全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Sept．２０１４,３４(５):５７５－５８１　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０５．００１
王群,李同建,韩兴杰,等．基于低拷贝核基因GBBSI的禺毛茛复合体系统进化研究[J]．广西植物,２０１４,３４(５):５７５－５８１
WangQ,LiTJ,HanXJ,etal．PhylogeneticanalysisofRanunculuscantoniensiscomplexbasedonlowＧcopynucleargeneGBBSI[J]．Guihaia,２０１４,
３４(５):５７５－５８１
基于低拷贝核基因GBBSI的禺毛茛
复合体系统进化研究
王　群,李同建,韩兴杰,廖　亮,徐玲玲∗
(九江学院 药学与生命科学学院,江西 九江３３２０００)
摘　要:禺毛茛多倍体复合体及其近缘种系统进化关系复杂,杂交与多倍化现象同时存在.该复合体内高倍
性植物的形成及扩散过程仍需进一步研究.首次克隆了毛茛属植物低拷贝核基因颗粒结合型淀粉合成酶I
(GBBSI)基因,并利用其构建禺毛茛多倍体复合体及其近缘种的系统进化树和网状进化关系,进而证明其适
合于研究毛茛属植物种下系统发育研究.结果表明:匍枝毛茛与多倍体复合体关系密切,参与了该多倍体复
合体的起源和进化;禺毛茛起源于茴茴蒜和卷喙毛茛,扬子毛茛起源于茴茴蒜和匍枝毛茛;在该类群中茴茴蒜
是个关键种,它在多倍体复合体中可能起着枢纽基因组的重要作用.
关键词:禺毛茛;多倍体复合体;系统进化;GBBSI;枢纽基因组
中图分类号:Q９４９．７４６　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０５Ｇ０５７５Ｇ０７
PhylogeneticanalysisofRanunculuscantoniensis
complexbasedonlowＧcopynucleargeneGBBSI
WANG Qun,LITongＧJian,HANXingＧJie,LIAOLiang,XULingＧLing∗
(SchoolofPharmacyandLifeSciences,JiujiangUniversity,Jiujiang３３２００,China)
Abstract:EvolutionaryrelationshipofRanunculuscantoniensispolyploidcomplexanditsaliedspecieswascomplicatＧ
ed,andhybridizationandpolyploidizationoccurredsimultaneouslyinthiscomplex．Itwasnecessarytoexplorethe
speciationanddispersalprocessesofhighＧploidtaxa．FirstclonedpartialsequenceofGBBSIgene,thenphylogenetic
treeandnetworkwereconstructedusingtheintronsofGBBSIgene,andprovedthattheintronsofGBBSIgenewere
suitedtostudyphylogeneticrelationshipofRanunculus．TheresultsshowedthatR．repenscloselyassociatedwith
polyploidcomplex,participatingintheoriginandevolutionofpolyploidcomplex;R．cantoniensisoriginatedfromhyＧ
bridizationofR．chinensisandR．silerifoliusvar．silerfolius,R．sieboldi originatedfromhybridizationofR．
chinensisandR．repens,R．repensmightoriginatedfromhybridizationofR．chinensisandR．silerifoliusvar．dolＧ
icathus;R．chinensiswasakeyspeciesinthiscomplex,whichmayplayanimportantroleasapivotalgenome．
Keywords:Ranunculuscantoniensis;polyploidcomplex;phylogeny;GBBSI;pivotalgenome
　　禺毛茛(Ranunculuscantoniensis,４x)及其近缘
种作为一个多倍体复合体由 Tamura(１９７８)提出,
由Okada(１９８４,１９８９)通过人工合成四倍体杂种的
方法推测禺毛茛由茴茴蒜(R．chinensis,２x)和卷喙
毛茛(R．silerifoliusvar．silerifolius,２x)杂交而
成.廖亮等(１９９５)通过孢粉学、同工酶、细胞学和分
收稿日期:２０１３Ｇ１０Ｇ２７　　修回日期:２０１３Ｇ１２Ｇ１０
基金项目:国家自然科学基金(３１２６００４４,３１４６００４６);江西省自然科学基金(２００９GZN００８０).
作者简介:王群(１９９０Ｇ),男,江西高安人,主要研究方向为植物分子系统学,(EＧmail)１５２７０２６５０５４＠１６３．com.
∗通讯作者:徐玲玲,教授,研究方向为植物分子生物学,(EＧmail)１３９０７０２１７１０＠１６３．com.
