全 文 ：　山 东 农 业 科 学　2008, 2:21 ～ 24 ShandongAgriculturalSciences
收稿日期:2007-08-03;修回日期:2007-11-28
基金项目:山东省农业科学院青年基金(2005YQ003);山东省自然科学基金(Q2006D11);山东省农业科学院高新技术自主创新基金
(2006YCX014, 2006YCX040);山东省良种产业化工程资助。
作者简介:董艳敏(1982-),女 ,硕士研究生 ,从事植物蛋白质结构与分子标记研究。 ＊为通讯作者
分子标记技术在葫芦科瓜类作物中的应用进展
董艳敏1 ,卢金东 2 ,刘栓桃2＊
(1.首都师范大学生命科学学院 ,北京　100037;
2.山东省农业科学院蔬菜研究所 /国家蔬菜改良中心山东分中心 ,山东 济南 , 250100)
　　摘　要:简述了分子标记技术即 RFLP、RAPD、SSR、AFLP在葫芦科瓜类作物遗传图谱构建 、性状连锁标
记分析和分子辅助选择 、品种及杂交种纯度的鉴定与品种 DNA指纹图谱 、种质资源与遗传进化分析等领域的
应用 , 着重论述了分子标记技术在黄瓜 、甜瓜和西瓜方面研究的进展情况 ,并探讨了其应用前景和存在的问
题。
关键词:葫芦科作物;黄瓜;西瓜;甜瓜;分子标记
中图分类号:Q755　　文献标识号:A　　文章编号:1001-4942(2008)02-0021-04
1　分子遗传图谱的构建
分子遗传图谱是指以遗传标记间重组频率为
基础的 1条染色体或基因内位点的相对位置的线
性排列图[ 1] 。分子遗传图谱的构建是基因组研
究中的重要环节 ,是基因定位与克隆乃至基因组
结构与功能研究的基础。
葫芦科瓜类作物在我国蔬果生产中占有重要
地位 ,构建其遗传图谱以提高其育种水平具有重
大意义 。黄瓜多态性仅为 3% ～ 9%[ 2] ,因此遗传
图谱的构建进展比较缓慢。 Kennard等(1994)[ 2]
利用 G421 ×H-19得到的 F2代为材料构建了世
界上第一张黄瓜遗传图谱 ,该图谱全长 766 cM,
标记了 58个位点 , 10个连锁群 ,包含 31个 RFLP
(RestrictionFragmentLengthPolymorphisms)标记 ,
20个 RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)
标记 , 5个同功酶标记 ,形态学标记和抗病标记各
1个 ,两位点的平均距离为(21 ±8)cM,最大距离
为 32 cM。Serquen等(1997)[ 3]选取了与 Kennard
相同的材料利用 RAPD技术作了进一步研究 ,得
到了一个 80个位点的连锁图谱。后来 Staub等
(2000)[ 4]和 Bradeen等 (2001)[ 5] 等先后对既得
的遗传图谱进行整合 ,分别得到包含 255个标记 、
10个连锁群 、全长 538.6 cM和 197个标记 、15个
连锁群 、全长 450.1 cM的两张遗传图谱 ,平均距
离相同 ,均为 2.3 cM。图谱整合后依然仅覆盖基
因组长度的 45% ～ 60%,因此离饱和图谱的标准
还有很大差距。随着重组自交系的获得 , Park等
(2000)[ 6] 得到了包含 RAPD、RFLP、AFLP(Am-
plifiedFragmentLengthPolymorphisms)标记的 353
个位点 、 12 个连锁群的连锁图谱 , Fazio等
(2003)[ 7]构建了长 706 cM, 138个位点 ,连锁群
数与黄瓜染色体数目相同 ,为继续进行基因定位
打下了良好的基础。西瓜也具有较窄的遗传背
景 , 因此多态性也很有限 [ 8 ～ 10] 。 Hashizume等
