全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ　３２（２）：２２６－２３０　　　　　　　　　　　　 　　　　 ２０１２年３月　
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１２．０２．０１６
马铃薯遗传转化体系的优化及玉米
淀粉分支酶基因ＳＢＥⅡｂ的导入
范亚丽１，阮　颖２＊，刘春林２
（１．阜阳师范学院 生命科学学院，安徽 阜阳２３６０３７；２．湖南农业大学 作物基因工程省重点实验室，长沙４１０１２８）
摘　要：以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料，建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系。通过
农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因（Ｓｔａｒｃｈ　ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｂ，ＳＢＥⅡｂ）的过表达载体转化马铃薯，接种
７６２个茎段，共获得３５株抗性植株。经ＰＣＲ检测获得了４株转基因阳性植株；对转基因植株进一步进行
ＧＵＳ活性组织化学染色，发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色，表明外源ＳＢＥⅡｂ基因已整合到马
铃薯基因组，且正常表达。
关键词：玉米淀粉分支酶基因；马铃薯；遗传转化；淀粉
中图分类号：Ｑ７８　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１０００－３１４２（２０１２）０２－０２２６－０５
① Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ａｎｄ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　ｓｔａｒｃｈ
ｂｒａｎｃｈｉｎｇｅｎｚｙｍｅ　ｇｅｎｅ　ＳＢＥⅡｂｉｎｔｏ　ｐｏｔａｔｏ
ＦＡＮ　Ｙａ－Ｌｉ　１，ＲＵＡＮ　Ｙｉｎｇ２＊，ＬＩＵ　Ｃｈｕｎ－Ｌｉｎ２
（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｙａｎｇ　Ｔｅａｃｈｅｒｓ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｆｕｙａｎｇ　２３６０３７，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｒｏｐ　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈｕｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０１２８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｐｏｔａｔｏ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｕｂｅ　ｐｏｔａｔｏ　ｐｌａｎｔ－
ｌｅｔｓ　ａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ　ｍａｉｚｅ　ｓｔａｒｃｈ　ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｇｅｎｅ（ＳＢＥⅡｂ）ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
ｉｎｔｏ　ｐｏｔａｔｏ　ｕｓｉｎｇ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．７６２ｓｔｅｍ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｆｅｃ－
ｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ　ｍｅｔｈｏｄ．４ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，
ｉｍｐｌｙｉｎｇ　ｔｈａｔ　ＳＢＥⅡｂｇｅｎｅ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐｏｔａｔｏ　ｇｅｎｏｍｅ．Ｉｔ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ＧＵＳｇｅｎｅ　ｃｏｕｌｄ　ｎｏｒｍａｌ－
