全 文 ：研究报告
Research Report
十字花科黑腐病菌中一个受 HpaS调控的基因的功能分析
万惠芳 1 姚家丽 1 苏辉昭 1 李瑞芳 1 李磊 1 陆光涛 1,2*
1广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 2亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530005
*通讯作者, lugt@gxu.edu.cn
摘 要 十字花科黑腐病菌(Xcc 8004)中一对双组份系统 hpaS/hpaR2在致病过程中有重要作用，以前的研
究发现，XC2388的表达可能受 XC3669/XC3670的调控。为分析 XC2388的功能，本试验采用pK18mobSacB
介导的同源双交换的方法构建缺失突变体，对新获得的缺失突变体 DM2388的分析发现，XC2388突变后，
病原菌对寄主萝卜叶的致病力与野生型相比降低 80%，采用 PCR扩增 XC2388完整的 ORF，将新获得的
1 349 bp的 DNA片段克隆在 pLAFR3质粒上，将新获得的重组质粒导入 DM2388，发现互补菌株 CDM2388
的致病力可以恢复至野生型的 60%，表明 XC2388与致病性相关。以MMX培养基为介质绘制生长曲线，经
分析发现突变体的生长严重受阻，在培养基中加入 Thr后可以恢复生长，表明 DM2388可能是与 Thr合成相
关的营养缺陷性菌株。
关键词 十字花科黑腐病菌,致病力,营养缺陷型
Function Analysis of a Gene Isolated from Xanthomonas campestris pv.
campestris Regulated by HpaS
Wan Huifang 1 Yao Jiali 1 Su Huizhao 1 Li Ruifang 1 Li Lei 1 Lu Guangtao 1,2*
1 College of Life Science andTechnology of Guangxi University, Nanning, 530005; 2 State Key Laboratory for conservation and Utilization of Subtrop-
ical Agro-bioresources, Nanning, 530005
* Corresponding author, lugt@gxu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.035.000342
Abstract A two-component system hpaS/hpaR2 of Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) 8004 plays
important roles in regulating bacterial diverse biological processes. Previous studies showed that the expression of
XC2388 may be regulated by XC3669/XC3670. To investigate its function, the deletion mutant of XC2388 was
constructed by using suicide plasmid pK18mobSacB through homologous double-crossover. Analysis revealed that
virulence of the deletion mutant in the host plant decreased 80% compared to the wild-type strain. DNA fragment
with 1 349 bp length located on open reading frame of XC2388 was amplified and inserted into pLAFR3 plasmid
and the formed recombinant plasmid was introduced into DM2388. It was revealed that the complementation strain
CDM2388 restored its pathogenicity to 60% compared with the wild-type level. It indicated that the XC2388 gene
had some effects on virulence. The growth analysis on the MMX medium revealed that the mutant growth was
blocked, but it restored its growth when added threonine in the MMX medium. It revealed that DM2388 may be an
auxotrophic strain which is relation to threonine synthesis.
Keywords Xanthomonas campestris pv. campestris, Virulence, Auxotrophy
基金项目：本研究由国家自然科学基金面上项目(31371263)资助
基因组学与应用生物学，2016年，第 35卷，第 2期，第 342-349页
Genomics and Applied Biology, 2016, Vol.35, No.2, 342-349
动物和人体不能自身合成必需氨基酸，在这些
必需氨基酸中，Lys、Met、Thr、Ile 都是由 Asp 合成
的，因此，这些氨基酸也被称为天冬氨酸衍生氨基
酸。高丝氨酸激酶(homoserine kinase, HSK)在细菌中
是 thrB 基因的编码产物(EC: 2.7.1.39)，属于 GHMP
超家族。GHMP家族的成员参与氨基酸生物合成、半
乳糖代谢、甲羟戊酸途径等几个重要的代谢途径(Bork
et al., 1993)。可见 HSK对微生物正常生长的重要作
用，对于致病菌来说，它也会直接影响自身生长代谢
情况，从而使其致病力大大降低。编码 HSK的基因在
很多植物和微生物中已经被克隆出来，其中包括大肠
杆菌(Theze et al., 1974; Burr et al., 1976; Shames and
Wedler, 1984; Huo and Viola, 1996)、白色念珠菌、大
麦、玉米等。
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.