(1996)[ 11]建立了第一张遗传图谱 ,仅包括 58个
RAPD标记 ,一个 RFLP标记 ,分为 11个连锁群 ,
全长 524 cM;2003年将此图谱完善为全长 2 384
cM,涵盖了 560个标记位点[ 12] 。后来 , Hawkins
和 Levi分别利用非永久群体构建两张更为完善
的图谱;张仁兵等(2003)[ 13]构建了世界上第一张
以重组自交系为群体的西瓜永久分子遗传图谱。
甜瓜相对于黄瓜和西瓜具有较高的遗传多样性。
Baudracco-Arnas等(1996)[ 14]构建了最初的包
含 98个分子标记 、长 1 390 cM的甜瓜遗传连锁
图谱。王永飞等(1997)[ 15] 利用回交群体 , 采用
AFLP和 RAPD等 204 个标记构建了长度为
1 942 cM的遗传图谱 ,标记间平均距离为 10.2
cM,最大间隔 27.5 cM。 Brotman(2000)[ 16] 以抗
病基因类似物(RGA)为 RFLP探针用于图谱的构
建 , Perin等(2002)[ 17]利用两个重组自交系群体
(RIL)进行了有效的图谱整合 ,但是跟其它图谱
DOI :10.14083/j.issn.1001-4942.2008.02.032
一样还不够饱和 。
虽然目前葫芦科瓜类作物的遗传图谱数目不
少 ,但图谱密度低 ,不能满足育种学家的需要。很
有必要对现有的图谱进行整合和加密 ,应该发展
利用 AFLP、SCAR(SequenceCharacterizedAmpli-
fiedRegions)、 STS(SequenceTaggedSite)、 SNP
(SingleNucleotidePolymorphism)等新型标记共同
构建图谱 ,特别是 SSR、SCAR等共显性标记 ,这
对于不同图谱的整合以及比较遗传学研究显得尤
为重要 。
2　性状连锁标记分析和分子标记辅助选
择
　　利用分子标记不仅可定位目标基因 , 也可利
用与目标基因紧密连锁的分子标记追踪目标基
因 , 进而进行分子标记辅助选择 。此技术因其快
速 、准确 、不受外界影响的特点 , 受到了人们的青
睐 。目前标记目标性状基因的方法主要有 2种:
利用近等基因系或分离群体分组分析法(Bulked
SegregantAnalysis, BSA), BSA是将 F2分离群体
中研究的目标性状 , 根据其表型(如抗病和感病)
分成 2组 , ,将每组内一定数量植株的 DNA混合 ,
形成按表型区分的 DNA池 , 也称近等基因池
(isogenicDNApools),作为模板进行分子标记分
析 。许勇等 (2000)[ 19] 运用 RAPD技术 , 采用
BSA法进行西瓜野生种质 PI296341抗枯萎病基
因连锁的分子标记研究 ,找到了 1个与西瓜野生
种 PI296341抗枯萎病生理小种 1的抗性的标记 ,
该性状由单显性基因控制 , RAPD标记 OPPOL/
700与其抗病基因连锁 , 其遗传距离为 30 cM,并
将此标记转化为 SCAR标记 , 简化了 SCAR扩增
产物的检测技术 。上述技术在抗病转育后代选择
中得到了很好的应用 , 初步建立了西瓜抗枯萎病
育种分子标记辅助选择技术系统 [ 20] 。张桂华等
(2004)[ 21] 采用 BSA法找到了黄瓜抗白粉病
AFLP引物组合 P18M47共显性标记 , 连锁距离
为 5.56 cM。谢震(2001)[ 22]筛选与雌雄同株型
(A)连锁的分子标记 ,探索了利用分子标记进行
甜瓜雌雄同株型自交系辅助选择的可行性 ,为利
用分子标记技术辅助甜瓜育种 ,加快育种进程 ,
开辟了新的技术途径 。
另外一种是利用已有的连锁图进行标记 ,当
发现某一目标基因被定位在某一染色体上 ,就可