ｌｙ　ｂｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｓｔｅｍ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｐｏｔａｔｏ　ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｓｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｏｔａｔｏ　ｐｌａｎｔｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍａｉｚｅ　ｓｔａｒｃｈ　ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｇｅｎｅ；ｐｏｔａｔｏ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｓｔａｒｃｈ
　　淀粉占玉米籽粒总重的６４％～７８％，是籽粒最
主要的成份。玉米淀粉的生物合成涉及４类酶－
ＡＤＰＧ焦磷酸化酶（ＡＧＰ）、淀粉合成酶（ＳＳ）、淀粉
分支酶（ＳＢＥ）和去分支酶（ＳＤＢＥ），淀粉分支酶
（ＳＢＥ）催化葡萄糖以α－１，６－糖苷键连接，形成分支
结构（Ｓｍｉｔｈ等，１９９７）。目前淀粉生物合成途径中
的几个主要酶的基因相继被克隆，其中玉米分支酶
基因 ＳＢＥⅡａ、ＳＢＥⅡｂ 也已克隆 （Ｈａｎｎａｈ　＆
Ｊａｍｅｓ，２００８）。玉米的淀粉分支酶ＳＢＥ有三种同工
酶即ＳＢＥＩ、ＳＢＥⅡａ和ＳＢＥⅡｂ，ＳＢＥⅡａ主要存在
于叶片中，而ＳＢＥＩ和ＳＢＥＩＩｂ主要存在于胚乳中
（Ｊｅｏｎ等，２０１０）。遗传研究表明高支链淀粉主要是
① 收稿日期：２０１１－０８－２１　　修回日期：２０１１－１２－０８
基金项目：国家自然科学基金（３１０００１３２）；阜阳师范学院校级自然科学基金（２０１０ＦＳＫＪ１２）［Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（３１０００１３２）；Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｕｙａｎｇ　Ｔｅａｃｈｅｒｓ　Ｃｏｌｅｇｅ（２０１０ＦＳＫＪ１２）］
作者简介：范亚丽（１９８２－），女，河南商丘人，硕士，讲师，主要从事植物生物技术，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｆａｎｙａｌｉ０６０１＠１６３．ｃｏｍ。
＊通讯作者：阮颖，女，博士，教授，主要从事植物分子生物学研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｙｉｎｇｒｕａｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。
由ＳＢＥⅡｂ基因控制。因此，通过反义技术将玉米
淀粉分支酶ＳＢＥⅡｂ基因的全长ｃＤＮＡ转化到玉米
中，发现转基因籽粒中直链淀粉含量显著提高（姚新
灵等，２００５）。随着我国马铃薯淀粉工业的发展，选
育出高淀粉含量的品种尤为重要。马铃薯含有８％
～３４％的淀粉，其中支链淀粉占７５％～８０％（Ｂｕｒ－
ｔｏｎ等，１９９７）。直链淀粉与支链淀粉的比例及支链
淀粉的特性决定了淀粉粒的结构，进而影响着淀粉
的质量、功能和应用。改变淀粉的质量，如高支链、
低支链、低直链或高直链的比例，无论在食品还是工
业应用上都有很大的潜力（王琴等，２００６）。
　　ＳＢＥ是支链淀粉合成的关键，在植物淀粉生物
合成过程中起重要调节作用，一方面它能切开以α
（１－４）糖苷键连接的葡萄糖，另一方面它能把切下的
图１　表达载体ｐＣＡＳＢＥⅡｂ结构
Ｆｉｇ．１　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒ　ｐＣＡＳＢＥⅡｂ
图２　马铃薯遗传转化实验流程
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ
１－２．１５ｄ的马铃薯试管苗；３．预培养的茎段；４．茎段抗性愈伤组织段诱导；５－８．抗性不定芽的诱导；９．抗性不定芽的生根。
１－２．Ｐｏｔａｔｏ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ａｆｔｅｒ　１５ｄａｙｓ；３．Ｐｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｓｔｅｍ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ；４．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｅｍ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｃａｌｉ；５－８．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｓｈｏｏｔｓ；９．Ｒａｄｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｓｈｏｏｔｓ．
７２２２期　　　　范亚丽等：马铃薯遗传转化体系的优化及玉米淀粉分支酶基因ＳＢＥⅡｂ的导入
图３　抗性试管薯的诱导　１．马铃薯试管苗茎段；２－３．诱导的试管薯。
