全 文 ：738-745
05/ 2011
草　业　科　学
PRA TACULTU RA L SCIENCE
28 卷 05 期
Vol.28 , No.05
植物生产层 垂穗披碱草 ISSR反应体系的正交优化
刘新亮1, 2 ,德英1 ,赵来喜1
(1.中国农业科学院草原研究所 ,内蒙古 呼和浩特 010010;2.中国农业科学院研究生院 ,北京 100081)
摘要:以垂穗披碱草(Elymus nutans)基因组 DNA为模板 ,对 ISSR-PCR反应体系中 5 个因素(TaqDNA 聚合酶 、
M g2+、模板 DNA 、dNTPs 、引物)进行优化试验 , 建立垂穗披碱草稳定的 ISSR-PC R反应体系及最佳扩增程序。在
25 μL反应体系中 , 最佳反应体系为 2.5 μL 10×buffe r(不含 Mg2+)、1.0 U Taq 酶 、2.0 mmol/ L Mg2+、30 ～ 120
ng 模板 DNA 、0.25 mmo l/ L dNTPs、0.25 μmo l/ L 引物。在优化体系的基础上筛选出 11 条多态性丰富 , 扩增稳
定的引物 ,并通过设置退火温度梯度 、循环次数梯度 、延伸时间梯度 , 得到垂穗披碱草 ISSR-PCR 最佳扩增程序。
反应程序:94℃预变性 2 min , 94℃变性 1 min , 51℃退火 1 min(视不同引物而定), 72℃延伸 1.5 min , 共 41 个循
环 , 72℃延伸 10 min。通过对 ISSR-PCR最佳反应体系和最佳扩增程序的验证 , 发现该反应体系和扩增程序具有
较高的稳定性和较好的重复性。
关键词:垂穗披碱草;ISS R-PCR;正交优化
中图分类号:S543+.9;Q94-33　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2011)05-0738-08
①　垂穗披碱草(E lymus nutans)为禾本科(Gra-
mineae)小麦族(T ri ticeae)披碱草属(E lymus)多年
生疏丛型草本植物 ,又名钩头草 、弯穗草[ 1] ,染色体
组构成为 StS tYYHH(2n=42)[ 2] 。国外主要分布
于俄罗斯 、土耳其 、印度 、蒙古等地 ,我国主要分布于
西北 、西南 、华北地区[ 1] 。垂穗披碱草根茎分蘖能力
强 ,具有极强的抗寒性和抗旱性 ,能适应各种不同类
型的土壤 ,滩地 、沟谷 、阴坡山麓地带到灌丛草甸和
高山草甸均能生长 。开花期前垂穗披碱草质地柔
软 ,无刺毛 、刚毛 ,无异味 ,为马 、牛 、羊喜食牧草 ,整
个生长季节粗蛋白含量变化幅度较小 ,属中上等品
质牧草[ 1-6] ,同时也是最具经济意义的草种[ 7-8] 。简
单序列重复区间(inter-simple sequence repeat , IS-
SR)是 Zie tkiew icz 等[ 9] 于 1994年创建的以重复序
列的单一引物为主要引物序列的 PCR标记 ,它结合
了 SSR和 RAPD的优点 ,主要特点是操作简单 ,遗
传多态性高 ,重复性好 ,耗资少 ,模板 DNA 用量少 。
基于这些优点 , ISS R分子标记已广泛应用于牧草种
质资源鉴定 、牧草遗传多样性与分类进化 、DNA 指
纹图库的建立 、亲缘关系分析 、遗传图谱构建 、分子
标记辅助育种等方面的研究[ 10] 。 ISS R分子标记在
披碱草属植物研究中的应用多见报道[ 11-12] ,而其在
垂穗披碱草研究中应用相对较少 。 ISS R分子标记
反应条件易受模板 DNA 、dN TPs 、Mg2+ 、TaqDNA
聚合酶 、引物等因素的影响 , ISSR扩增结果 ,若以单
因素试验 ,难免忽视其互作效应 ,而正交试验能够分
析各因素之间的内在规律 ,具有均衡分散 、整齐可比
和效应明确的优点 ,能较快地找到最优组合 ,找出影
响扩增的主要因素和次要因素[ 13] 。本研究利用正
交试验设计 ,从模板 DNA 、dN TPs 、Mg2+ 、TaqDNA
聚合酶 、引物 5 个因素 4 个水平 ,对垂穗披碱草
ISSR-PCR反应体系进行优化 ,以期获得垂穗披碱草
的最佳反应体系。
1　材料与方法
