全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Mar． 2013，33(2) :185 － 190 http:/ / journal． gxzw． gxib． cn
DOI:10． 3969 / j． issn． 1000-3142． 2013． 02． 009
李猛，王平，孙吉康，等． 蚬壳花椒 ISSR-PCR反应体系的建立及优化［J］． 广西植物，2013，33(2) :185 －190
Li M，Wang P，Sun JK，et al． Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system on Zanthoxylum dissitum［J］． Guihaia，2013，33(2):185 －190
蚬壳花椒 ISSR-PCR反应体系的建立及优化
李 猛，王 平* ，孙吉康，孙小青，程 鹏
(中南林业科技大学 生命科学与技术学院，长沙 410004 )
摘 要:通过单因素试验及正交设计方法对影响蚬壳花椒 ISSR-PCR 扩增的主要因素(模板 DNA、Mg2 +的浓
度、引物、dNTPs，TaqDNA聚合酶的用量以及退火温度)进行优化，以建立蚬壳花椒 ISSR-PCR 反应的最佳体
系。结果表明:最佳反应体系(20 μL)为模板 DNA 60 ng、MgCl2 2． 5 mmol /L、dNTPs 0． 15 mmol /L、引物 0. 6
μmol /L、Taq DNA聚合酶 2． 4 U。在此基础上，从 100 条引物中筛选出 18 条扩增稳定、多态性好的 ISSR 引物
并经过 10份蚬壳花椒种质检验，证明该体系具有扩增条带清晰、稳定、重复性好等优点。该反应体系的建立
为蚬壳花椒种质资源分类、遗传多样性分析提供了更客观可靠的方法。
关键词:蚬壳花椒;正交优化;ISSR-PCR
中图分类号:Q949 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2013)02-0185-06
*
Establishment and optimization of ISSR-PCR
reaction system on Zanthoxylum dissitum
LI Meng，WANG Ping* ，SUN Ji-Kang，
SUN Xiao-Qing，CHENG Peng
(College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China )
Abstract:In order to establish the optimal ISSR-PCR reaction system of Zanthoxylum dissitum，several factors that most-
ly affect the amplification of ISSR-PCR reaction of Z． dissitum，including DNA template，Mg2 + concentration，primers，
dNTPs，TaqDNA polymerase dosage and annealing temperature，were investigated and optimized by single-fact test and
orthogonal-design method in the experiment． The results indicated the most stable and suitable reaction system had been
established when the amount of DNA template was 60 ng，the dosage of Taq DNA polymerase was 2． 4 U and the concen-
tration of MgCl2，dNTPs and primers was 2． 5 mmol /L，0． 15 mmol /L，0． 6 μmol /L respectively． Further more，18 ISSR
primers that possessed the characteristics of stable amplification and rich polymorphism were screened from 100 ISSR
primers，and they were examined by the germplasm test of 10 Z． dissitum parts． The results of the examination proved that
this ISSR reaction system had the advantages of clearness，stability and good repeatability． In conclusion，this established
