全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Apr． 2015，35(2):255 － 260 http:/ / journal． gxzw． gxib． cn
DOI:10． 11931 /guihaia． gxzw201312015
简兴，苗永美，隋益虎，等． 黄瓜 LDC克隆、表达载体的构建及烟草转化研究［J］． 广西植物，2015，35(2):255 －260
Jian X，Miao YM，Sui YH，et al． Cloning and expression vector construction of cucumber LDC and transformation to tabacco［J］． Guihaia，2015，
35(2):255 －260
黄瓜 LDC克隆、表达载体的构建及烟草转化研究
简 兴1，苗永美2*，隋益虎2，边卓吾2，陈存款2，黄春景2，李振兴2
(1． 安徽科技学院 城建与环境学院，凤阳 233100;2． 安徽科技学院 生命科学学院，凤阳 233100 )
摘 要:赖氨酸脱羧酶(LDC)催化赖氨酸脱羧形成尸胺。该研究采用 ＲT-PCＲ 技术从耐冷黄瓜‘Chipper’中
分离到一段 cDNA序列，利用 DNAMAN6． 0软件进行氨基酸序列分析，用 BLASTp 对蛋白的保守序列进行比
对，用双酶切法和 T4DNA连接酶构建了植物超表达载体 pCAMBIA1304-LDC，通过在烟草不定芽诱导和生长
培养基中添加不同浓度的潮霉素(Hyg)以确定不定芽分化和生长的筛选压力浓度，同时优化了菌液浓度、侵
染时间和预、共培养时间 4个农杆菌侵染条件。结果表明:该序列的 CDS 全长具有 648 bp，编码 216 个氨基
酸，BLASTp结果显示该蛋白具有赖氨酸脱羧酶的保守序列，认为分离到的序列为黄瓜 LDC 基因，在 GenBank
中的登录号是 KC202438;当在叶块不定芽诱导培养基中添加 10 mg·L-1的 Hyg 时，芽诱导率明显降低，为 5．
41%;当芽生长培养基中的 Hyg浓度为 20 mg·L-1时，芽苗成活率为 33． 33%，明显低于对照，因此认为 10 mg
·L-1和 20 mg·L-1的 Hyg浓度是抗性芽诱导和生长的筛选浓度;农杆菌侵染时，烟草叶盘不需要预培养，农杆
菌 OD600值为 0． 6，侵染 5 min、共培养 4 d时，侵染效果最好，能获得较高的抗性芽分化率。获得的抗性植株移
栽成活后，叶片 DNA经过 PCＲ鉴定，获得了 29株转化植株，转化率达 93． 55%。转化植株的获得为下一步基
因功能分析提供了材料。
关键词:黄瓜;赖氨酸脱羧酶;烟草;遗传转化
中图分类号:Q943． 2 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2015)02-0255-06
Cloning and expression vector construction of cucumber
LDC and transformation to tabacco
JIAN Xing1，MIAO Yong-Mei2*，SUI Yi-Hu2，BIAN Zhuo-Wu2，
CHEN Cun-Kuan2，HUANG Chun-Jing2，LI Zhen-Xing2
(1． College of Urban Construction and Environment，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，
China;2． College of Life Sciences，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China )
Abstract:Lysine decarboxylase (LDC)catalyzed the decarboxylation of lysine to form cadaverine． To research the mo-
lecular biology function of LDC gene，the cDNA of LDC was cloned by ＲT-PCＲ technique from chilling tolerant‘Chip-
per’cucumber treated under low temperature． The sequence of amino acids and conserved sequence of protein were ana-
lysed with software DNAMAN6． 0 and by BLASTp． A plant expression vector pCAMBIA1304-LDC was constructed by