1.1 材料　供试的 17份试验材料由中国农业科学
院草原研究所提供(表 1),于 2010 年 5月在温室育
苗 ,待幼苗长到一定高度 ,采集嫩叶 ,置于-80℃保
存备用 。参考马啸[ 11] 和祁娟[ 3] 所用引物序列 ,由上
海生工生物工程有限公司合成(表 2)。PCR所用的
dNTPs 、Mg2+ 、TaqDNA 聚合酶 、10×buf fer(不含
Mg2+)均购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取　采用改良过的 CTAB 法[ 14] 提取
基因组 DNA ,利用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测
DNA 质量 ,利用 UN ICO 公司生产的 UN 4802 型
① 收稿日期:2010-11-11　　接受日期:2010-12-15基金项目:2008年度中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(中国农业科学院草原研究所 , 2008-Z-1);农业部“ 948”牧草种质资源收集与创新利用平台建设(2006-G8(4)-21);国家科技基础条件平台建设项目(2005DKA21007)作者简介:刘新亮(1986-),男 ,山西朔州人 , 在读硕士生 ,研究方向为牧草种质资源。
E-mai l:liuxinliang730@163.com通信作者:赵来喜　E-mai l:zhaolaixi3630@sina.com
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紫外分光光度计检测 DNA 的浓度和 DNA 纯度 ,并
将质量浓度稀释到 30 ng/μL。
表 1　试验所用垂穗披碱草材料
材料
编号 采集地 经度 纬度
海拔
(m)
EN001 四川阿坝州阿坝县查理寺 102°03′ 32°45′ 3 324
EN002 四川甘孜州色达县旭日乡 100°36′ 31°59′ 3 567
EN003 四川甘孜州色达县色尔坝 100°43′ 31°51′ 3 300
EN004 四川甘孜州理塘县 217 线 100°17′ 30°18′ 3 673
EN005 西藏丁青县 95°12′ 32°01′ 4 209
EN006 西藏日喀则 89°10′ 29°17′ 3 713
EN007 甘肃夏河 102°31′ 35°12′ 3 500
EN008 甘肃兰州 103°25′ 36°39′ 3 427
EN009 青海省西宁市西北 30 km 101°22′ 36°40′ 2 707
EN010 四川理塘 100°19′ 29°53′ 3 780
EN011 新疆巩留县 82°46′ 43°25′ 　870
EN012 新疆乌鲁木齐县小渠乡 87°08′ 43°31′ 1 825
EN013 新疆新源县那拉提东 84°20′ 43°11′ 2 263
EN014 新疆巴音布鲁克 84°22′ 42°49′ 2 398
EN015 四川阿坝州鹧鸪山脚 102°31′ 31°52′ 3 655
EN016 四川阿坝州阿坝县跨沙乡 101°34′ 32°49′ 3 140
EN017 四川甘孜州稻城县 100°15′ 28°41′ 3 580
表 2　试验所采用的引物序列
引物 引物序列　 引物　 引物序列　
UBC807 (AG)8T UBC842 (GA)8YG
UBC808 (AG)8C UBC844 (CT)8RC
UBC810 (GA)8T UBC845 (CT)8RG
UBC811 (GA)8G UBC853 (TC)8RT
UBC813 (C T)8T UBC856 (AC)8YA
UBC815 (C T)8G UBC857 (AC)8YG
UBC818 (CA)8G UBC860 (TG)8RA
UBC822 (TC)8A UBC864 (ATG)5
UBC825 (AC)8 T UBC873 (GATA)4
UBC835 (AG)8YC UBC880 (GGAGA)3
UBC836 (AT)8YA Prime r14 (TC)8C
UBC840 (GA)8YT Prime r21 (AG)8CC