ISSR-PCR reaction system provided an available and reliable method for genetic diversity analysis and germplasm classi-
fication of Z． dissitum．
Key words:Zanthoxylum dissitum;orthogonal design;ISSR-PCR
蚬壳花椒(Zanthoxylum dissitum) ，中药名为单
面针，又名山枇杷、大叶花椒、蚌壳花椒等(中国科
学院植物研究所，1979) ，属芸香科花椒属常绿蔓生
木质藤本灌木。其根、茎及叶均可入药，临床上主治
* 收稿日期:2012-11-19 修回日期:2012-12-28
基金项目:高等学科博士学科点专项科研基金(200943921110002);国家林业公益性行业科研专项(201204606)
作者简介:李猛(1986-) ，男，河南汝南县人，在读硕士研究生，生物化学与分子生物学专业，(E-mail)limongmong7513@ 163． com。
* 通讯作者:王平，教授，博士生导师，主要从事应用生物技术方面的教学与研究工作，(E-mail)csfuwp@ 163． com。
牙痛、腰痛、妇女月经过多，产后月经不调等症状
(全国中草药汇编编写组，1975)。零星分布于我国
西南、广东、广西、湖南、湖北、贵州、四川、陕西等地
(孙小文，1996)。近年来，相关中成药生产规模日
趋扩大，而蚬壳花椒的自然繁殖率低，生长也较缓
慢，致使该自然资源日趋贫乏，并逐渐威胁着相关药
厂的正常生产。寻求适宜的繁殖途径，迅速扩大蚬
壳花椒资源供给已势在必行。目前，只是从分离、鉴
定方面对蚬壳花椒有效成分及种子离体胚繁殖方面
做了一定研究，分子生物学方面研究却涉及很少，通
过对其种群遗传结构的分析探讨种间和种内谱系地
理结构形成的机制和系统发育关系，并结合种群的
地理分布来发现和验证其相关地理时间和环境变
化，从而发现最优品系，从根本上解决其繁殖率低的
问题(王平等，2008;马英姿等，2009a，b)。
ISSR(Inter-simple sequence repeats)标记检测是
由 Zietkiewicz E等建立的一种基于聚合酶链式反应
(PCR)技术的分子标记(Zietkiwicz et al．，1994)。
本文利用正交实验设计对影响蚬壳花椒 ISSR-PCR
扩增的重要因素进行优化，以建立蚬壳花椒 ISSR-
PCR反应的最佳体系。旨在为 ISSR 技术进一步应
用于蚬壳花椒种群遗传变异分析、辅助育种、系统进
化等研究奠定技术基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
材料于 2012 年 5 月初采集于湖南省张家界市
青坪乡，将采回的蚬壳花椒新鲜叶片置于-70 ℃冰
箱中保存备用。参照加拿大哥伦比亚 UBC 公司
2006 年公布的 ISSR引物序列，由北京鼎国生物技术
有限公司合成。经初步筛选出的 888号引物，即 BDB
(CA)7 作为此次反应体系优化实验的固定引物。
1． 2 方法
1． 2． 1 基因组 DNA提取与检测 采用改良的 CTAB
法(恭维，2007) ，提取蚬壳花椒叶片基因组 DNA。
用 Eppendorf公司的 Biophotometer 核酸蛋白分析仪
检测 DNA含量和纯度，用 0． 8%琼脂糖凝胶电泳检
测提取的总 DNA 质量，用 G-BOX 紫外凝胶成像系
统观察 DNA是否污染并拍照记录。
1． 2． 2 ISSR-PCR 反应体系正交实验设计 采用 L16
(45)正交实验设计，对模板 DNA、Mg2 +、dNTP、引物
和 Taq 酶进行筛选(表 1)。包括 2． 5 μL 10 × PCR
Buffer，引物用 BDB(CA)7，总反应体系为 20 μL。
PCR扩增程序参考汉素真等(2011) :94 ℃预变性 3
min;94 ℃变性 50 s，58 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 90 s，
进行 35 个循环;循环结束后，72 ℃延伸 8min，4 ℃
保存。扩增结束后反应在 1． 5%琼脂糖凝胶上电
泳，凝胶中含有 0. 05%溴化乙锭，电极缓冲为 1 ×
TAE，电压为 5 V /cm，电泳结束后在凝胶成像分析
仪上观测分析并照相。
表 1 ISSR-PCR正交实验设计 L16(4
5)
Table 1 Orthogonal design for ISSR-PCR L16(4
5)
处理
组合
Treatment
combination
因素 Factor
DNA
(ng)
Mg2 +
(μmol
·L-1)
dNTP
(mmol
·L-1)