the methods of double restriction enzyme digestion and T4DNA ligase． The selective concentrations of Hyg for adventi-
tous buds induction and shoots growth were confirmed by adding differents concentration of Hyg to the media，and the in-
fection condition of agrobacterium was optimized． The results showed that the coding sequence of the LDC gene had 648
收稿日期:2014-02-09 修回日期:2014-05-17
基金项目:安徽省科技厅青年基金(1208085QC55);安徽省教育厅重点科研计划项目(KJ2013A074);安徽省大学生创新创业训练计划项目
(AH201310879097);安徽科技学院第十批大学生创新课题(13XSZ52)。
作者简介:简兴(1975-)，男，广西桂林人，博士研究生，讲师，主要从事植物生物技术研究，(E-mail)jianx@ ahstu． edu． cn。
* 通讯作者:苗永美，博士，讲师，主要从事蔬菜遗传育种及生物技术研究，(E-mail)mym416@ 163． com。
bp in length，encoding 216 amino acids which contained lysine decarboxylase conserved sequence，so the sequence was
firmly believed as LDC gene． The accession number was KC202438． The induction rate of adventitious buds reduced to
5． 41% when the concentration of Hyg was 10 mg·L-1，and the survival rate was significantly lower than control group
when adding 20 mg·L-1 Hyg into medium． The optimized transformation condition was no preculture，the suitable con-
centration OD =0． 6，infection for 5 min，and coculture duration 4 d． and higher resistant buds differentiation rate were
gained under the optimized condition． 29 T0 plants were identified by PCＲ technique on DNA level，the transformation
rate reached 93． 55% ． The gene modified plants would be used for the research of LDC gene function in future．
Key words:cucumber;lysine decarboxylase;tabacco;genetic transformation
赖氨酸脱羧酶(Lysine decarboxylase，LDC)具有
催化赖氨酸脱羧形成尸胺的功能(Cadaverine，
Cad)。Cad 是一种多胺(polyamine，PA)，PAs 包括
Put、Spd、Spm和 Cad等。PA能影响植物 DNA、ＲNA
和蛋白质的生物合成、促进生长和发育、延迟衰老，
并且与植物的抗逆性关系密切(刘俊，2004)。在几
种 PA的作用机制研究中，Cad 的研究报道相对较
少。LDC 最早是 1944 年在尸体杆菌和大肠杆菌中
发现的，关于植物中 LDC 的最早报道是在 1979 年
(Michael et al．，1979)。LDC 主要分布和合成部位
是根，在豌豆根伸长区中，LDC 活性是其它部位的 2
倍，根中 Cad 含量比其他部位高 90 多倍，Cad 具有
能促进植物不定根生长和发育的作用(Gamarnik et
al．，1991;Niemi et al．，2002)。Gamarnik et al．
(1991)用 LDC 抑制剂二氟甲基鸟氨酸(α-diflu-
