全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ｊｕｎ. ２０１６ꎬ ３６(６):７４１－７４６
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１３０６０１７
王维ꎬ黄亚亚ꎬ王娜ꎬ等. 早熟禾细胞膜脂肪酸衍生化方法比较[Ｊ]. 广西植物ꎬ２０１６ꎬ３６(６):７４１－７４６
ＷＡＮＧ ＷꎬＨＵＡＮＧ ＹＹꎬＷＡＮＧ Ｎꎬｅｔ ａｌ. Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ
ｂｌｕｅｇｒａｓｓ (Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ)[Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ２０１６ꎬ３６(６):７４１－７４６
早熟禾细胞膜脂肪酸衍生化方法比较
王　 维ꎬ 黄亚亚ꎬ 王　 娜ꎬ 崔浪军∗
( 陕西师范大学 生命科学学院 药用资源与天然药物化学教育部重点实验室ꎬ 西安 ７１００６２ )
摘　 要: 脂肪酸是生物膜的重要组成部分ꎬ由于植物细胞不同生物膜特性也不同ꎬ同一种酯化方法对不同生
物膜脂肪酸酯化后测定分析的结果很难获得满意效果ꎮ 为了寻找一种比较简单、可靠的衍生化方法ꎬ该研究
以早熟禾叶片为材料ꎬ采用三种衍生化方法分别对其叶绿体、线粒体、液泡及细胞质膜这 ４ 种膜脂肪酸衍生
化ꎬ随后进行 ＧＣ定量测定分析ꎮ 结果表明:相对于 ＢＦ３ ￣甲醇和 ＨＣｌ￣甲醇两种酯化法对部分膜脂肪酸衍生化
程度较低ꎬ氯乙酰酯化法对这 ４种膜脂肪酸的衍生化效率高、程度完全ꎬＧＣ测定结果重复性好、准确率高ꎮ 该
研究结果为其他相关植物细胞的不同膜脂肪酸测定分析提供了一定的理论借鉴ꎮ
关键词: 细胞膜ꎬ 脂肪酸ꎬ 气相色谱法ꎬ 氯乙酰
中图分类号: Ｑ９４６　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０６￣０７４１￣０６
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ
ｆｏｒ ｂｌｕｅｇｒａｓｓ (Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ)
ＷＡＮＧ Ｗｅｉꎬ ＨＵＡＮＧ Ｙａ￣Ｙａꎬ ＷＡＮＧ Ｎａꎬ ＣＵＩ Ｌａｎｇ￣Ｊｕｎ∗
( Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎꎬ
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｓｈａａｎｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｘｉ’ａｎ ７１００６２ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｂｉｏ￣ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｍａｋｅｓ ｉｔ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｕｓｅ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔｓꎬｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ
ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄꎬｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙꎬｗｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓꎬｃｈｌｏ￣
ｒｏｐｌａｓｔｓꎬｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａꎬｖａｃｕｏｌｅｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅｉｒ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄꎬｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｄｅ￣
ｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ (ＧＣ) ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｂｏｔｈ ＢＦ３￣ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ
ＨＣｌ￣ｍｅｔｈａｎｏｌ ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｓｔｅｒｉｆｙ ｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ. Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ
ｔｈｅ ｔｗｏ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓꎬａｃｅｔｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｔｒａｎｓ￣ｅｓｔｅｒｉｆｙ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ. Ｏｕｒ ｄａｔａ ｏｎ ｆａｔｔｙ
ａｃｉｄｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ＧＣ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｄ ａ ｈｉｇｈ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ. Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ
ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｖａｌｕａｂｌｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅꎬ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄꎬ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬ ａｃｅｔｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ
收稿日期: ２０１４￣０８￣１０　 　 修回日期: ２０１４￣１１￣２６
基金项目: 国家科技部科技惠民计划项目(２０１２ＧＳ６１０１０２)[Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｎｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｔｏ Ｐｅｏｐｌｅ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒａｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(２０１２ＧＳ６１０１０２)]ꎮ
作者简介: 王维(１９８９￣)ꎬ女ꎬ陕西兴平人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物生物化学和化学生物学研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗａｎｇｗｅｉ８９８２５＠ １６３.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 崔浪军ꎬ硕士生导师ꎬ从事天然产物的研究与开发ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ) ｌｊｃｕｉ＠ ｓｎｎｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
　 　 脂肪酸是植物膜系统的重要组成部分ꎬ各脂肪
酸的含量及其之间的比例决定着膜的流动性ꎬ而膜
的流动性与植物的物质运输、信息传递、能量转换和
代谢调节等生理功能密切相关(Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌꎬ２００５)ꎮ
植物膜系统包括叶绿体膜、线粒体膜、细胞质膜和液
泡膜等ꎮ 膜系统中不同的生物膜其生理学功能与脂
肪酸的组成及结构有很大的关系(Ｓｈａｉｋｈ ＆ Ｅｄｉｄｉｎꎬ
２００８)ꎮ 细胞膜是植物逆境伤害的首要发生地ꎬ而
细胞膜的稳定性又主要决定于膜脂肪酸不饱和性ꎬ
不饱和性越高ꎬ膜稳定性越高ꎬ植物抗逆性就越强