campestris,以下简称 Xcc)是一种典型的革兰氏阴性
植物病原细菌，是十字花科植物的重要致病菌(杨国
奎等, 2014)。Xcc分泌到细胞外的酶、多糖等可以使其
产生致病性，另外，依赖于 hrp基因的蛋白效应分子
也是其具有致病性的主要原因。在病原菌的信号转导
过程中，目前认为双组分系统(two component system,
TCS)起着主要的作用(莫才清和李阜棣, 1997,微生物
学杂志, 17(2): 41-46)，所以 TCS与致病性往往有直接
或者间接的关系。TCS与致病菌对寄主的识别侵染、
应对环境改变所作出的一系列反应、对环境渗透压的
改变引起的生理学应答、趋光性、趋化性以及孢子产
生等密切相关(Nixon et al., 1986; Stock et al., 2000;邱
全胜, 2000,生物化学与生物物理进展, 27: 593-596)。
十字花科黑腐病菌中共有编码 TCS的基因 106
个(Qian et al., 2005)，本实验室在以往的工作中，鉴定
了一个 hpaS基因编码 TCS中的组氨酸激酶，将其突
变后得到的菌株致病力显著降低，通过凝胶双向电
泳分析，发现一个编号为 XC2388的基因的表达受
HpaS调控。为研究 XC2388的功能，本实验构建了其
缺失突变体和互补菌株，检测了其致病性并确定突
变体为营养缺陷型菌株。
1结果与分析
1.1 XC2388的生物信息学分析
XC2388 位于 Xcc 800 4 基因组 2 879 381~
2 880 349 bp之间，全长 969 bp，预测其编码一个高
丝氨酸激酶 (homoserine kinase, HSK)，利用 KEGG
服务器对其结构域进行分析，发现它在 N端和 C端
分别包含一个 GHMP 激酶结构域，分析还发现，
XC2388编码的氨基酸序列在其它物种中有同源性，
并且也都注释为高丝氨酸激酶(图 1)。
1.2 XC2388与 Xcc的致病性有关
1.2.1缺失突变体构建
为了明确 XC2388 (HSK)对十字花科黑腐病菌
的影响，采用 pK18mobSacB自杀质粒介导的同源双
交换的方法，构建 XC2388的缺失突变体。设计带有
合适酶切位点的上游引物 2388LF/2388LR及下游引
物 2388RF/2388RR，分别扩增上游片段 901 bp，下游
片段 922 bp，酶切后连接到 Pk18mobSacB相应的酶
切位点上得到重组质粒 pD2388，将测获得的重组质
粒导入野生型 Xcc 8004菌株得到三亲结合子，对三
亲结合子进行筛选，并以 2388LF和 2388RR为引物
进行 PCR验证得到 1 822 bp的 DNA产物(图 2A)，设
计 XC2388的内部引物 2388内 F/2388内 R经 PCR
验证得到 512 bp的 DNA产物(图 2B)。
1.2.2致病力试验
对寄主满身红萝卜进行致病力侵染实验，结果
表明 DM2388突变体致病力较之野生型 Xcc菌株下
降 80% (图 3)，初步表明 XC2388与致病性相关。
1.2.3互补菌的构建及致病力分析
为了进一步明确黄单胞菌中的 HSK 的功能，
PCR 扩增一段带有 XC2388 完整基因的 DNA片段
(1 367 bp;图 4)，经 EcoRⅠ/HindⅢ酶切并回收后，在
pLAFR3质粒的多克隆位点处将其插入得到重组质粒，
经测序验证正确后通过三亲本结合的方法导入缺失突
变体DM2388中，得到反式功能互补菌 CDM2388。
图 2突变体构建(A, B)
注: M: 100 bp DNA分子标记; A: 1:以突变体总 DNA为模板,
用 2388LF/2388RR为引物 PCR 扩增得到的产物; 2: 以 8004
基因组 DNA为模板,用 2388LF/2388RR为引物 PCR扩增得
到的产物; B: 2~5: 以突变体总 DNA为模板, 2388 内 F/2388
内 R 为引物 PCR 的产物 ; 1: 以 8004 基因组 DNA 为模板 ,
2388内 F/2388内 R为引物 PCR的产物
Figure 2 Construction of the mutant construction (A,B)
Note: M: 100 bp DNA Molecular Weight Marker; A: 1: PCR was
performed with DM2388 total DNA as template, 2388LF/2388RR
as primers; 2: PCR was performed with wild type 8004 total
DNA as template, 2388LF/2388RR as primers; B: 2~5: PCR was
performed with DM2388 total DNA as template, 2388LF/2388LR
as primers; 1: PCR was performed with wild type 8004 total DNA
as template, 2388LF/2388LR as primers
十字花科黑腐病菌中一个受 HpaS调控的基因的功能分析