UBC841 (GA)8YC
1.2.2 ISS R-PCR 反应体系的正交优化 　以
UBC822 为试验引物 , 引物序列为(TC)8A , 用
EN 001样品 DNA作为模板 ,选用 L16(45)正交表对
Mg 2+ 、Taq DNA 聚合酶 、模板 DNA 、dN TPs 、引物
5个因素各 4 个水平设计 PCR扩增体系的因素-
水平试验(表 3)。
表 3　 ISSR-PCR 体系的因素水平
因素 水平(体系终浓度)
1　 2　 3　 4　
TaqDNA 酶(U) 0.5 1.0 1.5 2.0
Mg 2+(mmol/ L) 1.0 1.5 2.0 2.5
模板 DNA(ng) 30 60 90 120
dNTPs(mmol/ L) 0.15 0.20 0.25 0.30
引物(μmol/ L) 0.15 0.20 0.25 0.30
　注:反应体系总体积为 25 μL 。表 4 同。
　　将表 4的处理重复 2次 ,PCR反应体系总体积
为 25 μL ,除表 4所列变化因素外 ,每个组合中还含
有 10×buffer(不含 Mg2+)2.5 μL ,用 ddH2O 补充
总体积至 25 μL。
表 4　 ISSR-PCR 正交试验数据表
编
号
TaqDNA
聚合酶
(U)
Mg2+
(mmo l/ L)
模板
DNA
(ng)
dNT Ps
(mmol/ L)
引物
(μmo l/ L)
平均扩增
片段
(条)
1 0.5 1.0 30 0.15 0.15 0
2 0.5 1.5 60 0.20 0.20 2.5
3 0.5 2.0 90 0.25 0.25 3.5
4 0.5 2.5 120 0.30 0.30 1.5
5 1.0 1.0 60 0.25 0.30 8.0
6 1.0 1.5 30 0.30 0.25 8.5
7 1.0 2.0 120 0.15 0.20 9.5
8 1.0 2.5 90 0.20 0.15 10.0
9 1.5 1.0 90 0.30 0.20 1.0
10 1.5 1.5 120 0.25 0.15 9.0
11 1.5 2.0 30 0.20 0.30 10.0
12 1.5 2.5 60 0.15 0.25 8.0
13 2.0 1.0 120 0.20 0.25 2.0
14 2.0 1.5 90 0.15 0.30 8.0
15 2.0 2.0 60 0.30 0.15 7.5
16 2.0 2.5 30 0.25 0.20 5.0
1.2.3 PCR扩增　PCR扩增反应是在 DNAEngine
(PTC-200)PCR仪上进行 。PCR反应程序为:94℃
预变性 2 min , 94℃变性 1 min , 51℃退火 1 min ,
72℃延伸 2 m in ,共 40个循环 , 72℃延伸 10 min ,扩
增完后 4℃保存[ 11] ,用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 ,
DL2000为 Marker , 在 Bio-RAP 凝胶成像系统成
像 。
1.2.4 引物退火温度的确定　在试验最佳反应体系
确定的基础上 ,在 DNAEngine(PTC-200)PCR仪上
进行最佳退火温度的筛选 ,从 25条引物中筛选出多
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态性丰富的引物 ,根据理论退火温度对每个引物进
行退火温度的梯度试验 ,设置 8个梯度:47.7 、49.2 、
51.5 、54.4 、57.8 、60.6 、62.8和 64.4℃。
1.2.5循环次数 、延伸时间的确定　利用最佳反应
体系和最适退火温度对循环次数进行梯度试验 ,设
定梯度为:35 、37 、39 、41 、43和 45次 ,每个梯度 2个
重复;利用最佳反应体系 、最适退火温度 、最佳循环
次数对体系延伸时间进行梯度试验 ,设 60 、90 、120 s
3个梯度 ,每个梯度 2个重复 。
1.2.6最佳体系的验证　利用优化出的结果即最佳
反应体系 ,引物的最适退火温度 、最适循环数 、最适
延伸时间对试验材料进行验证 ,以提高优化体系的
稳定性 。
2　结果与分析