Ｆｉｇ．３　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　１．Ｐｏｔａｔｏ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｓｔｅｍ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ；２－３．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｔａｔｏ　ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｓ．
短链通过α（１－６）糖苷键连接于受体链上，形成分支
结构。其活性高低影响了直、支链淀粉的比例，还可
改变支链淀粉的结构，形成分支程度不一的支链淀
粉，从而赋予淀粉新的理化特性。本研究以马铃薯
脱毒试管苗茎段为转化受体材料，建立并优化农杆
菌介导的马铃薯遗传转化体系，进而利用农杆菌介
导法，将玉米淀粉分支酶ＳＢＥⅡｂ基因导入到马铃
薯普通栽培种大西洋（Ａｔｌａｎｔｉｃ）中，旨在增强淀粉
分支酶基因的表达，提高马铃薯块茎支链淀粉的含
量，为进行马铃薯品种改良和分子育种探索新方法。
１　材料与方法
１．１材料
采用生产上主栽的马铃薯脱毒试管苗，品种为
大西洋（Ａｔｌａｎｔｉｃ）。菌株为含目的ＤＮＡ片段表达
图４　马铃薯转基因植株部分ＰＣＲ检测结果
Ｆｉｇ．４　ＰＣＲ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｏｔａｔｏ　ｐｌａｎｔｓ
Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；１－７．抗性植株；８．阴性对照
（非转基因苗）；９．阳性对照（质粒ＰＣＲ）。
Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；１－７．Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ；８．Ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔ；９．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ．
图５　马铃薯转基因植株的ＧＵＳ检测
Ｆｉｇ．５　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＧＵＳ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｏｔａｔｏ　ｐｌａｎｔｓ
１－２．转基因苗茎段ＧＵＳ基因表达检测；３．转基因苗叶片ＧＵＳ基因表达检测；４．试管薯
ＧＵＳ基因达检测；Ａ、Ｂ、Ｃ．转基因试管薯；ＣＫ１、ＣＫ２．非转基因试管薯。
１－２．ＧＵＳｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓｔｅｍ；３．ＧＵＳ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｅａｆ；４．ＧＵＳ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｏｔａｔｏ　ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒ；Ａ，Ｂａｎｄ　Ｃ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｏｔａｔｏ　ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒ；ＣＫ１　ａｎｄ　ＣＫ２．ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｏｔａｔｏ　ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒ．
８２２ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３２卷
载体的农杆菌菌株：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ＬＢＡ４４０４，湖南农业大学作物基因工程实验室提
供；质粒载体为ｐＣＡＳＢＥⅡｂ，结构如图１。
１．２试验方法
１．２．１马铃薯转化系统的建立和优化　以马铃薯脱
毒试管苗茎段为转化受体材料，研究潮霉素（Ｈｙ－
ｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ，Ｈｙ）选择压、预培养时间、侵染时间、共
培养时间及农杆菌浓度，对农杆菌介导的马铃薯遗
传转化体系进行建立和优化。将马铃薯脱毒试管苗
剪成不含腋芽长０．５ｃｍ左右的茎段，接种于含 Ｈｙ
浓度为０、１、２、３、４、５、６和７ｍｇ／Ｌ的诱导培养基
中，进行愈伤诱导中选择压力的优化；取脱毒试管苗
带腋芽的茎段，分别插入含 Ｈｙ浓度为０、１、２、３、４、
５、６和７ｍｇ／Ｌ的生根培养基中，进行生根过程中选
择压力的优化；预培养０、１、２、３和４ｄ后，用菌液侵