Function Analysis of a Gene Isolated from Xanthomonas campestris pv. campestris Regulated by HpaS 343
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 1 XC2388编码的氨基酸同源序列在不同物种间的比较
Figure 1 The annotation comparison in different species which has homologous sequences of XC2388
图 3突变体 DM2388和互补菌 CDM2388的致病性能分析
Figure 3 Pathogenicity anlysis of DM2388 mutant and CDM2388
complementation strain
图 4互补菌株的鉴定
注: M: 100 bp DNA分子标记; 1:以 CDM2388的质粒为模板,
以 C2388F/C2388R为引物的 PCR产物
Figure 4 Identification of the complementation strain
Note: M: 100 bp DNA Molecular Weight Marker; 1: PCR was
performed with CDM2388 as template, C2388F/C2388R as
primers
实验中对互补菌株的致病性进行了检测，发现
CDM2388的致病力可以恢复至野生型菌株的 60%
(图 3)，表明 XC2388与致病性相关。
1.3 XC2388与细菌生长有关，含营养缺陷的检测
为分析 DM2388致病力降低的原因，检测了突
344
十字花科黑腐病菌中一个受 HpaS调控的基因的功能分析
Function Analysis of a Gene Isolated from Xanthomonas campestris pv. campestris Regulated by HpaS
变体和互补菌株在寄主叶内和 MMX培养基上的生
长情况，MMX平板检测(图 5A)和液体培养基中生长
曲线的检测(图 5B)表明 DM2388在 MMX培养基上
生长严重受阻，而在寄主叶内的生长曲线(图 6)也表
明，DM2388在寄主体内几乎停止生长，分析互补菌
株的生长情况，发现在 MMX培养基和寄主体内，
CDM2388均可以部分恢复生长。
综合上述实验结果，表明 DM2388为营养缺陷
性菌株，HSK不仅在其他植物和微生物中是必需的，
也是 Xcc生长所必不可少的。
1.4 DM2388是与 Thr合成相关的营养缺陷型菌株
KEGG预测 XC2388编码 HSK，有研究报道在
图 5突变体及互补菌株在MMX培养基上的生长分析
Figure 5 Detection of growth of the mutant and complementation
on MMX medium plate
图 6野生型,突变体及其互补菌株在叶内的生长速率曲线
Figure 6 Growth curve of wild type, mutant and complementation
strain in leaves
一些微生物中 HSK参与 Thr的合成，为了明确 HSK
在 Xcc中是否和 Thr合成相关，本研究在 MMX的
培养基中加入了 0.15%的 Thr，发现在MMX+0.15%
Thr的培养基上 DM2388可以恢复生长(图 7)，另外
图 5B中添加了一个 MMX+0.15% Thr的对照，发现
DM2388在 MMX培养基中的生长情况远远不如在
MMX+0.15% Thr中的生长。结果表明 XC2388参与
Thr的合成，XC2388功能丧失后，由于 Thr的合成途
径被阻断，从而使菌体生长受阻。
1.5 XC2388与 XC2389共转录
生物信息学分析发现 XC2388可能没有自身的
启动子，而是和处于其上码编码高丝氨酸脱氢酶(ho-
moserine dehydrogenase)的基因 XC2389 共转录，提
取 Xcc 总 RNA，反转录得到 cDNA 链，分别设计
XC2389内部(341 bp)引物 RT1F/RT1R、XC2388内部
(400 bp) 引物 RT2F/RT2R和包括 XC2389终止密码
子前和 XC2388起始密码子后(601 bp)的引物 RT3F/
RT3R 进行 PCR 扩增(图 8)，以 RT3F/RT3R 为引物
可以扩增出条带，RT-PCR 的结果表明 XC2388 与
XC2389共转录。
2讨论
由于营养缺陷型菌株是诱变后的菌株，他们合
成糖类、维生素和氨基酸等必需营养物质的能力受
到限制，此类异常菌株只能依靠在培养液中添加所
缺的营养成分后才能恢复正常生长，因此也增加了
他们的生产实践意义和科研意义；此类菌株可以用
于发酵生产氨基酸以及核苷酸等代谢中间物，又是
在科学研究中重要的遗传标记菌株。
XC2388编码一个高丝氨酸激酶(homoserine ki-
nase, HSK)，HSK在大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)
和其它微生物中的作用是参与 Thr的合成，Thr合成
的前体是 L-homoserine，而 HSK的直接作用便是将