oeomethyl-ornithine，DFMO)处理发芽的大豆种子，
Cad含量减少，胚根发育畸形，而用 DFMO和 Cad 同
时处理，则观察不到胚根畸形现象。关于 LDC 活
性、Cad含量与抗逆性的关系也开展了一些研究，如
Kuznetsov et al．(2007)用 500 mmol·L-1的 NaCl 处
理冰叶日中花，体内 LDC 活性和 Cad 量均有了提
高;油菜叶片中 Cad 含量在渗透胁迫处理时也发生
急剧增加(Aziz et al．，1997);逯明辉等(2005)利用
AFLP技术从萌芽耐冷存有差异的黄瓜中获得了
132 bp长的 LDC 部分片段，推测该基因可能在提高
种子低温发芽力方面起作用;Somnuk et al． (2012)
将生物碱源植物羽扇豆的 LaLDC 转入拟南芥和烟
草，结果尸胺的含量发生变化，但与逆境的关系没有
展开研究;苗永美(2013)通过 qＲT-PCＲ 证明黄瓜
LDC受低温和盐胁迫诱导而上调表达。
以上研究主要从生理层次和基因表达方面揭示
了 LDC、Cad与抗逆的关系，关于 LDC 的分子生物
学以及在抗逆中的作用机理有待深入研究。目前研
究基因功能的主要途径是使基因超量表达和基因沉
默，受体常选用模式植物烟草或拟南芥。因此，本研
究从相对耐冷的黄瓜中克隆到 LDC，构建了超量表
达载体，优化了农杆菌介导的烟草遗传转化，并获得
了转 LDC的烟草植株，为进一步研究该基因的功能
奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 植物材料 美国加工型黄瓜品种‘Chipper’，
烟草受体为‘本氏烟’。
1． 1． 2 载体和菌株 克隆载体 pMD19-T 购自大连
TAKAＲA公司;表达载体为 pCABIA1304、大肠杆菌
DH5α和农杆菌菌株 EHA105 为本实验室保存。
1． 1． 3 试剂 Trizol 试剂、PCＲ 相关试剂、M-MLV 反
转录试剂盒及 DNaseI 试剂盒购自大连 TAKAＲA 公
司;限制性内切酶 Bgl II、Bcu I 和 T4DNA 连接酶购
自 Fermentas公司;凝胶回收试剂和质粒小提试剂盒
购自杭州爱思进生物技术公司;潮霉素(Hyg)、卡那
霉素(Kan)、利福平(Ｒif)和羧苄青霉素(Cab)购自
南京鼎国公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 材料处理及总 ＲNA 提取 ‘Chipper’种子温
水浸种、催芽后播种在草炭基质中，常规育苗，待幼
苗长至 2 ～ 3 片真叶时，4 ℃低温处理 24 h 后取嫩
叶，采用 Trizol法(Promega)提取总 ＲNA。
1． 2． 2 黄瓜 LDC 的克隆 以 Oligo dT 为反转录引
物，参照 TaKaＲa 公司的 PrimeScriptTM 1st Strand
cDNA Synthesis Kit反转录盒说明书合成 cDNA第一
链。为了构建超表达载体，在上游引物 5端加入
Bgl II酶切位点，在下游引物 5端加入 Bcu I酶切位
点，黄瓜赖氨酸脱羧酶基因克隆的引物设计参照张
万萍(2009)的研究，引物序列:上游引物 S1:5-
GCGAGATCTGATGGAGGGTTTGATTATGAATC; 下
游 引 物 S2: 5-TATACTAGTCTAGAGATAGC-
CAAGCTGCTCT，引物委托上海英骏生物技术有限
652 广 西 植 物 35 卷
公司合成。PCＲ 反应体系为 DNA 20 ng、0． 2 mmol
·L-1 dNTPs 和 10 × Buffer 各 2． 0 μL、25 mm·L-1
MgCl2 1． 2 μL，Taq DNA 聚合酶 0． 2 μL(TaKaＲa)，
加双蒸水至 20 μL体积。扩增程序为 94 ℃ 5 min;
94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环;72 ℃
7 min，10 ℃终止;整个 PCＲ 反应在 PTC-100TMPCＲ
仪上完成。
1． 2． 3 PCＲ 产物的回收与测序 扩增产物经 1%琼
脂糖凝胶分离，利用 Biosciences AxyPrep DNA 琼脂
糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，与 pMD19-T 载体
连接，连接产物转化 DH5α 感受态细胞，在含有 100
mg·L-1 Amp 的 LB平板上挑选单克隆，经菌液 PCＲ
鉴定后将阳性单克隆后送南京金斯瑞生物科技有限
公司测序。
1． 2． 4 LDC超表达载体的构建及农杆菌工程菌株的
获得 阳性克隆经过测序验证后，将克隆扩大培养，