染，通过观察愈伤生长情况，从而优化预培养时间；取
预培养３ｄ的茎段，接种于愈伤培养基中，分别共培
养０、１、２、３和４ｄ后，进行共培养时间的优化。从抗
性平板上挑取单菌落接种于含２５ｍｇ／Ｌ的利福霉素
（Ｒｉｆ）、５０ｍｇ／Ｌ的链霉素（Ｓｔｒ）和５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素
（Ｋａｎ）５０ｍＬ的ＹＥＢ液体培养基中，２８℃、２５０ｒｐｍ
震荡培养过夜，然后取５ｍＬ接种于５０ｍＬ含同样抗
生素的ＹＥＢ液体培养基中，振荡培养至 ＯＤ６００＝
０．２、０．５、０．８与１．０时，对菌液浓度的确定。
　　将预培养后的马铃薯组培苗茎段投入准备好的
菌液中进行浸染，室温下不断的摇动菌液使外植体
与菌液充分接触，浸染时间分为３、５、１０、１５和２０
ｍｉｎ　５个平行组。对照预定时间，将转化材料取出，
再用灭菌滤纸拭去表面菌液，转入共培养培养基 ＭＳ０
（ＭＳ无激素培养基）。２８℃暗培养，共培养后转到加
有适当浓度Ｈｙ和Ｃｅｆ的愈伤培养基上，待愈伤组织
长到适当时间转入到抗性分化培养基上诱导分化。
将分化苗转入抗性生根培养基上诱导生根。
１．２．２马铃薯试管薯的诱导　待试管苗壮苗后进行
切段，将单节茎段或带有３～５个腋芽的多节茎段切
段置于试管薯诱导培养基 ＭＳ＋ＣＣＣ　２００ｍｇ／Ｌ＋
２．０ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋白糖８％＋琼脂粉０．８％。转基
因植株试管薯诱导过程中，进行相应的抗性筛选。
培养条件ｐＨ值５．８，光照１　５００ｌｘ，培养温度２５℃
培养，４０ｄ后收获。
１．２．３转化子的筛选　ＰＣＲ检测：根据表达载体启
动子和插入的目的片段设计检测引物，即选取启动
子的一段序列和目的片段的一段序列来设计引物。
对于ｐＣＡＳＢＥⅡｂ载体启动子为ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３自
身携带的３５Ｓ启动子。引物序列为：５′－ＣＣＡＡＡ－
ＧＡＴＧＧＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧ－３′ （Ｆｏｗｗａｒｄ），
５′－ＣＣＣＡＡＧＴＴＧＡＡＧＴＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＡＴ－３′
（Ｒｅｖｅｓｅ）。引物序列由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成。ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，ＰＣＲ程
序：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性４０ｓ；６０℃退火４０
ｓ；７２℃延伸２ｍｉｎ，３５个循环，７２℃延伸７ｍｉｎ。
ＧＵＳ检测：采用ＧＵＳ活性组织化学染色法，参照植
物基因工程与技术的方法。把共培养后的愈伤组
织、抗性植株的叶片及茎段，放入Ｘ－Ｇｌｕｃ底物缓冲
液中，３７℃温浴过夜，７５％乙醇脱色１次；无水乙醇
脱色２～３次，每次２０ｍｉｎ，解剖镜下观察，阳性反
应材料出现蓝色斑点。
２　结果与分析
２．１农杆菌介导马铃薯转化体系的建立和优化
本试验采用农杆菌介导法，筛选出马铃薯遗传
转化的最佳组织培养方法。茎段愈伤诱导培养基
为：ＭＳ＋０．１ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ＋２．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ，芽诱导
培养基：ＭＳ＋５ｍｇ／ＬＧＡ３＋２．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ。通过
外植体 Ｈｙ敏感性试验，确定了筛选马铃薯茎段的
Ｈｙ适宜使用浓度，即 Ｈｙ浓度为４．０ｍｇ／Ｌ为临近
值。此外，对转化过程中预培养时间、共培养时间、
农杆菌侵染时间和侵染浓度进行优化，结果发现外
植体预培养３ｄ、共培养２ｄ最佳。在侵染过程中，
农杆菌的浓度（ＯＤ６００）为０．５～０．８，感染时间为１０
ｍｉｎ，愈伤组织长势最强，转化效率最佳。在抗性筛
选过程中，加入Ｃｅｆ（２００ｍｇ／Ｌ），能有效抑制培养过
程中的污染问题。农杆菌介导马铃薯遗传转化过程
实验流程如图２所示。
２．２抗性试管薯的诱导
选取壮苗后２０ｄ左右的抗性植株为材料，将单
节茎段或带有３～５个腋芽的多节茎段切段置于试
管薯诱导培养基。４０ｄ后可观察到抗性植株腋芽
处诱导出微型试管薯，６０ｄ后抗性试管薯的平均直
径达３．６ｍｍ，平均重量达２４６ｍｇ，薯表皮略显紫
色。抗性试管薯的诱导过程如图３。
２．３抗性植株的ＰＣＲ检测
本试验采用农杆菌介导法对大西洋茎段外植体
进行ＳＢＥⅡｂ基因的转化，接种了７６２个茎段，共获
得３５株抗性再生植株。取抗性植株幼嫩叶片和幼
９２２２期　　　　范亚丽等：马铃薯遗传转化体系的优化及玉米淀粉分支酶基因ＳＢＥⅡｂ的导入