子系统学的方法证明这禺毛茛可能由茴茴蒜和卷喙
毛茛和棱喙毛茛(R．trigonus,２x)通过两次杂交形
成,褐鞘毛茛(R．vaginatus,５x)可能由扬子毛茛
(R．sieboldii,６x和８x)和铺散毛茛(R．diffusus,
４x)杂交形成,并重新定义了禺毛茛多倍体复合体,
认为该复合体及其近缘种包括了禺毛茛、茴茴蒜、巻
喙毛茛、棱喙毛茛、长花毛茛(R．silerifoliusvar．
dolicathus,２x)、扬子毛茛、褐鞘毛茛、铺散毛茛;同
时还指出禺毛茛复合体及其近缘种的进化关系复
杂,同时存在多倍化与杂交现象形成复杂的网状结
构(廖亮等,１９９５,１９９６,２００８;Xuetal．,２０１３).虽
然以上研究使得该复合体及其近缘种的系统发育关
系逐渐清晰,但高倍性类群如何形成和复合体的形
成及扩散过程等仍然未知.
杂交和异源多倍化类群中保存着来自双亲的等
位基因,可以通过双亲遗传的等位基因追溯以上类
群的形成及进化过程(刘志鹏等,２００７).在研究植
物的系统演化时,使用较多的DNA片段为cpDNA
序列和nrDNA序列.但cpDNA在大多数植物中
是母性遗传,只能提供母系进化背景(Corriveauet
al．,１９８８).在nrDNA中以转录间隔区ITS序列应
用最为广泛,该基因进化速率较快能够应用于属下
甚至个体间的系统发育研究(Yangetal．,２００７).
但由于该基因存在一致性进化现象,无法完全展现
杂种个体的双亲遗传特征,使得该基因在研究杂交
和异源多倍化类群的系统发育时受到限制(Zheng
etal．,２００８).低或单拷贝核基因较少受到重组影
响,可较长时间保存双亲的等位基因,并且其内含子
区域进化速率较快,具有丰富的系统发育信息,是研
究杂交和异源多倍化类群系统发育关系的良好工具
(Ohetal．,２００３;刘志鹏等,２００７).颗粒结合型淀
粉合成酶I基因(GranuleＧboundstarchsynthaseI,
GBBSI)是常用的低拷贝核基因,GBBSI基因外显
子和内含子的进化速率不一致,内含子为非编码序
列,受到的选择压力较小,更容易积累变异,其在蔷
薇科和茄科植物系统发育中得到广泛使用(张兴伟
等,２００８;Peraltaetal．,２００１).鉴于低拷贝核基因
在杂交和异源多倍化类群系统进化研究中的优势,
本研究利用低拷贝基因序列设计兼并引物,开发适
用于禺毛茛多倍体及其近缘种的低拷贝核基因标
记,以便对该复合体进行系统发育分析,更深入地探
讨该复合体及近缘种的系统发育关系,了解多倍体
类群的形成及进化过程.
１　材料与方法
１．１材料
实验材料采集地和凭证标本号见表１,凭证标本
保存于九江学院药学与生命科学学院标本室(JJTU).
１．２方法
１．２．１DNA提取　采用改良的CTAB法(Lodhiet
al．,１９９４)提取实验材料的基因组DNA.
１．２．２GBBSI基因扩增　根据GBBSI序列,在保
守区设计简并引物扩增禺毛茛GBBSI基因,获取
一段初始序列.运用高效快速的FPNIＧPCR(FuＧ
sionprimerandnestedintegratedPCR)法扩增以
获取该序列的侧翼序列(Wangetal．,２０１１).
１．２．３内含子序列扩增　从已克隆到的GBBSI基
因中选取部分内含子序列,在其两端的外显子序列
上设计一对引物,用于扩增其它种中相对应的内含
子.该引物序列为 GBBSIＧF:５′ＧTCTTCCAATＧ
TCTGCTTGTCGGＧ３′,GBBSIＧR:５′ＧCTAAGGＧ
TAGCAAGGGAGAACAACAGＧ３′.在PCR管中
建立１０μL反应体系,并依次加入下列组分:１０×
PCRBuffer１μL,２５mmol􀅰LＧ１MgCl２０．６μL,１０
mmol􀅰LＧ１dNTPs０．１μL,０．５UTaqDNA聚合
酶,基因组DNA约２０ng,１０μmol􀅰LＧ１正反向引物
各０．２μL,灭菌双蒸水补齐体积.PCR反应程序为
９４℃５min;９４℃３０s,６０℃３０s,７２℃１min,３５
个循环;７２℃延伸７min.PCR产物用１％的琼脂
糖凝胶电泳进行检测.