(赵金梅等ꎬ２００９)ꎮ 因此研究植物细胞膜的脂肪酸
组分与比例已成为当前抗逆生理学的热点问题
(Ｑｕａｒｔａｃｃｉꎬ２００１ꎻＪｉａｎｇ ＆ Ｇａｏꎬ２００４)ꎮ
目前ꎬ测定膜脂肪酸组成和含量的方法很多ꎬ但
总体上主要步骤为有机溶剂对脂类抽提、脂肪酸衍
生化与气相色谱的定量测定(陈炳超ꎬ２０１２)ꎮ 衍生
化是将脂肪酸转变成为挥发性物质ꎬ即脂肪酸的酯
化ꎬ其中甲酯化是目前采用较多的衍生化方法ꎮ 甲
酯化可分为三大类:由盐酸、硫酸或三氟化硼等的酸
催化和由甲氧基钠等的碱催化或由二者结合共同来
完成的甲酯化方法(Ｒｏｄｒíｇｕｅｚ￣Ｐａｌｍｅｒｏꎬ１９９７)ꎮ 由
于不同生物膜的脂肪酸组成特性不同ꎬ研究植物不
同细胞膜系统脂肪酸的含量及其之间的比例时ꎬ不
同生物膜的脂肪酸酯化采用同一种酯化方法难以得
到满意效果ꎬ但如果采用不同的酯化方法ꎬ则费时费
力ꎮ 近年来ꎬ甲酯化法衍生脂肪酸在测定脂肪酸含
量中的应用已有不少报道ꎮ 已有的研究表明对于不
同植物的膜系统脂肪酸、甚至对于同种植物的不同
膜系统脂肪酸的衍生化采取的方法也不尽相同ꎮ 蔺
冬梅等(２００１)在测定豌豆叶绿体膜脂肪酸时先用
ＫＯＨ￣甲醇溶液对其皂化后ꎬ再使用 ＨＣｌ￣甲醇甲酯化
(Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌꎬ２００９ )ꎮ 刁丰秋(１９９７)对大麦叶片类
囊体膜脂肪酸测定时采用乙酸￣甲醇甲酯化ꎮ 杨秀
梅等(２００８)测定番茄类囊体膜脂肪酸时用 ＫＯＨ￣甲
醇溶液碱催化甲脂化ꎮ 而 Ｒａｍａｌｈｏ ｅｔ ａｌ(１９９８)对咖
啡类囊体膜、叶绿体膜脂肪酸衍生化时ꎬ先使用
ＫＯＨ￣甲醇溶液皂化ꎬ再用 ＢＦ３￣甲醇完成甲酯化ꎮ
Ｒｏｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ ( ２００３)对海洋硅藻脂肪酸和陈鹏等
(２００７)用盐酸酸催化后再加入 ＨＣｌ￣甲醇溶液完成
脂肪酸甲酯化ꎮ 张敏等(２００９)在研究构树根与叶
片内质网膜脂肪酸组成时采用 ＢＦ３￣乙醚￣甲醇溶液
酯化ꎮ 因此ꎬ若能筛选出一种对植物不同细胞膜系
统的脂肪酸衍生化效果均好的方法ꎬ其意义重大ꎮ
草地早熟禾(Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ)是禾本科早熟禾属
植物ꎬ广泛分布于世界各地ꎬ是园林绿化、运动场及
牧场的主要草种ꎬ因而受到高度关注(方强恩等ꎬ
２０１１)ꎮ 本研究以早熟禾为材料ꎬ在提取获得其叶
片的叶绿体膜、线粒体膜、细胞质膜以及液泡膜脂肪
酸的基础上ꎬ分别用三种酯化方法对膜脂肪酸酯化ꎬ
再利用气相色谱法进行比较分析ꎬ旨在选择出一种
同时适用于这四种膜脂肪酸酯化的方法ꎬ从而为相
关植物的细胞膜脂肪酸测定提供借鉴ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 材料
１.１.１ 实验材料　 选择健康的早熟禾(Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ)
种子播种在装有混合培养基质(蛭石 ∶ 营养土ꎬ１ ∶
１)的花盆中ꎮ 日常管理培养 ２０ ｄ后采集叶片ꎮ
１.１.２ 试剂　 甲醇、异丙醇、氯仿、盐酸、氢氧化钾、正
己烷、三氟化硼等均为天津市科密欧化学试剂公司ꎻ
氯乙酰 ∶ 分析纯ꎻ７ 种脂肪酸(１６ ∶ ０、１６ ∶ １、１７ ∶ ０、
１８ ∶ ０、１８ ∶ １、１８ ∶ ２、１８ ∶ ３)购买于 Ｎｕ￣Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ (Ｅ￣
ｌｙｓｉａｎꎬＭＮ)ꎮ １７ ∶ ０脂肪酸用作内标物ꎮ
１.１.３ 仪器和设备　 超声波细胞破碎仪(Ｂｉｏｓａｆｅｒ ４Ｄ)、
离心机(ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ)、气相色谱仪(ＧＣ￣ｓｙｓｔｅｍꎬ
ＨＰ￣６８９０):美国 Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎻＡＢ１３５￣Ｓ 型精密电子分
析天平:瑞士梅特勒￣托利多公司ꎻＭｉｌｉ￣Ｑ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 超
纯水系统:美国 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 膜的提取　 叶片叶绿体和线粒体膜的提取参
照张娟(２００９)的方法ꎮ 叶片细胞质膜与液泡膜的