以选择分散在染色体不同位点的标记 ,逐渐逼近 ,
找到该基因的分子标记 [ 23] 。张海英等(1998)[ 24]
利用 RAPD技术获得了欧洲温室类型黄瓜材料的
特征谱带 , 以此建立分子标记辅助选择系统 ,从
而对杂交 后代 进行 定向 选择 。 Wechter等
(1995)[ 25]在甜瓜抗病材料 MR21上获得了与抗
枯萎病生理小种 1连锁的 RAPD标记 , 并成功地
将其转化为 SCAR标记 。许勇等(1998)[ 26]获得
了与西瓜耐冷材料 PI482322耐冷基因连锁标记
OPG12 /1950 ,其遗传距离为 6 198 cM。 Thomas
等(2000)[ 27] 应用 960个 RAPD引物 , 筛选出 5
个引物与抗黄瓜霜霉病基因(dm)连锁 , 连锁距
离分别是 16.5, 32.8, 9.9, 19.2, 32.9 cM。
DNA分子标记技术是建立在分子生物学基
础上的 ,它使对抗病基因和遗传变异等目标性状
的研究从传统的形态学性状分析跨入到以核苷酸
多态性为基础的分子水平分析 ,从而在选择的手
段上实现了从表现型选择到基因型选择的质的飞
跃 。尽管十多年来分子育种的理论研究已取得了
很大的进展 ,但在植物抗病育种中的应用还处于
逐步探索阶段 。原因主要有:首先基因定位研究
与育种程序相脱节 ,绝大多数研究者只把鉴定和
定位重要的基因作为工作目标;分子标记技术在
实用性和成本方面还有待于进一步改进;对于质
量性状的基因定位在技术上是成熟的 ,但是个耗
资费力的过程[ 28] 。
3　品种及杂交种纯度的鉴定与品种 DNA
指纹图谱
　　我国大面积栽培的葫芦科瓜类作物大部分使
用了杂交种 ,如黄瓜有 75% ～ 80%的栽培面积使
用了杂交种 。为充分发挥杂交种的优势 , 最根本
的是要保持一代杂种的纯度。采用传统的田间形
态特征检测种子纯度 , 费时费工 , 且对很多品种
之间植物形态非常接近的种类很难鉴别。分子标
记技术可以在苗期快速且准确地鉴定蔬菜品种
(系)及杂种纯度。
分子标记技术也被广泛地应用在作物品种鉴
定中。近年来一些科研机构也开始将分子标记技
术应用在西瓜品种纯度鉴定的研究上 , 并取得了
突破。欧阳新星等(1999)[ 29]应用 RAPD技术已
成功地找到 1个引物 , 可以有效分开无籽京欣 1
号的亲本与杂种一代。车克鹏等(2003)[ 30]利用
高效可靠的 AFLP技术对约 30个西瓜材料进行
研究并建立了 DNA指纹图谱 ,利用图谱可以有效
22 山 东 农 业 科 学　　　　　　　　　　　　　　2008年　
地区分不同西瓜材料。日本的 Hashizume等 [ 31]
用 RAPD技术鉴定了西瓜杂交种 Fijihikari的纯
度 。许亮(1998)[ 32] 对甜瓜杂交种纯度进行了
RAPD检测。孙敏(2003)[ 33]鉴定和分析了黄瓜
品种真实性 , 并建立了应用于鉴定亲本及其杂交
种子的 RAPD指纹图谱 。白艳玲 (2003)[ 34]研究
表明 , 黄瓜线粒体存在母系遗传 , 在此之前尚未
有黄瓜线粒体母系遗传的报道 , 这一发现为黄瓜
遗传学研究提供了重要信息 。杂交实验还显示 ,
不同品种黄瓜线粒体主环 DNA与类质粒的同源
性及类质粒拷贝数存在多态性 , 这为以类质粒为
分子标记鉴定黄瓜种质资源提供了新的依据。
SSR应用于品种鉴定与纯度检测的基础是由
于核心序列的重复次数在同一物种的不同基因型
间差异较大 ,造成微卫星座位更多的复等位性。
SSR标记对杂交甜瓜 、黄瓜等西葫芦科作物及其
亲本材料具有很好的区分效果 , 尽管有些供试材
料有相似的遗传背景 ,但 SSR标记仍然可检测到
高水平的多态性 , SSR标记在检测等位基因方面
显示出可重复性 、精确性和有效性的特点 。并且 ,