2.1 DNA 提取结果　通过紫外分光光度计检
测 ,所提取的 DNA OD 260/OD280的比值为 1.70 ～
1.90 ,说明 DNA纯度比较高 ,进一步通过 0.8%的琼
脂糖电泳检测(图 1),得到清晰 、无降解的条带 ,说明
DNA 完整性较好 ,可用于 ISSR-PCR扩增反应。
图 1　CTAB法提取的垂穗披碱草基因组 DNA
2.2 正交试验的直观分析　垂穗披碱草正交试验
的PCR产物电泳结果如图 2 ,正交试验的结果不尽相
同 ,原因可能是其组合与最佳组合组分相差较大。1 ～
16组合扩增出的条带分别为:0 、0;4 、1;6 、1;1 、2;8 、8;
8 、9;9 、10;10 、10;2 、0;9 、9;10 、10;7 、9;4 、0;8 、8;8 、7;6 、
4。可以看出处理 5 、6、7 、8 、10 、11 、14 、15扩增条带较
多 ,而 6、7 、11 、15主带更为清晰明显 ,因此这 4个处理
在垂穗披碱草中扩增效果最好。
　　在正交试验中 ,常根据电泳带的带数 、亮度以及
背景清晰度给每个处理进行打分 ,然后再进行统计
分析 。此方法主观性比较强 ,打分高低的不同最终
都会影响结果 。为了使结果更为客观 ,本研究对试
验结果进行极差分析 ,参照董如何等[ 15] 的方法 ,先求
出每个因素水平下的条带数的平均值(K i , i=1 ,2 ,3 ,
4)、不同因素不同水平下所有扩增条带的平均数
(Y)、通过 K i 与Y 的差值计算出在同一因素不同水平
下的最大值(Rmax)和最小值(Rmin),二者的差值即为 T
(T=Rmax -Rmin),在变化的水平范围内 ,不同因素间 T
值最大的对应结果造成的影响最大 ,反之 , T 越小 ,与
之对应的那一列的因素试验的结果影响越小。
从表 5均值分析和表 6的极差分析可知 ,各因素
对垂穗披碱草ISS R-PCR反应的影响程度从大到小
图 2　正交试验 PCR 电泳产物(引物 UBC822)
　注:M 为 DNA marker(DL2000), 1 ～ 16 为正交试验 16 个处理 , 每个处理重复 2 次。 A 为重复 1 结果;B 为重复 2 结果。
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表 5　因素水平均值分析
K i j
因素
1 2 3 4 5
Y
K 1 7.500 11.000 23.500 25.500 26.500
K 2 36.000 28.000 26.000 24.500 18.000
K 3 28.000 30.500 22.500 25.500 22.000
K 4 22.500 24.500 22.000 18.500 27.500
K 1 1.875 2.750 5.875 6.375 6.625
K 2 9.000 7.000 6.500 6.125 4.500
K 3 7.000 7.625 5.625 6.375 5.500
K 4 5.625 6.125 5.500 4.625 6.875
5.875
　注:因素 1 ～ 5 分别代表 TaqDNA 聚合酶 、Mg 2+ 、模板
DNA、dNT Ps 、引物;K i 为每个因素同一水平下的条带数之
和;K i 为每个因素同一水平下的条带数的平均值;Y 为在不
同因素不同水平下所有扩增条带的平均数。
依次为:TaqDNA 聚合酶 、Mg2+ 、引物 、dNTPs 、模板
DNA 。
2.3 方差分析　直观分析法比较简单易懂 ,只需
对结果作少量计算 ,就可以得到最佳配合比和因素
影响程度 ,但直观分析法不能正确估计试验过程中
误差的大小 ,不能说明某因素水平所对应的差异究
竟是因素水平引起的还是试验误差引起的 ,但是方
差分析能弥补这个不足 ,本试验用 SAS 8.0对试验
结果进行方差分析。
各因素对垂穗披碱草 ISS R-PCR反应的影响程
度从大到小依次为:TaqDNA 聚合酶 、Mg 2+ 、引物 、
dN TPs 、模板 DNA ,结果与极差分析相同(表 7)。
方差分析的结果表明 ,模板 DNA 浓度 、dN TPs
对结果的影响未达到显著水平;引物浓度对结果的
影响达到了显著水平 ,而 TaqDNA 聚合酶 、Mg 2+对