提取与纯化分别参照 Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ(２００５)和 Ｑｕａｒｔａｃｃｉ
ｅｔ ａｌ(２００１)的方法ꎮ 获得的膜悬浮液置于－８０ ℃保
存待用ꎮ
１.２.２ 膜脂肪酸的提取与测定　 取相同量的膜悬浮
液(平均约 ２ ｍＬ)ꎬ先加入 ４ ｍＬ沸腾异丙醇ꎬ后加入
１２ ｍＬ氯仿 ∶ 甲醇 ∶ 水 ＝ １ ∶ １ ∶ １(ｖ / ｖ / ｖ)ꎬ摇匀超
声波破碎ꎬ４ ５００ ×ｇ离心 １０ ｍｉｎꎬＮ２吹干下层的氯仿
层获得脂肪酸ꎮ 取少量提取纯化后的膜脂ꎬ加入已
知量的内标(１７ ∶ ０)ꎬ分别用以下三种方法酯化ꎮ
方法一:参照 Ｒａｍａｌｈｏ ｅｔ ａｌ(１９９８)的方法ꎮ 取
少量提取的膜脂ꎬ先加入 ３ ｍＬ ０.５ ｍｏｌ / Ｌ ＫＯＨ￣甲醇
溶液 ６５ ℃水浴 ３０ ｍｉｎꎬ进行皂化反应ꎬ再用 ２ ｍＬ
ＢＦ３￣甲醇(体积比为 １ ∶ ４)６５ ℃酯化 ３０ ｍｉｎꎬ完成脂
肪酸甲脂化ꎮ
２４７ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
方法二:参照 Ｒｏｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ(２００３)的方法ꎮ 称取
少量提取的膜脂肪酸ꎬ采用盐酸酸催化后ꎬ加入 ２
ｍＬ ２.５％(ｗ / ｗ)ＨＣｌ￣甲醇溶液ꎬ８０ ℃水浴 ２ ｈꎬ脂肪
酸甲脂化完成ꎮ
方法三:参照 Ｍａｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ(２００５)对动物血红细
胞膜脂肪酸测定方法ꎮ 考虑到植物细胞膜系统与血
红细胞质膜之间组成上的差异ꎬ本研究首先提取获
得早熟禾细胞膜系统脂肪酸ꎬ再对上述衍生化方法
进行简单优化ꎮ 用预先制备的酯化反应储备液(１.８
ｍＬ甲醇ꎬ１００ μＬ内标)ꎬ分别配制 ３％、５％、７％、９％
(ｖ / ｖ)的氯乙酰￣甲醇酯化反应液ꎮ 取少许等量的膜
脂ꎬ密封 ８０ ℃水浴 １ ｈ 完成脂肪酸甲脂化ꎮ ＧＣ 检
测结果显示ꎬ用 ３％氯乙酰￣酯化反应液衍生化后ꎬ
ＧＣ检测色谱峰面积较小ꎬ出现部分齐肩峰ꎬ但 ５％、
７％和 ９％(ｖ / ｖ)氯乙酰￣酯化反应液衍生化后ꎬＧＣ 色
谱峰形及分离效果均好ꎮ 因此选择 ５％(ｖ / ｖ)氯乙
酰￣甲醇酯化反应液进行酯化反应ꎮ
经以上三种方法完成脂类水解的脂肪酸甲脂化
后ꎬ冷却至室温ꎬ先加入 １ ｍＬ 双蒸水和 ２ ｍＬ 正己
烷ꎬ摇匀ꎬ吸出正己烷层ꎬＮ２吹干ꎬ再加入一定量的
正己烷定容后得到供试品溶液ꎬ取样 ２ μＬꎬ用气相
色谱仪(ＧＣ￣ｓｙｓｔｅｍꎬＨＰ￣６８９０)检测ꎮ 色谱检测条件
为进样口:分流 /不分流进样器ꎬ２６０ ℃ꎬ分流比为
５０ ∶ １ꎻ检测器:ＦＩＤꎬ２８０ ℃ꎻ色谱柱:ＨＰ￣ＩＮＮＯＷＡＸ
柱(３０ ｍ × ０.２５ ｍｍ × ０.２５ μｍ)ꎻ载气:氦气(平均
限速 ３６ ｃｍ􀅰ｓ￣１)ꎻ柱温:５０ ℃保持 １ ｍｉｎꎬ２５ ℃􀅰
ｍｉｎ￣１升温至 ２００ ℃ꎬ而后 ３ ℃􀅰ｍｉｎ￣１升温至 ２３０ ℃ꎬ
再 １０ ℃􀅰ｍｉｎ￣１升温至 ２５０ ℃ꎮ
１.２.３ 脂肪酸含量的计算　 根据色谱图数据按以下
公式进行计算ꎮ
Ｗｉ ＝ ｆ′ｉ􀅰
ｍｓ􀅰Ａｉ
ｍ试样􀅰Ａｓ
式中ꎬＷｉ为被测组分的含量ꎬｆ′ｉ 为组分 ｉ的质量
校正因子ꎬＡｉꎬＡｓ分别为组分和内标物的峰面积ꎬｍｓ
和 ｍ试样分别为内标物和样品的重量ꎮ
２　 结果与分析
２.１ 叶绿体膜脂肪酸酯化气相色谱检测
图 １ 显示ꎬ三种方法酯化叶绿体膜脂肪酸后获
得的气相色谱检测图基线平稳ꎬ７ 种脂肪酸 １６ ∶ ０、
１６ ∶ １、１７ ∶ ０、１８ ∶ ０、１８ ∶ １、１８ ∶ ２ 和 １８ ∶ ３ 分离效
果好(图 １:ＡꎬＢꎬＣ)ꎮ 但在相同的进样量下ꎬ方法二
图 １　 三种方法酯化后叶绿体膜脂肪酸的气相色谱图
Ａ. 方法一ꎻ Ｂ. 方法二ꎻ Ｃ. 方法三　 １＝ １６ ∶ ０ꎻ ２＝１６ ∶ １ꎻ ３＝１７ ∶ ０ꎻ
４＝１８ ∶ ０ꎻ ５＝１８ ∶ １ꎻ ６＝１８ ∶ ２ꎻ ７＝１８ ∶ ３ꎮ 下同ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｔｙｐｉｃａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ａ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ
ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｒｏｍ ｂｌｕｅｇｒａｓｓ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ　