homoserine 转化为 L-homoserine，L-homoserine 对
HSK有抑制作用。将 XC2388突变后菌体在 MMX
图 7野生型,突变体及互补菌株在MMX+0.15% Thr培养基上
的生长情况分析
Figure 7 Growth analysis of the wild type, mutant and comple-
mentation strain on MMX+0.15% Thr medium plate
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基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 8 XC2388与 XC2389基因共转录的 RT-PCR分析
注 : M: 100 bp DNA 分子标记 ; 1: 以 cDNA 为模 板 ,
2388RT1F/2388RT1R 为引物扩增得到的 PCR 产物 ; 2: 以
8004总 DNA为模板, 2388RT1F/2388RT1R为引物扩增得到
的 PCR产物; 3:以 cDNA为模板, 2388RT2F/2388RT2R为引
物扩增得到的 PCR 产物 ; 4: 以 8004 总 DNA 为模板 ,
2388RT2F/2388RT2R为引物扩增得到的 PCR产物; 5:以 cD-
NA为模板, 2388RT3F/2388RT3R为引物扩增得到的 PCR产
物; 6: 以 8004 总 DNA为模板, 2388RT3F/2388RT3R 为引物
扩增得到的 PCR产物
Figure 8 Cotranscription analysis of gene XC2388 and XC2389
by using RT-PCR
Note: M: 100 bp DNA Molecular Weight Marker; 1: PCR was
performed with cDNA as template, C2388F/C2388R as primers;
2: PCR was performed with cDNA as template, C2388F/C2388R
as primers; 3: PCR was performed with cDNA as template,
C2388F/C2388R as primers; 4: PCR was performed with cDNA
as template, C2388F/C2388R as primers; 5: PCR was performed
with cDNA as template, C2388F/C2388R as primers; 6: PCR was
performed with cDNA as template, C2388F/C2388R as primers
培养基上不能正常生长，经过反式功能互补实验鉴
定 DM2388是营养缺陷性菌株，在 MMX培养基中
添加 Thr后菌体可以恢复生长，说明 XC2388与 Thr
的合成相关。可见 Xcc与其它微生物合成 Thr的途
径一样，并且 Thr都是菌体自身生长代谢必不可少
的能源物质，不一样的是，动物和人体并不能自身合
成必需氨基酸，必需从食物和周围环境中吸取，而现
在已经在很多微生物和植物体内发现了编码生成
Thr的一簇基因，而 HSK又是生成 Thr的必要物质。
HSK所属的超家族 HGMP和细菌的基本生长代谢
密切相关，HSK在 Xcc 8004中的发现对进一步研究
Xcc的致病机理有重大意义，将 HSK大量克隆后对
生物法合成人类必需氨基酸提供了物质基础。
3材料与方法
3.1菌株和质粒
表 1展示详细信息。
3.2引物
表 2展示实验所用引物，全部由华大基因合成。
3.3试剂
Ex Taq DNA polymerase、Taq DNA polymerase、
Restriction enzymes 及 T4 ligase (Promega)。DNA
purification kit、Gel recycle kit 以及 RNA extraction
kit、Reverse transcription kit (Omega)。
3.4实验方法
3.4.1菌株培养
Xcc液体培养用 NYGB培养基(1 L:蛋白胨 10 g,
酵母粉 3 g,甘油 20 g, pH 7.0)，28℃摇床培养 14~16 h，
200 r/min。NYGB液体培养基中添加 1.5%琼脂粉即
成固体培养基，菌株涂布其上后 28℃静置培养。
E. coli液体培养用 LB培养基(1 L:胰蛋白胨 10 g,
酵母提取粉 5 g, NaCl 10 g, pH 7.0)，37℃摇床培养
12 h，200 r/min。固体培养用 LA培养基(1 L LB液体+
15 g琼脂粉)，其上菌株于 37℃静置培养。
MMX 培养基 (K2HPO4 (磷酸二氢钾 ) 4 g/L,
Na3C6H5O7 (柠檬酸三钠) 1 g/L, KH2PO4 (磷酸氢二钾)
6 g/L, (NH4)2SO4 (硫酸铵) 2 g/L, MgSO4·7H2O (七水
硫酸镁) 0.2 g/L, C6H12O6葡萄糖 5 g/L, pH 7.0)。MMX