结果的影响都达到了极显著水平 ,所以有必要对
TaqDN A聚合酶用量 、Mg2+ 、引物浓度进行水平间
的多重比较。
2.4 各因素对 ISSR-PCR扩增的影响
2.4.1 TaqDNA 聚合酶浓度对 ISSR-PCR扩增的影
响　TaqDN A聚合酶浓度在 PCR中的用量受到反
应体积 、酶活性 、酶耐热性等因素的制约 , TaqDNA
聚合酶用量过多会引起非特异性反应 ,在凝胶上出
现较深的背景 ,影响检测结果 ,而且还会增加成本;
表 6　因素水平极差分析
W i j
水平
W1 W2 W3 W4
R T
1 -4.000 3.125 1.125 -0.250 Rmax =3.125　　Rmin =-4.000 T 1 =7.125
2 -3.125 1.125 1.750 0.250 Rmax =1.750　　Rmin =-3.125 T 2 =4.875
3 0.000 0.625 -0.250 -0.375 Rmax =0.625　　Rmin =-0.375 T 3 =1.000
4 0.500 0.250 0.500 -1.250 Rmax =0.500　　Rmin =-1.250 T 4 =1.750
5 0.750 -1.375 -0.375 1.000 Rmax =1.000　　Rmin =-1.375 T 5 =2.375
　注:因素 1 ～ 5 分别代表 TaqDNA聚合酶 、Mg 2+ 、模板 DNA 、dNTPs 、引物;T=Rmax -Rmin ;W i j =K i j -Y(其中 i代表水平 ,
i=1 , 2 , 3 , 4;j代表因素 , j=1 , 2 , 3 , 4 , 5)。
表 7　正交试验方差分析
变异来源 自由度
DF
方差
SS
均方
M S
F 值 P
Taq DNA 酶 3 216.75 72.25 38.03 ＊＊ 0.000 0
Mg2+ 3 113.25 37.75 19.87 ＊＊ 0.000 0
模板 DNA 3 4.75 1.58 0.88 0.496 2
dN TPs 3 17.00 5.67 2.98 0.064 8
引物 3 28.75 9.58 5.04 ＊ 0.013 0
误差 15 28.50 1.90
总计 31 385.00
　注:F0.05(3 , 15)=3.29 , F0.01(3 , 15)=5.42;＊表示在 0.05
水平上差异显著 , ＊＊表示在 0.01 水平上差异显著。
TaqDN A聚合酶浓度过低 ,合成产物的量会减少 ,也
会影响试验结果。极差分析和方差分析发现 ,本试
验条件下 TaqDNA 聚合酶用量对试验结果影响最
大 ,与谢运海等[ 16] 的研究结果相似。当 T aqDNA聚
合酶用量为 1.0 U 时 ,垂穗披碱草扩增效果最好 ,高
于或者低于此用量 ,扩增条带数变少(图 3)。从图 2
可知 ,T aqDNA聚合酶为 1.0 U 时 ,条带最清晰 ,主
带最明显 , 带数更多。经多重比较分析(图 3),
TaqDN A聚合酶酶量为 1.0 U 时 ,与 0.5 、1.5 、2.0
U 3个水平间差异均达到显著水平 。故本试验条件
下 , TaqDNA 聚合酶的最适用量为 1.0 U 。
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图 3　不同 TaqDNA 聚合酶量下 DNA
条带数的均值
　注:柱形图上所标字母代表多重比较的结果 , 不同字母间
差异显著。图 4～ 6 同。
2.4.2 Mg2+浓度对 ISSR-PCR扩增的影响　TaqD-
NA 聚合酶是 Mg 2+依赖性酶 ,对 Mg2+浓度较为敏
感 ,Mg2+浓度除影响酶活性外 ,还影响引物退火 、模
板与 PCR 产物的解链温度 、引物二聚体的形成
等[ 10] ,所以 Mg2+的浓度对 PCR产物的特异性和产
量影响明显。过量的 Mg 2+会导致酶催化非特异性
产物的扩增 ,而 Mg2+浓度过低 ,又使酶的催化活性
降低[ 17] 。Mg2+浓度为 1.0 mmo l/L 时扩增条带数
最少 ,高于此浓度时 ,条带数明显增多 ,浓度为 2.0
mmo l/L 时条带数最多(图 4)。由图 2 可知 , 当