引物 Primer
(μmol
·L-1)
Taq DNA
聚合酶(U)
1 30． 00 1． 00 0． 10 0． 40 1． 20
2 30． 00 1． 50 0． 15 0． 50 1． 60
3 30． 00 2． 00 0． 20 0． 60 2． 00
4 30． 00 2． 50 0． 25 0． 70 2． 40
5 40． 00 1． 00 0． 15 0． 60 2． 40
6 40． 00 1． 50 0． 10 0． 70 2． 00
7 40． 00 2． 00 0． 25 0． 40 1． 60
8 40． 00 2． 50 0． 20 0． 50 1． 20
9 50． 00 1． 00 0． 20 0． 70 1． 60
10 50． 00 1． 50 0． 25 0． 60 1． 20
11 50． 00 2． 00 0． 10 0． 50 2． 40
12 50． 00 2． 50 0． 15 0． 40 2． 00
13 60． 00 1． 00 0． 25 0． 50 2． 00
14 60． 00 1． 50 0． 20 0． 40 2． 40
15 60． 00 2． 00 0． 15 0． 70 1． 20
16 60． 00 2． 50 0． 10 0． 60 1． 60
1． 2． 3 ISSR-PCR 扩增体系的单因素试验设计 依
据正交实验结果，选择扩增效果较好的反应体系，在
此基础上进行单因素实验，进一步优化影响扩增效
果的因素。其中 DNA模板设置 20、30、40、50、60、70
ng 6 个梯度，Mg2 +浓度设置为 1． 0、1． 5、2． 0、2. 5、3．
0、3． 5 μmol /L 6 个梯度，dNTP浓度设置 0. 05、0． 10、
0． 15、0． 20、0． 25、0． 30 mmol /L 6 个梯度，引物浓度设
置 0． 3、0． 4、0． 5、0． 6、0． 7、0． 8 μmol /L 6 个梯度，Taq
DNA聚合酶用量设置 1． 2、1． 6、2． 0、2. 4、2． 8、3． 2 U 6
个梯度，以上均为 2 次重复。每个最佳条件确定后，
作为后续研究的一个条件。
1． 2． 4 ISSR-PCR 扩增体系的正交试验设计 根据
正交实验的结果，筛选出最佳反应体系，对蚬壳花椒
反应程序进行优化，以最佳反应程序对退火温度进行
梯度实验。根据所选引物序列计算理论退火温度
Tm，设定退火温度为 53、54、55、56、57、58、59、60、61、
62、63、64 ℃ 12 个梯度范围，确定最佳退火温度。
681 广 西 植 物 33 卷
1． 2． 5 最佳反应体系验证 随机选用引物 UBC888，
采用最优体系对 10 份不同的蚬壳花椒种质 DNA 进
行 ISSR-PCR扩增，验证该体系的稳定性。
2 结果与分析
2． 1 DNA纯度与浓度
将提取的蚬壳花椒基因组 DNA稀释 100 倍，在
UnicoTM UV-2102PC型紫外分光光度计上检测 260
nm和 280 nm的吸光值，计算所提取 DNA的纯度和
浓度。当 OD260 /OD280比值介于 1． 6 ～ 2． 0 之间时，
表明提取的 DNA 样品较纯，可以贮存备用;若
OD260 /OD280 ＞ 2． 0 说明有酚或者蛋白质存在;若
OD260 /OD280 ＜ 1． 6，说明有 RNA 存在(张维铭，
2003)。表 2 结果显示，所提取 DNA 的 OD260nm /
OD280nm值在 1． 6 和 2． 0 之间，浓度和纯度都符合 IS-
SR标记技术对 DNA质量的要求。
表 2 DNA的紫外检测结果
Table 2 The ultraviolet absorption test of DNA
样品来源
Sample source OD260nm OD280nm
OD260nm /
OD280nm
DNA浓度
DNA con-
centration
(μg /mL)
张家界市清平乡 0． 107 0． 059 1． 790 260． 000
2． 2 PCR正交设计直观分析
根据 L16(4
5)正交实验 PCR 电泳结果(图 1) ，
参照何正文等(1998)的方法，对其从高到低依次打
分。条带数量丰富、清晰度高记为 16 分，与此相反
最差则记为 1 分。1-16 组合分数依次为:6、8、10、
16、10、4、13、11、2、8、12、11、1、1、10、6。以特异谱带
多态性高、背景干扰低、主带清晰、复带明显为原则，
同时考虑实验成本，L16(4
5)第 4 组为蚬壳花椒 IS-
SR-PCR最佳反应体系。对 DNA模板、Mg2 +、dNTP、
引物和 Taq酶 5 因素不同水平间平均值的极差进行
统计分析，其中分别为 5． 5、6． 5、4． 0、0. 75、3． 75，说
明对 PCR 反应的影响从大到小依次为 Mg2 +、DNA
模板、dNTP、Taq酶和引物。