同时培养含 pCAMBIA1304 的 DH5α 获得菌液。按
试剂盒说明分别提取两种质粒 pCAMBIA1304 和
pMD19-T-LDC，并用限制性核酸内切酶 Bgl II和 Bcu
I进行双酶切，酶切产物经凝胶电泳分离后回收目
的片段，T4DNA酶连接回收产物过夜，连接产物转
化大肠杆菌 DH5α，转化菌液涂布 LB + kan 50 mg·
L-1的固体平板上，挑选阳性单克隆用于 PCＲ菌液检
测，并提取重组质粒做酶切鉴定。冻融法转化农杆
菌 EHA105，PCＲ检测鉴定，获得用于转化的阳性工
程菌株。
1． 2． 5 烟草转化条件的研究 (1)Hyg 致敏浓度的
筛选:烟草无菌苗叶盘和芽苗分别接种在 M1:MS +
6-BA1． 0 mg·L-1 + NAA0． 1 mg·L-1和 M0:MS0 的
培养基上并附加 0 ～ 50 mg·L-1的 Hyg，进行不定芽
分化和芽苗伸长的 Hyg临界浓度的筛选，20 d 统计
实验结果。(2)侵染条件的优化:叶块于 M1 培养基
上、黑暗条件下预培养 2 d，工程菌株在 YEB + Ｒif50
mg·L-1 + Kan50 mg·L-1上，28 ℃、200 rpm 振荡培
养至合适浓度，离心收集菌液，用 MS0 液体培养基
重悬，调整 OD值至 0． 2、0． 4、0． 6，将预培养 2 d 的
叶盘在各浓度菌液中分别侵染 5、10、15 min;M1 上
共培养 2 d，转到 M2:M1 + Hyg10 mg·L-1 + Carb
200 mg·L-1做选择培养，每 15 d 转接 1 次，30 d 统
计抗性芽分化率。叶盘做 0、1、2、4 d 的预培养，用
OD =0． 6 的菌液侵染 5 min，分别共培养 1、2、3、4 d
后做选择培养，研究预培养和共培养时间对侵染效
率的影响。
1． 2． 6 转基因植株的鉴定 生根良好的抗性苗经过
炼苗、驯化移栽，15 d 后等到长出新叶，用 CTAB 法
提取 DNA。以转化植株 DNA 为模板，野生型为阴
性对照，重组表达载体为阳性对照，用 S1 和 S2 引物
做 PCＲ鉴定。PCＲ扩增体系和扩增程序同 1． 2． 2，
琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2． 1 黄瓜 LDC基因的克隆
以低温处理黄瓜的 mＲNA 为模板，用 S1 和 S2
为引物，经过 PCＲ 扩增、回收、连接、转化、测序，拼
接，获得了长度为 648 bp 的核酸序列，利用 DNA-
MAN6． 0 软件对测序结果进行拼接并推测了氨基酸
序列，BLASTp结果表明该蛋白具有赖氨酸脱羧酶
保守序列(61 ～ 191 位)，将该基因命名为(Cucumis
sativus lysine decarboxylase，CsLDC)。
图 1 CsLDC 编码区的扩增
M． DL2000 DNA分子标记;1-2． PCＲ扩增产物。
Fig． 1 Amplication of CsLDC coding region
M． DL2000 DNA marker;Line 1-2 ． Amplication of PCＲ．
2． 2 黄瓜 LDC超量表达载体的构建
将 pCAMBIA1304 和 pMD19-T-CsLDC 进行双酶
切(图 2:A)，回收载体的大片段和 648 bp 的目的基
因片段，T4DNA 连接，产物转化感受态 E． coli
DH5α，用引物 S1 和 S2 进行菌液的 PCＲ鉴定(图 2:
B)，并进行双酶切鉴定，构建的超表达载体命名为
pCAMBIA1304-CsLDC 图 谱 (图 3 )。重 组 质
粒冻融法转化农杆菌EHA105，PCＲ法鉴定转化子
(图 2:C)，有目的条带的菌落即为含重组表达载体
的农杆菌，用于烟草的遗传转化。
2． 3 Hyg对叶片芽分化、生长和生根的影响
烟草叶块在添加不同浓度 Hyg 的 M1 上的生长
情况见表 1。当不加 Hyg 时，不定芽分化率达 91．
7522 期 简兴等:黄瓜 LDC克隆、表达载体的构建及烟草转化研究
图 2 LDC和 pCAMBIA1304 的双酶切及重组表达载体菌液 PCＲ 检测 A． LDC 和 pCAMBIA1304 的双酶切 1，2 分别是
pMD19T-sense-LDC酶切前、后产物;3，4 分别是 pCAMBIA1304 酶切前、后产物。B． DH5α的菌液 PCＲ检测 1-10 为单菌落 PCＲ产物;11，
12 分别为阳性和阴性对照。C． EHA105 的菌液 PCＲ检测 1，2 分别为阳性和阴性对照;3-11 为单菌落 PCＲ产物。
Fig． 2 LDC and pCAMBIA1304 digested by Bcu I and Bgl II，identification of recombinant vector using colony PCＲ method