Mg
2+浓度为 1.0 mmol/L 时(1 、5 、9 、13号泳道),只
有 1/4的泳道条带数较明显 、清晰。多重比较表明
(图 4), Mg2+浓度为 1.0 mmol/ L 时 ,DNA条带数显
著低于其他 3个水平 ,而其他 3 个水平间差异不显
著。所以确定的 Mg2+最适浓度为 2.0 mmol/ L。
图 4　Mg2+与条带均值关系
2.4.3引物浓度对 ISSR-PCR扩增的影响　ISS R扩
增条带数与引物浓度密切相关 ,引物浓度过低时 ,
PCR产物量降低 ,引物浓度过高又会促进引物的错
误引导 ,导致非特异性扩增 ,还会增加引物二聚体的
形成[ 18] ,非特异性产物和引物二聚体又可作为 PCR
反应的底物 ,与靶序列竞争 DNA 聚合酶和 dN TPs
底物 ,从而使靶序列的扩增量减少[ 17] 。当引物浓度
为 0.20 μmol/ L时 ,扩增条带数最少 ,低于或高于此
浓度 ,扩增条带数逐渐增加(图 5)。多重分析表明 ,
引物浓度为 0.25 μmol/L 时 ,与其他 3个水平均有
显著差异 ,且相对于其他水平 ,条带也更为清晰(图
2),故确定引物浓度为 0.25μmol/ L。
图 5　引物浓度与条带均值关系
2.4.4 dN TPs 浓度对 ISSR-PCR 扩增的影响 　
dN TPs浓度直接影响 PCR扩增 ,当 dN TPs浓度较
低时 ,产生的条带较少且弱 ,当 dN TPs浓度过低时 ,
其与 TaqDNA 聚合酶竞争 Mg 2+ , 从而降低 Taq
DNA聚合酶活性 ,影响 PCR结果 。dNT Ps在0.15 、
0.20和 0.25 mmol/ L水平上差异不显著 ,三者显著
高于 0.30 mmo l/L(图 6), dNTPs 浓度为 0.25
mmo l/L 时扩增条带最清晰(图 2),主带最明显 ,当
dN TPs 浓度为 0.25 mmol/L 时扩增条带最多 。故
该试验采用的最适 dNTPs 浓度为 0.25 mmol/ L。
图 6　dNTPs浓度与条带均值关系
2.4.5 模板 DNA 浓度对 ISSR-PCR扩增的影响　
模板 DNA是 ISSR扩增的基础 ,主要从纯度和反应
量产生影响 ,模板量过低 ,引物不能有效配对 ,产物
量小 ,模板量过高则过早消耗掉引物 ,使退火发生在
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模板 DNA间或 PCR间 ,反应终止[ 19] 。试验所选的
4个水平的模板 DNA 浓度对 PCR扩增结果影响差
异不显著(图 7),与白锦军等[ 19] 结果不同 ,但与桂腾
琴等[ 20] 的研究结果相似 ,这可能是与模板 DNA 的纯
度有关。本试验选取 30 ～ 120 ng作为最佳模板质量。
图 7　模板 DNA与条带均值关系
2.5 退火温度的确定　退火温度决定着 PCR的
特异性 。引物复性所需的温度和时间取决于引物碱
基组成 、长度 ,降低退火温度能保证模板与引物稳定
结合 ,但也可能导致产生错误扩增 ,一定范围内提高
退火温度可减少引物和模板之间的非特异性结合 ,
提高 PCR反应的特异性 。根据正交试验结果所得
的最佳反应体系 ,即TaqDNA聚合酶1.0U , Mg2+
2.0 mmol/L ,模板 DNA 30 ～ 120 ng , dN TPs 0.25
mmo l/L ,引物 0.25 μmol/L 在 DNA Engine(PTC-
200)PCR仪上进行退火温度梯度试验。由图 8 可
知 ,退火温度较低时(47.7 、49.2℃),扩增条带较弱 ,
较弥散 ,条带不清晰 ,扩增条带特异性差 , 54.4℃时
条带最清晰 ,条带数最多 ,主带最明显 ,随着退火温
度的升高扩增的条带数减少 ,到 60.6℃几乎没有条
带 ,由此确定引物 UBC822 的最适退火温度为
54.4℃。通过对筛选出的 11条扩增稳定 、多态性较
好的引物进行了退火温度梯度试验 ,并确定了各引
物的最佳退火温度(表 8)。
表 8　试验所选引物序列和退火温度
引物 引物序列　 最佳退火温度(℃)
UBC818 (CA)8G 54.4
UBC822 (TC)8A 55.0