嫩茎段提取总ＤＮＡ，以其为模板，用ＳＢＥⅡｂ基因
的特异引物进行ＰＣＲ检测，阴性对照为未转化的同
一品种植株ＤＮＡ，以质粒作阳性对照，检测出４株
阳性转基因植株（图４）。
２．４转化马铃薯的ＧＵＳ检测
取抗性植株的ＰＣＲ检测中成阳性的植株和未
经转化的植株，进行 ＧＵＳ活性组织化学染色。染
色结果如图５所示，对照未经转化的试管苗的茎段，
阳性植株茎段被染上蓝色。叶片中的纤维束部分也
被染上蓝色，而叶肉部分没有被染上蓝色。对阳性
植株在抗性诱导培养基上诱导的试管薯切薄片进行
ＧＵＳ染色，其中Ａ、Ｂ、Ｃ是３个抗性试管薯的被切
薄片，对照未经转化收获的试管薯，Ａ、Ｂ、Ｃ薄片均
被染上蓝色。结果表明，ＧＵＳ基因在转基因植株组
织中正常表达。
３　结论与讨论
建立良好的受体系统是实现基因转化的先决条
件，关系到基因转化的成败。受体系统的建立主要
依赖于植物组织培养技术。与一般的植物组织培养
相比，受体系统的要求更高、复杂。首先要建立一个
高频再生系统，包括外植体的选择、最佳培养基的确
立、外植体抗生素敏感测定等。本试验对马铃薯试
管苗茎段进行了再生能力的研究，发现马铃薯试管
苗茎段具有生长状况确定、愈伤充分接触培养基（压
入培养基表层）、诱导率高、分化能力强的突出特点，
因此认为是马铃薯基因转化的良好受体材料。进而
以马铃薯茎段为材料，研究了影响农杆菌介导的马
铃薯遗传转化的各种因素。通过对受体材料的潮霉
素（Ｈｙ）敏感性鉴定，确定了针对茎段的合适的筛选
剂量为４．０ｍｇ·Ｌ－１。在整个的筛选转化体系中，
前期使用较低浓度的抗生素，后期再用较高浓度的
抗生素筛选，且在高浓度选择的时间达到８周，可淘
汰大量的非转化体而得到较多的转化植株。此外，
在农杆菌侵染前必须让外植体进行一段时间的预培
养，茎段如果预培养３ｄ，抗性愈伤率达到８１．０８％。
对于茎段来说，共培养２ｄ处理后的愈伤组织诱导
率最高，共培养４ｄ后，农杆菌过度生长而引起了毒
害，从而影响了转化的效率。
利用上述方法，经过ＰＣＲ筛选和ＧＵＳ检测，我
们得到了马铃薯阳性ＳＢＥⅡｂ转基因植株。在支链
淀粉合成过程中，ＳＢＥⅡｂ发挥着重要作用，尤其对
Ａ链淀粉的合成（Ｊｅｏｎ等，２０１０）。抑制ＳＢＥⅡｂ的
表达，能显著降低水稻和小麦籽粒中支链淀粉含量，
提高直链淀粉比例（Ｎｉｓｈｉ等，２００１；Ｒｅｇｉｎａ等，
２００５）。而提高ＳＢＥⅡｂ的表达，能显著提高水稻支
链淀粉中短链ＤＰ　６－１１的比例（Ｔａｎａｋａ等，２００４）。
因此，下一步的实验是测定转基因马铃薯块茎中淀
粉的理化特性，从而检测转玉米ＳＢＥⅡｂ基因对马
铃薯淀粉特性的影响。
参考文献：
王关林，方宏筠．２００２．植物基因工程［Ｍ］．北京：科学出版社：７３８
Ｂｕｒｔｏｎ　ＲＡ，Ｍａｒｔｉｎ　Ｃ．１９９５．Ｓｔａｒｃｈ　ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ
ｔｏ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ｆａｍｉｌｉｅｓ　ａｒｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｐｅａ
ｅｍｂｒｙｏ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ，７：３－１５
Ｆａｎ　ＹＬ（范亚丽），Ｒｕａｎ　Ｙ（阮颖），Ｌｉ　Ｊ（李进），ｅｔ　ａｌ．２００８．Ｃｌｏ－
ｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｉｚｅ　ｓｔａｒｃｈ　ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ＳＢＥⅡｂｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｃｏｎ－
ｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ（玉米淀粉分支酶基因
ＳＢＥⅡｂ的克隆与过表达载体的构建）［Ｊ］．Ｃｈｉｎ　Ａｇｒｉｃ　Ｓｃｉ　Ｂｕｌｌ
（中国农学通报），２４（４）：７２－７５
Ｈａｎｎａｈ　ＬＣ，Ｊａｍｅｓ　Ｊ．２００８．Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｓｔａｒｃｈ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅ－
ｓｉｓ　ｉｎ　ｃｅｒｅａｌ　ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ［Ｊ］．Ｃｕｕｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９：１６０－１６５
Ｊｅｏｎ　Ｊ，Ｒｙｏｏ　Ｎ，Ｈａｈｎ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．２０１０．Ｓｔａｒｃｈ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｃｅｒｅａｌ
ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，４８：３８３－３９２
Ｎｉｓｈｉ　Ａ，Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｙ，Ｔａｎａｋａ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．２００１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｇｅ－
ｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｍｙｌｏｓｅ－ｅｘｔｅｎｄｅｒ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒｉｃｅ
ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，１２７：４５９－４７２
Ｒｅｇｉｎａ　Ａ，Ｋｏｓａｒ－Ｈａｓｈｅｍｉ　Ｂ，Ｌｉ　Ｚ，ｅｔ　ａｌ．２００５．Ｓｔａｒｃｈ　ｂｒａｎｃｈｉｎｇ
ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｉｂ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ　ｉｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ａｔ　ｌｏｗ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｐｅｒｍ
ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｏｔｈｅｒ　ｃｅｒｅａｌｓ　ａｎｄ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ａｔ　ｎｏｎ－ｓｙｎｔｈｅｎｉｃ　ｌｏｃｕｓ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ，２２２：８９９－９０９
Ｓｍｉｔｈ　ＡＭ，Ｄｅｎｙｅｒ　Ｋ，Ｍａｒｔｉｎ　Ｃ．１９９７．Ｔｈｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔａｒｃｈ
ｇｒａｎｕｌｅ［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，４８：６７－８７
Ｔａｎａｋａ　Ｎ，Ｆｕｊｉｔａ　Ｎ，Ｎｉｓｈｉ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．２００４．Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｓｔａｒｃｈ
ｃａｎ　ｂｅ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｃｈａｎｇｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｓｔａｒｃｈ
ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ＩＩｂ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ｅｎｄｏｐｅｒｍ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｊ，
２：５０７－５１６
Ｗａｎｇ　Ｑ（王琴），Ｆｅｎｇ　ＹＺ（冯颖竹），Ｗｅｎ　ＱＢ（温其标），ｅｔ　ａｌ．
２００６．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗａｘｙ　ｍａｉｚｅ　ｓｔａｒｃｈ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｓｔａｒｃｈ
ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｇｈｔ　ｉｎｄｕｓｔｒｙ（糯玉米淀粉的改性及其在轻工业中的应
用）［Ｊ］．Ｊ　Ｍａｉｚｅ　Ｓｃｉ（玉米科学），１４（２）：１７０－１７４
Ｙａｏ　ＸＬ（姚新灵），Ｄｉｎｇ　ＸＺ（丁向真），Ｃｈｅｎ　ＹＹ（陈彦云），ｅｔ　ａｌ．
２００５．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｓｔａｒｃｈ　ｂｒａｎｃｈ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　ｄｅ－
ｂｒａｎｃｈ　ｅｎｚｙｍｅ（淀粉分支酶和去分支酶编码基因的功能）［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｃｏｍｍｕｎ（植物生理学通讯），４１（２）：２５３－２５９
０３２ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３２卷