Ａ. Ｍｅｔｈｏｄ Ｉꎻ Ｂ. ＭｅｔｈｏｄⅡꎻ Ｃ. Ｍｅｔｈｏｄ Ⅲ. １＝１６ ∶ ０ꎻ ２＝１６ ∶ １ꎻ ３＝１７ ∶ ０ꎻ
４＝１８ ∶ ０ꎻ ５＝１８ ∶ １ꎻ ６＝１８ ∶ ２ꎻ ７＝１８ ∶ ３. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
表 １　 三种方法酯化后叶绿体膜脂肪酸含量
Ｔａｂｌｅ １　 Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｐｏｏｌｅｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ
ｆｒｏｍ ｂｌｕｅｇｒａｓｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ (ｍｏｌ ％)
脂肪酸类型
Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｔｙｐｅ
叶绿体膜 Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ
方法一
Ｍｅｔｈｏｄ Ｉ
方法二
Ｍｅｔｈｏｄ Ⅱ
方法三
Ｍｅｔｈｏｄ Ⅲ
１６ ∶ ０ ４２.３５±５.４０ ４１.３９±３.３２ ４１.９１±３.３２
１６ ∶ １ ３.３５±０.４１ ３.９１±０.２０ ３.４２±０.２１
１８ ∶ ０ １２.１±３.１７ １０.８７±０.５６ １０.４３±０.８３
１８ ∶ １ ８.７１±０.６３ ９.１３±０.８４ ９.３１±０.４６
１８ ∶ ２ ２６.３５±１.９０ ２６.９６±２.６３ ２６.４９±１.３５
１８ ∶ ３ ７.１８±１.４５ ７.８３±０.５３ ８.４４±０.４５
　 注: 数据为 ４个重复的平均值± ＳＤꎮ 下同ꎮ
　 Ｎｏｔｅ: Ｄａｔａ ａｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｓ ｍｅａｎｓ ± ＳＤꎬｎ＝ ４. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
的各个峰面积比方法一和方法三的大ꎬ表明方法二
对早熟禾叶绿体膜脂肪酸的酯化程度比后两者的更
高ꎮ 本研究以 １７ ∶ ０ 为内标ꎬ计算结果表明叶绿体
膜脂肪酸经三种方法酯化后所测定的 ６种脂肪酸含
量无显著性差异ꎬ但方法一对叶绿体膜中几种脂肪
酸含量测定的数据相对偏差较大ꎬ酯化不稳定ꎬ表明
３４７６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 王维等: 早熟禾细胞膜脂肪酸衍生化方法比较
图 ２　 三种方法酯化后线粒体膜脂肪酸的气相色谱图
Ｆｉｇ. ２　 Ｔｙｐｉｃａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ａ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ
ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｒｏｍ ｂｌｕｅｇｒａｓｓ
ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ
表 ２　 三种方法酯化后线粒体膜脂肪酸含量
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｐｏｏｌｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ
ｆｒｏｍ ｂｌｕｅｇｒａｓｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ (ｍｏｌ ％)
脂肪酸类型
Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｔｙｐｅ
线粒体膜 Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ
方法一
Ｍｅｔｈｏｄ Ｉ
方法二
Ｍｅｔｈｏｄ Ⅱ
方法三
Ｍｅｔｈｏｄ Ⅲ
１６ ∶ ０ ４３.５３±４.８９ ４８.８７±１.４５ ４２.９±２.９８
１６ ∶ １ ２.０３±０.５４ １.８８±０.２７ １.９８±０.１２
１８ ∶ ０ １０.２４±１.０２ ３３.８３±０.７３ １０.８９±０.１２
１８ ∶ １ ９.１７±０.９２ ７.５２±０.８３ ９.２４±０.４３