A． LDC and pCAMBIA1304 digested by Bcu I and Bgl II 1，2 are the products of pMD19T-sense-LDC before and after digested by BcuI and BglII re-
spectively;3，4 are respectively that of pCAMBIA1304． B． Identification of DH5α using colony PCＲ method 1-10 are single colony PCＲ products;11，
12 are positive and nagetive control respectively． C． Identification of EHA105 using colony PCＲ method 1，2 are positive and nagetive control respec-
tively;3-11 are single colony PCＲ products．
图 3 表达载体的构建图谱
Fig． 3 Stucture of the express vectors
43%;添加 Hyg 后，叶盘颜色变浅，随着浓度的升
高，黄化程度加重，当浓度提高至 10 mg·L-1时，外
植体黄化率为 83． 78%，芽的分化率仅为 5． 41%，比
对照大大降低。因此认为 10 mg·L-1的 Hyg可以抑
制非转化细胞的生长，是筛选烟草叶块不定芽分化
的敏感浓度。
将叶盘诱导产生的小芽苗转至 M0 附加 0 ～ 50
mg·L-1的 Hyg培养基上，研究 Hyg浓度对芽苗生长
的影响。含有 Hyg的培养基上，部分材料接触培养
基部位变黄，叶片颜色变浅，20 d 统计成活率，结果
见表 2。当 Hyg浓度为 5 mg·L-1时，成活率比对照
下降了 7． 24%，差异不明显，随着浓度的升高，成活
率逐渐降低，Hyg大于 20 mg·L-1时，绝大多数材料
黄化死亡，因此认为芽苗的伸长培养所选用的 Hyg
浓度至少是 20 mg·L-1。
表 1 Hyg浓度对不定芽分化的影响
Table 1 Effects of Hyg on adventitious buds differentiation
Hyg浓度
Concentration
of Hyg
(mg·L-1)
叶盘数
No． of
explant
黄化数
No． of
yellowing
explant
黄化率
Yellowing
rate
(%)
产生芽的
叶盘数
No． of
budding
分化率
Budding
rate
(%)
0 35 0 0 32 91． 43
5 32 18 56． 25 10 31． 25
10 37 31 83． 78 2 5． 41
15 34 31 91． 18 0 0
20 35 35 100 0 0
40 24 24 100 0 0
50 24 24 100 0 0
2． 4 侵染条件对转化率的影响
根据表 3 结果，农杆菌浓度 OD600为 0． 2、0． 4、
0． 6三个浓度下的抗性芽平均分化率分别是
15． 71%、18． 41%、33． 78%，平均分化芽数为 0． 26、
0． 25、0． 91，菌液浓度为 0． 6 时，侵染率最高;侵染
5、10、15 min三个时间的抗性芽平均分化率分别是
22． 73%、25． 28%、19． 88%，平均分化芽数为 0． 74、
0． 3、0． 37，综合考虑认为侵染 5 min 时，侵染效果最
好。此条件下抗性芽分化率达 41． 94%，平均每叶盘
852 广 西 植 物 35 卷
表 2 Hyg浓度对烟草伸长生长的影响
Table 2 Effects of Hyg on the growth of tabacoo shoots
Hyg浓度
Concentration of Hyg (mg·L-1) 0 5 10 15 20 30 40 50
接种苗数 No． of shoot 38 40 41 44 42 45 45 47
成活数 No． of survival 36 35 32 25 14 8 3 0
成活率 Survival rate (%) 94． 74a 87． 50ab 78． 05bc 56． 82cd 33． 33cd 17． 78de 6． 67e 0e
表 3 菌液浓度和侵染时间对转化率的影响
Table 3 Effects of infection concentration and time
on transformation rate
OD600
侵染时间
Infection
time