2． 3 单因子实验结果分析
2． 3． 1 模板 DNA用量对 ISSR-PCR扩增结果的影响
模板 DNA的浓度对 PCR结果有很大影响。结果
如图 2 所示，在 20 μL反应体系内加入 20 ～ 70 ng模
板 DNA 时，均能扩增出多态性条带。当浓度为 20
～ 60 ng 时，随着 DNA 浓度增加谱带数目越多且更
清晰，当浓度为 70 ng 时，谱带清晰度稍微下降，故
选择 60 ng为最佳模板浓度。
图 1 蚬壳花椒正交实验结果
Fig． 1 Electrophoregram of ISSR-PCR
products of P． vulgaris
1-16 处理编号同表 1，M-Marker标准分子量 DL3000。下同。
The Treatments of No． 1-16 are same as the one showed in Table 1．
The standard molecular weight of M-Marker is DL3000． The same
below．
2． 3． 2 Mg2 + 浓度对 ISSR-PCR 扩增结果的影响
Mg2 +是 Taq DNA 聚合酶活性所必需的，对 PCR 扩
增的效率、特异性、退火温度都有影响(王关林等，
1998)。Mg2 + 可以和 dNTP、DNA 和引物形成复合
物，从而降低 Mg2 +的有效浓度，影响 PCR 的结果。
结果如图 3 所示，当 Mg2 +浓度为 1． 00 ～ 2. 50 mmol /
L时，随着 DNA 浓度增加谱带数目越多且更清晰;
当 Mg2 +浓度继续增加时则有拖带现象。故选择 2．
50 mmol /L为最佳 Mg2 +浓度。
2． 3． 3 dNTPs 浓度对 ISSR-PCR 扩增结果的影响
dNTPs是 TaqDNA 聚合酶的底物，它的浓度也会直
接影响到 PCR反应的结果，如果 dNTPs浓度过低会
降低 PCR 产物的产量，过高会造成浪费，且会降低
Mg2 +的有效浓度(王关林等，1998;周凌瑜等，
2008)。结果如图 4 所示，随着 dNTP 浓度增加谱带
数目越多且更清晰，当浓度为 0． 15 mmol /L最清晰，
与 0． 20 ～ 0． 30 mmol /L 无明显差异，故选择 0. 15
mmol /L为最佳 dNTP浓度。
2． 3． 4 引物浓度对 ISSR-PCR 扩增结果的影响 引
物是 PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取
决于模板 DNA 与引物的互补程度。但引物与模板
DNA的结合又受到其他因素的影响，如 Mg2 +浓度。
结果如图 5 所示，当引物浓度在 0． 30 ～ 0． 60 μmol /L
时，扩增条带逐渐增多且清晰，当浓度为 0. 60
7812 期 李猛等:蚬壳花椒 ISSR-PCR反应体系的建立及优化
μmol /L时，扩增条带最清晰;当引物浓度为 0． 70 ～
0． 80 μmol /L 时，扩增条带则出现拖尾现象。故选
择 0． 60 μmol /L为引物最佳浓度。
2． 3． 5 TaqDNA 聚合酶浓度对 ISSR-PCR 扩增结果
的影响 在酶促反应中，酶量的多少起了非常重要
的作用，太少会影响底物的结合，减少产物，酶量太
多又会造成酶的浪费。ISSR-PCR 反应也是一个酶
促反应，对 TaqDNA聚合酶的优化就显得尤为重要。
结果如图 6 所示，随着 TaqDNA聚合酶用量的增加，
扩增条带越谱带越多且清晰;当 TaqDNA 聚合酶浓
度为 2． 4 U时，谱带最清晰，而随着用量的增加清晰
度没有明显变化，故选择 2． 4 U为 Taq DNA 聚合酶
最佳用量。
图 2 不同模板 DNA浓度 (1-6:20、30、40、50、60、70 ng)
Fig． 2 Electrophoregram of ISSR-PCR with
different concentrations of template DNA
图 3 Mg2 +浓度对 ISSR扩增的影响
(1-6:1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0、3． 5 μmol /L)
Fig． 3 Electrophoregram of ISSR-PCR with
different concentrations of Mg2 +
2． 3 ISSR-PCR反应程序优化
退火温度为引物和模板结合时的温度常数，它
图 4 dNTP浓度对扩增的影响
(1-6:0． 05、0． 10、0． 15、0． 20、0． 25、0． 30 mmol /L)
Fig． 4 Electrophoregram of ISSR-PCR with
different concentrations of dNTP
图 5 引物浓度对扩增的影响
(1-6:0． 3、0． 4、0． 5、0． 6、0． 7、0． 8 μmol /L)