１８ ∶ ２ ３０.９２±４.１１ ７.３２±０.９０ ３１.３５±１.０７
１８ ∶ ３ ４.１１±０.４４ ０.１８±０.１２ ５.２８±０.３４
衍生化程度不完全(表 １)ꎮ
２.２ 线粒体膜脂肪酸酯化气相色谱检测结果
与叶绿体膜脂肪酸酯化不同的是ꎬ在相同进样
量下ꎬ线粒体膜脂肪酸经方法二酯化后的各个峰面
积比方法一和方法三的小(图 ２)ꎮ 经方法一对线粒
体膜中几种脂肪酸酯化后ꎬ测定的数据相对偏差较
大ꎬ衍生化效果不稳定ꎮ 经方法三酯化后分离效果
好ꎬ所测定的 ６种脂肪酸含量差异不显著(图 ２:Ａꎬ
Ｃꎻ表 ２)ꎮ 用方法二酯化后色谱图表明ꎬ脂肪酸
１８ ∶ １和 １８ ∶ ２ 含量很低ꎬ１８ ∶ ３ 几乎检测不到(图
图 ３　 三种方法酯化后液泡膜脂肪酸的气相色谱图
Ｆｉｇ. ３　 Ｔｙｐｉｃａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ａ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ
ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｒｏｍ ｂｌｕｅｇｒａｓｓ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ
２:Ｂꎻ表 ２)ꎮ 说明用方法二酯化早熟禾叶片线粒体
膜脂肪酸时有可能 １８ ∶ １ꎬ１８ ∶ ２和 １８ ∶ ３ 有时不能
完全衍生化ꎮ
２.３ 液泡膜和质膜脂肪酸酯化气相色谱检测结果
由图 ３ 和图 ４ 可知ꎬ用这三种方法分别对液泡
膜和细胞质膜的 ６ 种脂肪酸酯化ꎬ所得色谱图中各
脂肪酸峰分离效果均好ꎮ 图 ３ 结果表明ꎬ方法二酯
化后的各个峰面积比方法一和方法三的大ꎬ而在质
膜气相色谱检测图中ꎬ三种酯化方法下各个峰面积
基本接近(图 ４)ꎮ 此外ꎬ测定二者本身的 ６ 种脂肪
酸含量在方法之间差异不显著(表 ３ꎬ表 ４)ꎮ
３　 讨论与结论
脂肪酸衍生化程度的高低直接影响后续气相色
谱的分离效果与脂肪酸含量的准确测定ꎮ 本研究结
果表明相同进样量、相同色谱条件下检测得到的几
种脂肪酸分离效果均好ꎬ但色谱图峰面积大小有时
不同ꎬ表明不同的酯化方法对同一种膜脂肪酸的酯
化程度不同ꎮ 在三种酯化方法中ꎬ我们所采用的均
为内标法(以 １７ ∶ ０ 为内标)ꎮ 内标法结合峰面积
归一法和外标法的优点ꎬ在加入内标后ꎬ按峰面积归
一法的分析方法进行分析ꎬ避免了由于进样的一致
性及样品歧视效应导致的偶然误差ꎮ 结果表明三种
酯化方法对同一种膜脂肪酸的酯化程度有差异ꎮ
４４７ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
图 ４　 三种方法酯化后细胞质膜脂肪酸的气相色谱图
Ｆｉｇ. ４　 Ｔｙｐｉｃａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ａ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｐｌａｓｍａ
ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｒｏｍ ｂｌｕｅｇｒａｓｓ ｔｈａｔ ｗａｓ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ
表 ３　 三种方法酯化后液泡膜脂肪酸含量
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｐｏｏｌｅｄ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ
ｆｒｏｍ ｂｌｕｅｇｒａｓｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ (ｍｏｌ ％)
脂肪酸类型
Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｔｙｐｅ
液泡膜 Ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ
方法一
Ｍｅｔｈｏｄ Ｉ
方法二
Ｍｅｔｈｏｄ Ⅱ
方法三
Ｍｅｔｈｏｄ Ⅲ
１６ ∶ ０ ４２.３７±１.４０ ４３.６９±１.３２ ４２.８８±２.８５
１６ ∶ １ ２.８２±０.１１ ２.９１±０.３３ ３.０２±０.１２
１８ ∶ ０ １２.１５±０.４７ １１.８４±１.０６ １１.９３±０.４３
１８ ∶ １ ５.６５±０.２３ ５.１±０.１４ ５.８１±０.２２
１８ ∶ ２ １４.０７±０.９０ １３.８２±１.１１ １３.８９±０.６５