随着品种鉴定和保护意识的增强 , 筛选甜瓜 SSR
核心引物 , 建立甜瓜重要种质的 SSR指纹 , 可以
进一步解决杂交种子的真实性问题。
AFLP即扩增片段长度多态性 ,该标记多态
性高 ,假阳性低 ,具有 RFLP和 PCR的高效性的优
点 ,非常适合品种指纹图谱的绘制与品种的检
测 [ 35] 。
4　种质资源与遗传进化分析
分子标记显示的是基因组 DNA水平上的差
异 ,不受外界环境的影响 ,稳定且客观 ,是分析种
质亲缘关系和检测种质资源多样性的有效工具。
通过分子标记明确亲本之间的遗传差异和亲缘关
系 ,并确定其遗传距离 ,可以充分发挥杂种优势的
潜力。日本的 Hashizume(1993)[ 31]用 RAPD技术
研究发现日本的一个杂交种的两个亲本间能产生
多态性的引物仅为 3%。韩国的 LeeSJ等人
(1996)[ 36]对 39份西瓜材料进行 RAPD检测与聚
类分析 , 其平均遗传距离的变动范围为 0 ～
0.366。Jaret等(1997)[ 37]利用能产生多态性更
高的 SSR技术 ,对西瓜种质的亲缘关系进行了研
究 ,证明栽培品种间也有较大的差异 。张海英等
(1998)[ 24]用 20个 10碱基引物对多个生态型黄
瓜材料的遗传亲缘关系进行了研究 , 验证了传统
的黄瓜地域分类标准并得出黄瓜是遗传基础狭窄
的蔬菜作物的结论 。陈劲枫等 (2003)[ 38] 采用
SSR和 RAPD两种分子标记对黄瓜属 22份不同
类型材料的亲缘关系进行了研究 。结果表明 ,野
黄瓜(Cucumishystrix)与黄瓜(CucumissativusL.
var.sativus, 2n=14)间的遗传距离 (SSR:0.59,
RAPD:0.57)小于其与甜瓜(Cucumismelovar.me-
lo, 2n=24)间的距离(SSR:0.87 , RAPD:0.70)。
Zhuang等(2004)[ 39]用 RAPD和 SSR分析黄瓜野
生种 、半野生种的亲缘关系 , 二者的遗传分析结
果具有很高的协调性 , 二者遗传距离的相关系数
为 0.94。
我国葫芦科瓜类作物种质资源丰富 , 但长期
的定向遗传改良使目前生产上推广应用的品种遗
传基础日益狭窄 。应用分子标记技术对目前推广
的主要杂交种的亲本及将来有利用价值的优良亲
本的亲缘关系进行分析 , 可为现阶段育种中减少
杂交组合数目 、有效划分杂交优势群 、提高品种质
量及育种效率提供有力依据。
5　存在问题与展望
在我国 , 西瓜 、甜瓜 、黄瓜等葫芦科作物的分
子标记研究相对较少 , 目前的研究中分子标记主
要应用于种质亲缘关系的鉴定和分析上。瓜类遗
传图谱的构建以及基因的标记 、定位和克隆工作
刚起步 。DNA分子标记的迅速发展将大大地节
约瓜类作物的育种成本 ,推动其进程 ,为我国瓜类
作物分子育种提供有效的方法和手段。分子标记
及其遗传连锁图在理论上或实践中都具有重要价
值 。因而今后的主要工作有 3项:一是填补连锁
图上较大间隙 , 使其更加 “饱和”;二是寻求一些
育种家们易接受的且经济实用的新性状标记 , 为
育种家们提供杂交育种和品种鉴别的依据;三是
将 RFLP和 RAPD等标记转化为育种上易利用的
PCR标记(SSR和 SCAR等)。
虽然 DNA分子标记技术在西瓜杂交种子纯
度鉴定上应用多态性丰富 、准确性高 、重复性好 、
无器官发育时期的特异性 , 鉴定速度快且不受环
境条件影响 , 但与传统的的形态鉴别方法相比 ,
DNA分子标记技术所需仪器精密 , 药品昂贵 , 程
序复杂 , 离普及和应用尚有距离。
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