固体培养基的配制方法为将 1.5%的琼脂粉加入液体
培养基中。
抗生素工作浓度：Kanamycin (卡那霉素 , Km)
25 μg/mL，Spectniomycin (壮观霉素, Spc) 50 μg/mL，
Rifamycin (利福平, Rif) 5 μg/mL。
3.4.2提取 DNA
提取质粒参考(Birnboim and Doly, 1979)，提取
Xcc总 DNA参考(Chen and Kuo, 1993)。
3.4.3提取 RNA
酸酚法：将 400 μL TES缓冲液加入到冻存的细
胞中，混匀后再加入 400 μL酸性酚，然后剧烈振荡
2 min；接着在 60℃环境下振荡 1 h (1 400 r/min,每
10 s振荡一次)，振荡结束后冰浴 5 min，再离心 10 min
(4℃, 12 000 r/min)。收集上清，加入 400μL氯仿，然后
剧烈振荡 2min后再次离心 10min (4℃, 12 000 r/min)，
收集上清，加入 30~35μL3mol/L的醋酸钠和 2.15倍
346
体积的冰乙醇(无水)，于 -20℃环境下静置 30 min
后离心 15 min (4℃, 12 000 r/min)，弃上清，最后用
30 μL DEPC水将得到的沉淀溶解。
TES:酸酚(v:v)=1:1。
3.4.4 RT-PCR
将野生型菌株 Xcc 8004和 XC3670的缺失突变
体 DM3670分别在 NYGB培养基中培养，28℃摇床
培养至 OD600达到 0.6~1.0之间，使用试剂盒法提取
总 RNA，对总 RNA的纯度和质量检测之后，存放于
表 1本实验所用菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids in this study
菌株和质粒
Strains and plasmids
Xanthomonas campestris
pv. campestris, Xcc, Xcc8004
DM2388
CDM2388
Escherichia coli
E. coli DH5α
Plasmids
pk18mobSacB
特征
Characteristics
十字花科黑腐病菌野生型菌株 Rifr
Xanthomonas campestris pv. campestris, Rifr
Xcc8004中缺失 XC2388, Rifr
Xcc8004, but XC2388 was deleted, Rifr
CDM2388中含有 pL3_C2388, Rifr, Tcr
CDM2388 harbouring pL3_C2388, Rifr, Tcr
fhuA2, Δ(argF-lacZ) U169, phoA, glnV44, Φ80,
Δ(lacZ) M15 gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17
含有 sacB基因的 pK18mob衍生质粒, Kanr
sacB, lacZa, Kanr, mobilizable vector,
allows for selection of double-crossover
来源
Sources
本实验室
Laboratory collection
本研究构建
This work
本研究构建
This work
Gibco BRL生物技术公司
Gibco biotechnology companies
本实验室
Laboratory collection
本实验室
Laboratory collection
注: Rifr为利福平抗性; Kanr为卡那霉素抗性; Spcr为壮观霉素抗性; Gmr为庆大霉素抗性
Note: Rifr for rifampicin resistance; Kanr for kanamycin resistance; Spcr for spectinomycin resistance; Gmr for gentamicin resistance
表 2实验所用引物
Table 2 the primers used in this research
引物名称
Name of primers
2388LF/2388LR
2388RF/2388RR
2388RF/2388RR
C2388F/C2388R
RT1F/RT1R
RT2F/RT2R
RT3F/RT3R
引物序列(5-3)
Primer sequence (5-3)
GAAGAATTCCCACGCCCACCGATCTGGAG
GGGTCTAGACTGATTCACAAGCGTGCCCC
GCGTCTAGATGGGTGACGCCGATCAACAG
GCGAAGCTT ATCCTTGAAGGCTGCGGTGG
ACAGTTGGATCCTTGAACTGGAGATCGACAA
ACAGTTAAGCTT CTGTTTCGCCTGCGCAAAG
GGGAGAATTCCGATCAGCCTGGACGATGTC
ACAGTTAAGCTT TCATGCAAGCAGCCGTGCCG
ACAGTTGAATTCTGAGCGGCTAAGCTCCATGCGGCAT
ACAGTTAAGCTT GGTGTGAGACCTGGCTTC
ACAGTTGAATTCCCGGTCAGCACCGGCCAGCTCTAT