１８ ∶ ３ ２２.０３±１.１６ ２２.４６±２.０３ ２３.４７±１.０１
　 　 酯化方法的不同ꎬ可能会影响脂肪酸定量的准
确度ꎮ 本研究结果表明ꎬ对早熟禾叶绿体用 ＢＦ３￣甲
醇酯化后测得的脂肪酸 １６ ∶ ０和 １８ ∶ ０的含量数据
相对偏差较大ꎬ说明方法一对该膜系统的这部分脂
肪酸甲酯转化率不稳定ꎬ与方法二和方法三在衍生
生化程度上存在差异ꎮ 对线粒体而言ꎬ通过 ＨＣｌ￣甲
醇酯化后获得的脂肪酸 １８ ∶ １、１８ ∶ ２和 １８ ∶ ３ 的气
相色谱峰面积相对过小ꎬ说明方法二对某些脂肪酸
衍生化程度不高ꎬ而方法一和方法三酯化后的分离
效果好ꎬ 脂肪酸含量测定差异不显著ꎮ 但方法一对
表 ４　 三种方法酯化后细胞质膜脂肪酸含量
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｐｏｏｌｅｄｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｒｏｍ
ｂｌｕｅｇｒａｓｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ (ｍｏｌ ％)
脂肪酸类型
Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｔｙｐｅ
细胞质膜 Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ
方法一
Ｍｅｔｈｏｄ Ｉ
方法二
Ｍｅｔｈｏｄ Ⅱ
方法三
Ｍｅｔｈｏｄ Ⅲ
１６ ∶ ０ ３０.４８±１.２ ３０.８７±１.４５ ３１.０２±１.０５
１６ ∶ １ １.８±０.１９ １.８８±０.２７ １.７８±０.１２
１８ ∶ ０ ７.２４±０.３２ ７.０３±０.７３ ７.１９±０.３３
１８ ∶ １ ９±０.４２ ８.５２±０.１３ ８.８７±０.４１
１８ ∶ ２ ２０.４±１.１１ ２０.３２±０.１０ ２１.０５±１.０３
１８ ∶ ３ ３１.０８±１.５４ ３１.３８±１.４５ ３０.０９±０.３４
咖啡类囊体膜ꎬ叶绿体膜(Ｒａｍａｌｈｏ ｅｔ ａｌꎬ１９９８)、方
法二对海洋硅藻(Ｒｏｕｓｃｈ ｅｔ ａｌꎬ２００３)脂肪酸衍生化
程度高ꎮ 造成这种差异可能与材料本身来源及特性
有关ꎮ 植物细胞生物膜中脂肪酸常以磷脂、糖脂、脂
蛋白等形式存在ꎬ在外界影响下其含量配比会发生
变化ꎬ如在铝胁迫下ꎬ小麦根液泡膜磷脂和半乳糖脂
含量会增加(何飞龙ꎬ２０００)ꎮ 脂肪酸饱和程度会影
响膜脂的流动性ꎬ在各种因素影响下ꎬ膜脂肪酸的存
在形式并非固定不变ꎬ常处于液晶转换的动态平衡
中ꎮ 当受到紫外线 Ｂ 辐射时ꎬ小麦叶绿体膜类脂组
分配比及脂肪酸不饱和度指数常会发生变化(杨景
宏等ꎬ２０００)ꎮ 低温逆境下ꎬ水稻剑叶叶绿体类囊体
膜内产生的大量氧自由基ꎬ引起膜脂过氧化及不饱
和类脂和脂肪酸含量的变化(王静ꎬ２００６)ꎮ 所以材
料中脂肪酸的结合形式与存在状态都可能会造成衍
生化上的差异ꎮ 就液泡膜和细胞质膜而言ꎬ除了方
法二酯化液泡膜脂肪酸后气相测得的六种脂肪酸色
谱峰面积相对大些外ꎬ总的来说用三种方法酯化后
检测分离效果均好ꎮ
综合比较分析这三种酯化的衍生化方法ꎬ发现
方法三用氯乙酰对脂肪酸酯化而后进行气相色谱测
定更能同时适用于早熟禾的这四种膜脂肪酸含量测
定ꎮ 方法三是 Ｍａｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ(２００５)在 Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ
(２０１０)传统的酯化方法基础上ꎬ将许多补充的反应
环节简化成的一步法ꎬ在与脂肪酸样品反应之前ꎬ先
制备一种甲醇、乙酰氯储备液ꎬ然后再与脂肪酸样品
反应ꎮ 该方法更多是用来检测动物或人体血红细胞
膜脂肪酸含量ꎬ在植物细胞膜脂肪酸酯化上的应用
５４７６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 王维等: 早熟禾细胞膜脂肪酸衍生化方法比较
还很少ꎮ 本研究结果表明ꎬ虽然植物细胞膜系统与
动物血红细胞质膜之间组成上存在差异ꎬ但将氯乙
酰与反应储备液(内标、甲醇)的配比优化后ꎬ用该
方法能准确同时测定早熟禾四种不同细胞器膜脂肪
酸含量ꎬ且效果显著ꎮ 该方法与传统植物膜脂肪酸
衍生化相比具有步骤少、操作简单、能同时准确测定
几种膜系统脂肪酸等优势ꎬ这为其他相关植物的细
胞膜脂肪酸测定提供借鉴ꎮ
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