Fig． 5 Electrophoregram of ISSR-PCR with
different concentrations of primer
图 6 Taq酶用量对 ISSR扩增的影响
(1-6:1． 2、1． 6、2． 0、2． 4、2． 8、3． 2 U)
Fig． 6 Electrophoregram of ISSR-PCR with
different dosages of Taq DNA polymerases
881 广 西 植 物 33 卷
是影响 PCR 特异性的较重要的因素。以本实验所
使用引物 UBC888 为例，以其 Tm(58 ℃)值为中心，
设置 6 个退火温度梯度(53、54、55、56、57、58、59、
60、61、62、63、64 ℃)进行 PCR 扩增。由图 7 得出，
引物 UBC854 在 58 ℃时，扩增出的条带多而亮，而
低于或者高于 58 ℃，扩增的条带相对较少且亮度
浅。因此，退火温度的高低也直接影响着扩增反应
的结果，蚬壳花椒 ISSR反应体系中引物 UBC888 最
适宜的退火温度为 58 ℃。
图 7 引物梯度退火电泳图
(1-12:53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 ℃)
Fig． 7 Electrophoregram of annealing
temperature of primer
图 8 优化的 ISSR-PCR反应体系
对 10份蚬壳花椒种质扩增结果
Fig． 8 Electrophoregram of 10 P． vulgaris DNA
with optimized ISSR-PCR reaction system
2． 4 ISSR-PCR反应体系应用
应用建立的蚬壳花椒 ISSR-PCR 的最佳体系，
从 100 条 ISSR引物中筛选出 18 条扩增稳定、多态
性高的引物。以 UBC888 引物为例，运用最优组合
对 10 份种质材料进行扩增，发现得到的条带数目
多、清晰、重复性好，能区分 10 份蚬壳花椒种质，结
果如图 8 所示，这表明建立的 ISSR-PCR 反应体系
稳定可靠，适合于蚬壳花椒 ISSR-PCR的反应。
3 结论与讨论
近年来，ISSR 分子标记技术由于其操作简便，
具有较高的多态性与重现性，被广泛应用于遗传多
样性分析、DNA指纹图谱绘制等众多领域(李嵘等，
2008)。基于 PCR技术的 ISSR分子标记的研究，反
应体系的建立是第一步，这关系到后续的试验能否
顺利进行并获得理想的结果。影响 ISSR-PCR 扩增
的因素很多，组成反应体系和程序中的每个因子都
可以影响到扩增的效果。因此，要获得较稳定、清
晰、可重复的条带，需要对 ISSR-PCR 反应体系的各
种影响因子如 Taq 酶、dNTPS、引物浓度、模板浓度
及退火温度等进行优化。
目前，ISSR-PCR反应体系的优化方法多采用正
交或单因素设计，正交设计可以更快更有效地分析
不同因素的互相作用，但处理水平的设置相对有限，
单因素设计可以较系统和精细地研究各主要因子的
影响，但无法探讨因素间互作效应。本实验首先采
用正交设计后结合单因子设计进一步优化体系，弥
补上述实验不足，可以简单快速地建立蚬壳花椒 IS-
SR-PCR 反应体系，得到稳定且多态性丰富的扩增
谱带。
在正交实验中，以 Mg2 +影响最为显著，这与彭
继庆等(2011)研究结果一致。Mg2 +是 Taq DNA 聚
合酶活性所必需的，而且 Mg2 + 可以和 dNTP、DNA
和引物形成复合物，从而降低 Mg2 +的有效浓度，影
响 PCR的结果。浓度过高可降低 PCR 扩增的特异
性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使扩增失
败。从本实验的结果来看，反应体系中 Mg2 +浓度在
2． 00 ～ 3． 00 mmol /L能扩增出较好的条带。
本研究确定的蚬壳花椒 ISSR-PCR 反应的最佳
体系(20 μL)为模板 DNA 60 ng、MgCl2 2． 5 mmol /L、
引物 0． 6 μmol /L、dNTPs 0． 15 mmol /L、Taq DNA 聚
合酶 2． 4 U。扩增反应程序为 94 ℃预变性 3 min;
94 ℃变性 50 s，58 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 90 s，35
个循环;72 ℃延伸 8 min;4 ℃保存。该反应体系的
建立为蚬壳花椒种质资源分类、遗传多样性分析以
及选取最优性状提供了更客观可靠的方法，同时为
其它物种的 ISSR-PCR分子标记研究提供借鉴与参
考。
9812 期 李猛等:蚬壳花椒 ISSR-PCR反应体系的建立及优化
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