(min)
叶盘数
No． of
explant
产生芽的
叶盘数
No． of
budding
分化率
Budding
rate
(%)
芽总数
Sum no．
of bud
平均芽数
Average
no． of
bud
0． 2 5 27 4 14． 81 11 0． 41
0． 2 10 27 3 11． 11 3 0． 11
0． 2 15 33 7 21． 21 9 0． 27
0． 4 5 35 4 11． 43 5 0． 14
0． 4 10 29 8 27． 59 8 0． 28
0． 4 15 37 6 16． 22 12 0． 32
0． 6 5 31 13 41． 94 52 1． 68
0． 6 10 35 13 37． 14 18 0． 51
0． 6 15 36 8 22． 22 19 0． 53
分化 1． 68 个芽数。
烟草叶盘在不同的预培养和共培养条件下的转
化率见表 4，预培养的四个时间水平的抗性芽分化
率分别是 9． 28%、6． 28%、8． 50%、0，平均分化芽数
0． 16、0． 12、0． 12、0;共培养的四个时间水平的抗性
芽分化率分别是 1． 38%、3． 79%、4． 45%、14． 44%，
平均分化芽数 0． 04、0． 06、0． 08、0． 25。根据抗性芽
分化率和平均每块外植体两个指标综合考察两个因
素对转化率的影响，认为不做预培养、侵染后做 4 d
的共培养条件下，抗性芽分化率最高，达 27． 03%，
平均分化芽数为 0． 49。
2． 5 T0 代转基因烟草的 PCＲ鉴定
通过农杆菌介导的叶盘转化法将 CsLDC 基因
导入烟草，经过 Hyg 筛选培养后获得 31 株抗性苗，
用 LDC 基因引物 S1 和 S2 进行 PCＲ 检测，其中有
29 株烟草植株扩增出目的片段，WT 型没有扩增出
条带，表明 CsLDC 已经整合到烟草基因组中，转化
率达 93． 55%。
3 讨论与结论
植物在受到逆境胁迫时会产生特异表达基因及
蛋白(杨猛等，2013;马廷臣等，2013)。本研究从低
表 4 预培养和共培养时间对转化率的影响
Table 4 Effects of preculture and coculture
times on transformation rate
预培养时
Preculture
time
(d)
共培养
时间
Coculture
time (d)
叶盘数
No． of
explant
产生芽的
叶盘数
No． of
budding
分化率
Budding
rate
(%)
芽总数
Sum No．
of bud
平均芽数
Average
No． of
bud
0 1 40 1 2． 50 3 0． 08
0 2 41 2 4． 88 2 0． 05
0 3 37 1 2． 70 1 0． 03
0 4 37 10 27． 03 18 0． 49
1 1 33 1 3． 03 2 0． 06
1 2 42 1 2． 38 4 0． 10
1 3 43 1 2． 32 1 0． 02
1 4 46 8 17． 39 13 0． 28
2 1 30 0 0 0 0
2 2 38 3 7． 89 3 0． 08
2 3 47 6 12． 77 9 0． 19
2 4 45 6 13． 33 10 0． 22
3 1 41 0 0 0 0
3 2 40 0 0 0 0
3 3 43 0 0 0 0
3 4 48 0 0 0 0
图 4 转基因植株 DNA 水平上的 PCＲ检测
M． DL2000 DNA分子标记;1． 阳性对照;
2． 阴性对照;3-19． 部分检测植株。
Fig． 4 PCＲ detection of transgenic plants M． DL2000
DNA marker;1． Positive control;2． Negative control;
3-19． Partial of detection plants．
温处理的黄瓜幼苗叶片中分离到了 LDC 基因，LDC
催化 Cad的合成，关于植物中 LDC 蛋白研究报道较
少。Somnuk et al．(2012)利用抑制性消减杂交 PCＲ
技术从苦味羽扇豆中克隆了 La-LDC，编码 1 320
bp，编码 440 个氨基酸，通过转化拟南芥和烟草证明
9522 期 简兴等:黄瓜 LDC克隆、表达载体的构建及烟草转化研究
Cad含量发生变化。CsLDC 蛋白含有 216 个氨基
酸，属于一个保守的蛋白家族，其生物学功能有待通
过转基因烟草验证。烟草常用转基因受体，不同的
烟草品种、菌株和表达载体类型所需要的转化条件
不同(张哲敏等，2013)。烟草遗传转化中，常用的
筛选剂是 Kan 和 Bar，Hyg 用的较少(田苗苗等，