UBC825 (AC)8T 54.4
UBC840 (GA)8YT 57.8
UBC841 (GA)8YC 51.5
UBC844 (CT)8RC 54.4
UBC845 (CT)8RG 54.4
UBC853 (TC)8RT 54.4
UBC857 (AC)8YG 57.8
UBC873 (GATA)4 46.5
Primer14 (TC)8C 51.5
图 8　温度梯度 PCR电泳图
　注:引物为 UBC822;M 为 DNA marker(DL2000);1 ～ 8 为8 个温度梯度 , 分别为 47.7、49.2 、51.5、54.4、57.8 、60.6、62.8 和
64.4℃, 每梯度重复 2 次。
2.6 最佳循环数和最适延伸时间的确定　根
据正交试验结果所得的最佳反应体系 ,在最适退火
温度下 ,对 PCR循环数进行梯度试验 ,设置 6个梯
度。循环数较少时(35 次)条带不清晰 ,扩增不稳
定 ,37次时扩增条带逐渐变清晰 ,但其主带不明显 ,
循环数为 41次时扩增效果最好 ,循环数大于 41次
时 ,扩增结果也不理想(图 9)。因此 ,41次作为引物
UBC822的最佳循环次数。
图 9　最佳循环数的选择
　注:引物为 UBC822;M 为 DNA marker(DL2000);1～ 6 为6
个循环梯度 ,分别为 35、37、39、41 、43 、45 次, 每梯度重复 2 次。
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PRATACULTURAL SCIENCE(Vol.28 , No.05) 05/ 2011
　　延伸时间的长短取决于待扩增模板序列的长度
和浓度 ,以及延伸温度的高低 ,在条件一定的情况
下 ,延伸时间过短无法完成扩增导致扩增产量低 ,延
伸时间太长会引起非特异性条带的产生[ 17] 。利用
最佳反应体系 、最适退火温度和最佳循环数 , 对
PCR延伸时间进行梯度试验 ,设置 3个梯度。延伸
时间为 60 s时扩增条带弥散 ,延伸时间为120 s时主
带不明显也带有一定的弥散现象 ,延伸时间为 90 s时
扩增效果最好(图10),故确定最适延伸时间为 90 s。
2.7 最佳反应体系的验证　运用正交设计所获
得的最佳反应体系和程序随机选用引物 UBC825对
17份不同的野生垂穗披碱草进行 ISS R扩增 ,结果
显示 ,扩增条带清晰 ,稳定性好 、多态性丰富(图11),
表明该反应体系和反应程序稳定性 、重复性较好 ,适
合于垂穗披碱草进行 ISS R-PCR反应。
图 10　最适延伸时间的选择
　注:引物为 UBC822;M 为 DNA marker (DL2000);1 ～ 3
为3 个延伸时间梯度 , 分别为 60 、90 、120 s , 每梯度重复2 次。
图 11　最佳反应体系的验证
　注:引物为 UBC825;M 为 DNA marker(DL 2000);1 ～ 17 为 17 份不同的野生垂穗披碱草。
3　结论
本研究利用正交优化设计建立了垂穗披碱草的
ISS R-PCR反应体系 ,试验过程中对影响 PCR扩增
的 TaqDNA 聚合酶 、Mg2+ 、模板 DNA 、dN TPs 、引
物等因素进行了正交优化 ,对 PCR程序进行了梯度
试验 ,通过对扩增结果的量化分析得到了稳定性好
的反应体系和扩增程序 , 即:TaqDNA 聚合酶 1.0
U , Mg 2+ 2.0 mmol/L , 模板 DNA 30 ～ 120 ng ,
dN TPs 0.25 mmo l/L ,引物 0.25 μmol/L;PCR扩增
程序为:94℃预变性 2 min , 94℃变性 1 m in , 51℃退
火 1 min(视不同引物而定), 72℃延伸 1.5 min ,共
41个循环 ,72℃后延伸 10 m in ,扩增完后 4℃保存 。
正交设计相对于其他设计方法节省了人力和财
力 ,对结果的分析更均衡更完善 ,但对扩增效果的评
价方面带有一定的主观性 ,不能很好地评估各因素
之间的交互作用 ,还需更客观的评价标准 。此外 ,在
正交优化中所设置的浓度梯度较大 ,可采用与单因
素试验或细调性正交试验[ 2 1] 相结合的方法进一步