ACAGTTAAGCTTCCTGCGCAAAGCCGGCAATCAGGG
ACAGTTGAATTCGCACAGCTGCAGACGGTGGACGAC
ACAGTTAAGCTTCCGCACGCAGCGACATCAATGCCG
扩增片段长度(bp)
Length of amplified fragment (bp)
901
922
512
1 349
400
341
601
注:下划线表示相应的限制性酶切位点,前为保护碱基
Note: The underlined parts are restriction enzyme sites, six protecting nucleotides were before it
-70℃保存备用。以上各 RNA样品制备好后之后，使
用 RevertAidTM第一链合成试剂盒进行 cDNA 第一
链的合成。用以上制备的 cDNA样品为模板，分别以
RT1F/RT1R、RT2F/RT2R、RT3F/RT3R 为引物进行
PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析条带的有无。
3.4.5突变体及互补菌株的构建
用 Vcetoer NTI 9.0设计 XC2388上游同源片段
引物 2388LF/2388LR (EcoRⅠ/XbaⅠ)、下游同源片段
的引物 2388RF/2388RR (XbaⅠ/HindⅢ)，常规PCR
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基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
扩增后，将产物酶切并插入到 pK18mobSacB中，经
转化后得到重组质粒 pD2388，测序验证无误后通过
三亲本杂交技术将重组质粒 pD2388导入到宿主菌
Xcc 8004中。后将得到的三亲结合子涂布在含有 Rif
抗生素的 10%的蔗糖平板上，筛选出同源重组后的
缺失突变体 DM2388，并用 PCR方法验证。
以 C2388F/C2388R为引物扩增完整的 XC2388
基因，经 EcoRⅠ/HindⅢ酶切插入到 pLAFR3 中，
PCR验证无误后导入到 DM2388菌株中，Rif、Tc抗
性筛选互补菌株 CDM2388。
3.4.6营养缺陷性检测
取待测菌株的过夜培养物，离心收集菌体，用适
量MMX培养基重悬菌体，取 2 mL在分光光度计上
测定 OD600值，根据吸光度值，用 MMX培养基将菌
体浓度调节至 OD600为 0.1。用微量移液器精确吸取
2 μL浓度己调一致的待测菌液，接种于不含抗生素
的MMX平板上，28℃培养 2 d，观察突变体是否能正
常生长。实验以野生型菌株为对照，实验重复 3次。
3.4.7培养基中生长曲线的测定
将待测菌株摇床培养过夜后，离心收集菌体并
用MMX液体培养基悬浮菌体，将 OD600值调至 1.0，
按照 10%的接种量转接至不含抗生素的 MMX培养
基中，每个待测菌设 3个重复，28℃摇床培养 5 d，每
隔 12 h测定 OD600值，以时间为横坐标，OD600值为
纵坐标绘制生长曲线。
3.4.8致病性检测
本实验采用剪叶法在宿主满身红萝卜(由本实验
室种植)上接种 Xcc 菌株，检测其致病能力(Dow et
a1., 2003)。实验中选用 5 株 DM2388 和 3 株 Xcc
8004。具体操作为：用 NYGB培养基将过夜培养的
Xcc菌液稀释到 OD600=0.001，手术剪经过灭菌处理后
在健康叶片距离叶尖 1 cm处垂直于中轴叶脉剪去叶
尖。在伤口处接种菌液，并于 25~30℃培养 7~10 d，观
察病斑变化，并于第 10天测量叶片病班长度。每一
菌株进行 3个重复(20张叶片 /重复)。
3.4.9叶内生长曲线的测定
将待测菌株接种至含有相应抗生素的 NYGB培
养基中，28℃培养 16~20 h，测定 OD600 值并调至
0.001。用事先灭菌的剪刀蘸取菌液，挑选叶龄和大小
一致的叶片，在距离叶尖 1 cm处垂直于中脉剪断，
每个待测菌株剪 70~80片叶子，并设 3个重复菌。接
种后没 24 h选取各菌株的 5片大小相近的叶子，用
脱脂棉蘸取 75%乙醇轻轻擦去叶子表面的灰尘和杂
质，待晾干后放入事先灭菌的研钵中加入 5 mL
NYGB培养基充分研磨成匀浆，吸取 100 μL稀释至
需要的浓度，涂在含有相应抗生素的 NYGA平板上，
置于 28℃培养箱中倒置培养 2~3 d。对长出的菌落进
行计数，计算平均每张叶片的活菌数，以取样时间为
横坐标，菌数的对数值为纵坐标绘制生长曲线。
作者贡献
本试验由陆光涛教授指导；万惠芳完成实验操
作、数据分析及论文撰写等；姚家丽参与部分实验；
苏辉昭、李磊和李瑞芳提出了宝贵意见。
致谢
本研究由国家自然科学基金面上项目
(31371263)资助。
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十字花科黑腐病菌中一个受 HpaS调控的基因的功能分析
Function Analysis of a Gene Isolated from Xanthomonas campestris pv. campestris Regulated by HpaS 349