本实验条件
《中草药 》 1 9 9 7 年第 2 5 卷第 s 期
下 , 小聚胺及衍生物对 OB w e s 细胞增殖抑制
程度为 oB < B B < B Z < B ; < E B B ;烷基化的小
粱胺衍生物的疏水性 E B B > B ; > B Z ,说明拮
抗剂的疏水结构对拮抗 C a M 活性的能力影
响很大 。 C o M 的这种特性在类似物 W一 5 ( IsC 。
6
.
4 拜示0 1和 W 一 7 ( IC : , 1 5 拌m o l )对人卵巢癌
细胞的影响中亦得到证明〔“ j 。 化合物的空间
结构对细胞增殖的抑制能力 也有一定的影
响 , B B 的疏水性不 比 E B B 差 , 但对 B o w e s
细胞增殖的抑制能力低于 E B B 3倍之多 。
从四方面实验得到相同的结果 ,小桨胺
衍生物对 oB w e s 细 饱的增 殖抑制程度 比小
聚胺高 ;儿种衍生物 中 , E B B 的效果最 强 。
E B B 对 B o w e s 细胞代谢 M T T 能力影响比
细胞增殖的抑制能力强的特点 ,进一步说明
E B B 对 oB w e s 细胞增殖影响的实质是能量
代谢减慢 、 细胞老化 、 最终使细胞死亡 。 其原
因 可能是 E B B 通过阻断 C a M 调控 , 使细胞
的酶系统处于低活状态所致 。 在研究中还发
现 ( 另文发表 ) ,培养中的正常细胞 (牛胚肾细
胞 )的增殖 , E B B 影响不及小璧胺强 , 即小栗
胺对 正常细胞的毒性大于 E B B 。
总之 , 作为专一性较强 的 C a M 拮抗剂
-— E B B 是一种有前途的杭肿瘤化合物 ,小巢胺结构的修饰所带来药效的提高又为中草
药育效成分的研究提出了新的内容 。 而研究
C a M 拮抗剂与抗肿瘤细胞增殖的关系 , 必将
为抗肿瘤药物的开发和筛选开辟新的途径 。
参 考 文 献
l 刘昌孝 , 等 . 中草药 , 1 9 83 , 1 4( 1) : 45
2 张遂坡 , 等 . 生物化学一与生物物理学报 , 19 8 , 2 0( 1 ) : 13
3 C h e u n g w y
,
cS i e n e e
,
1 9 8 0
,
2 0 7 ( 1 )
:
1 9
4 J a m e o G
, e t a l
.
I n v o ln , e n t in R e g u la t i o n o f C e ll
一
C y e le
P r o g r e s s io n
,
19 8 2
,
2 8
: 4 1
5 Wi ll认m N H a i t , e t a l . J C lin o nc o , 1 9 8 6 , 4 ( 6 ) : 9 9 4
6 章静波 , 等 . 细胞生物学实用方法和技术 . 北京 : 北京医
科大学 、 中国协和医科大学联合出版社 , 19 9 5 . 5 2
7 N e i l S M
, e t a l
.
J I
n v e s t eD
r m a t o l
,
1 98 4
,
8 3
:
15
8 M o s n
i a n n T
.
J Im m u n o l M e th记 , , 19 8 3 , 6 5 : 5 5
9 徐友涵 . 国外医学 一 分子生物学分册 , 1 9 85 , 7 (3 ) : 1 16
1 0 Y o s h ih i r o K i k u e h i
.
iB o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n
,
1 9 8 4
,
1 2 3 ( 1 )
:
3 8 5
( 1 9 9 6
一
0 3一 0 6 收稿 )
.
4 8 5
.