2011)。抗生素浓度是遗传转化体系的关键因素，
决定着转化和筛选效率。不同基因型材料对 Hyg
的敏感程度不同，在不同阶段存在敏感差异，王丹等
(2010)研究了几种杨树叶片分化、生长和生根对
Hyg的敏感程度，发现新杨和欧美杨叶片分化时敏
感浓度为 2． 0 mg·L-1，小黑杨为 3． 0 mg·L-1;山新
杨和小黑杨不定芽生长时的敏感性浓度为 2． 0 mg
·L-1，欧美杨为 1． 0 mg·L-1L;茎段生长和生根时山
新杨和小黑杨的敏感性为 6． 0 mg·L-1，欧美杨为 2．
0 mg·L-1;李建安等(2006)研究证实拟南芥在愈伤
诱导、增殖和细胞悬浮继代所用的浓度分别为 1． 5、
2． 5、25 mg·L-1，而且在液体和固体培养条件下敏
感差异极大。张志忠等(2005)的试验表明，西瓜子
叶块外植体对 Hyg 较为敏感，15 mg·L-1是适宜的
筛选浓度，可明显抑制非转化组织的生长。在本研
究中筛选烟草叶片抗性芽分化的临界浓度为 10 mg
·L-1;而在芽苗伸长阶段，需要提高筛选压力浓度，
不能低于 20 mg·L-1，因为烟草的再生能力强，叶盘
产生的芽量多，通过在伸长培养阶段加大 Hyg 浓度
以避免出现过高的假阳性。通过该筛选方案，取得
了较高的转化率，达 93． 55%。
转化效率是菌液浓度、侵染时间和共培养时间
综合作用的体现，不同的基因型需要转化条件不同。
本研究就外植体的预培养时间、侵染液的活力状态、
侵染时间和共培养时间进行了比较和筛选。在农杆
菌介导的多数植物遗传转化中，一定时间的预培养
可提高转化率，而在本研究中，烟草可以不需要经过
预培养，可能是因为烟草的再生能力强的原因。王
关林等(1998)认为共培养时间必须长于 16 h。在
理论上，农杆菌与植物共培养的时间越长，受侵染的
细胞越多，目的基因的转化频率也就越高，因为共培
养时间过短，T-DNA转移过程不能完成。在本研究
考察的共培养四个水平中，延长共培养可提高转化
率。但在有些研究中发现，共培养的时间太长，农杆
菌过度增殖，子叶会受农杆菌过度感染变褐而死亡，
达不到转化效果，如苗永美(2013)在黄瓜遗传转化
中，发现共培养 3 d比 4 d效果好。
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062 广 西 植 物 35 卷
2． 地衣体灰白色，灰绿色，表面全被白粉霜 3…………………………………………………………………
2． 地衣体褐色，橄榄色，表面全被白粉霜或无 4………………………………………………………………
3． 地衣体散生或不规则覆瓦状排列，小鳞片弱凸具泡状隆起，橄榄绿色至灰绿色，囊层基淡红褐色
小叶泡鳞衣 Toninia sedifolia (Scop．)Timdal……………………………………………………………
3． 地衣体由鳞片组成，有规则的莲座状排列，表面全被霜而成雪白色，囊层基褐色至暗红褐色
白泡鳞衣 Toninia candida (Weber)Th． Fr．………………………………………………………………
4． 鳞片状地衣体呈泡状至圆筒形，少有分枝，呈绿色，橄榄色，上有密集的白色粉霜，具假杯点
泡状泡鳞衣 Toninia physaroides (Opiz)Zahlbr………………………………………………………
4． 地衣体鳞片状，栗色棕色至深褐色，光泽，不被粉霜，上有许多小黑点……暗色泡鳞衣中亚亚种 To-
ninia tristis subsp． asiae-centralis (H． Magn．)Timdal
3 结论
泡鳞衣属是广泛分布的地衣，生境类型多样，在
野外主要生长在土壤、沙漠结皮、岩石、苔藓以及岩
面石浮土上。鳞片状的地衣体，上表面的颜色，地衣
体和子囊盘上粉霜的有无，囊层基、子实层和囊盘被
在 K和浓硝酸中呈现的颜色，孢子形状及其细胞数
量等作为该属地衣种类的主要鉴别特征。
Toninia alutacea，T． candida 和有些 T． caerule-
onigricans(T． sedifolia)种类在颜色和形状上很类
似，但后两者孢子 2 胞。T． caeruleonigricans(T． sed-
ifolia)的地衣体和子囊盘表面上被粉霜情况不比 T．
alutacea，T． candida 强烈。T． physaroides 的橄榄色
泡状至圆筒形鳞片状地衣体、泡状鳞片顶部的粉霜，
T． tristis subsp． asiae-centralis的光泽、栗色棕色至深
褐色、上有许多小黑点的鳞片状地衣体等都是在野
外很容易鉴别的特征。
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5612 期 热衣木·马木提等:新疆泡鳞衣属地衣的研究