确定最优体系 。尽管如此 ,本研究所建立的较为稳
定的 ISSR-PCR反应体系 ,可以为垂穗披碱草的研
究提供科学的理论基础 ,同时为披碱草属内其他种
在品种鉴定 、遗传多样性研究 、亲缘关系分析等领域
提供一定的依据。
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Optimization of the ISSR reaction system of Elymus nutans
by orthogonal design
LIU Xin-liang1 , 2 , DE Ying 1 , ZHAO Lai-xi1
(1.Grassland Research Institute , Chinese Academy of Ag ricultura l Science ,
Inne r Mongolia H ohho t 010010 , China;
2.Gradua te Schoo l , Chinese Academy of Ag ricultural Science , Beijing 100081 , China)
Abstract:Five facto rs(DNA polymerase , Mg2+ , template DNA , dNT Ps , primer)in ISSR-PCR reaction
sy stem w ere carried on the optimized experiment by taking the genomic DNA of E lymus nutans as tem-
plate.The optimum reaction sy stem and reaction process of E.nutans ISSR-PCR analy sis w ere estab-
li shed.The results of this study show ed that the volume of reaction system w as 25μL.It included 2.5μL
10×buffer (except Mg 2+), 1.0 U TapDNA po lymerase , 2.0 mmol/ L Mg 2+ , 30-120 ng template DNA ,
0.25 mmol/ L dN TP and 0.25 μmo l/L primer.Eleven primers w ith stable amplif icat ion and rich po lymo r-
phism w ere obatined based on the optimal PCR reaction sy stem .The reaction prog ram was devised for 2
min at 94℃in the fi rst circle , 1 min at 94℃, 51℃ for 1 min(depended on dif fe rent primer), 72℃ for 1.5
min for 41 cycles , and 72℃ fo r 10 min for e xtending ,which w as obatined across the g radient PCR experi-
ments , including temperature g radient , cycle g radient and ex tending time gradient experiments.Validation
of the optim ist ic ISSR-PCR react ion sy stem and amplification prog ram show ed that the reaction sy stem and
amplif ication program had high stability and good reproducibility.
Key words:E lymus nutans;ISSR-PCR;orthogonal-design
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