１．２．４PCR产物回收、克隆及测序　PCR的产物经
１．５％的琼脂糖凝胶电泳后,在紫外成像分析系统中
完成切胶.使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒
(上海Sangon生物工程公司)回收.将回收的片段
连接到pMD１８ＧT载体(大连 TaKaRa生物公司)
上.连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞,经过
Amp抗性筛选和菌落PCR筛选后,每个类群至少
选取２０个阳性克隆送Sangon公司测序.
１．２．５数据处理及系统发育分析策略　测序数据载
入 Geneious４．８ 软 件 (Http://www．geneious．
com),去除引物和载体序列后,采用 ClustalW
(Thompsonetal．,１９９４)进行序列比对.比对结果
用 MEGA５．１(Tamuraetal．,２０１１)计算其核苷酸
变异位点及简约信息位点的个数.选用贝叶斯法
(Bayesianinference,BI)构建系统树(Huelsenbeck
６７５ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
etal．,２００１).使用 MrModeltest２．２检验２４种核
苷酸替代模型对GBBSI数据集的拟合度,评判出
GBBSI基因进化的最优模型为 HKY＋I＋G.MrＧ
Bayes软件批处理方式“beginmrbayes;”开始,中间
行以“;”结尾,以“end;”结束.运用 SplitsTree
(Kloepperetal．,２００８)进行 Network分析.将数
据导入软件后采用 MedianＧJoining(MJ)方法(BanＧ
deltetal．,１９９９).该方法将在检测序列的所有位
点后,赋予这些位“０”或“１”两种状态,并转化为由二
态特性组成的矩阵,进而构建出禺毛茛多倍体复合
体及其近缘种的无根中间连接网(medianＧJoining
network).
表１　实验材料
Table１　Theoriginofmaterials
分类群 Taxon
采集地
Origin
标本凭证
Voucher
克隆
Clone
登录号
GenBankaccession
茴香蒜
Ranunculuschinensis(２x)
云南普洱
Puer,Yunnan
L．Liao１０５０９１０ HＧ１,HＧ１０至 HＧ１６
HＧ２至 HＧ９
KF２４０８８６至KF２４０８９３
KF２４０８９４至KF２４０９０１
卷喙毛茛
R．silerifoliusvar．silerifolius(２x)
云南普洱
Puer,Yunnan
L．Liao１０５１０７４ JＧ１,JＧ１０至JＧ１６
JＧ２至JＧ９
KF２４０９２２至KF２４０９２９
KF２４０９３０至KF２４０９３７
长花毛茛
R．silerifoliusvar．dolicathus(２x)
云南普洱
Puer,Yunnan
L．Liao１０５１０１３ CＧ１,CＧ１０至CＧ１５
CＧ２至CＧ９
KF２４０８７１至KF２４０８７７
KF２４０８７８至KF２４０８８５
棱喙毛茛
R．trigonus(２x)
云南普洱
Puer,Yunnan
L．Liao１０５１０４７ LＧ１,LＧ１０至LＧ１６
LＧ２至LＧ９
KF２４０９３８至KF２４０９４５
KF２４０９４６至KF２４０９５３
禺毛茛
R．cantoniensis(４x)
江西九江
Jiujiang,Jiangxi
L．Liao１２１０１３１ YＧ１,YＧ１０至YＧ１７
YＧ２至YＧ９
KF２４０９８３至KF２４０９９１
KF２４０９９２至KF２４０９９９
铺散毛茛
R．diffusus(４x)
云南昆明
Kunming,Yunnan
L．Liao０５０５１４ PSＧ１,PSＧ１０至PSＧ１４
PSＧ２至PSＧ９
KF２４０９５４至KF２４０９５９
KF２４０９６０至KF２４０９６７
匍枝毛茛
R．repens(４x)
云南丽江
Lijiang,Yunnan
L．Liao１０７２５１４ PZＧ１,PZＧ１０至PZＧ１５
PZＧ２至PZＧ９
KF２４０９６８至KF２４０９７４
KF２４０９７５至KF２４０９８２
褐鞘毛茛
R．vaginatus(５x)
贵州六盘水
Liupanshui,
Guizhou
L．Liao０５０５１８ HQＧ１,HQＧ１０至 HQＧ１９
HQＧ２,HQＧ２０
HQＧ３至 HQＧ９
KF２４０９０２至KF２４０９１２
KF２４０９１３至KF２４０９１４
KF２４０９１５至KF２４０９２１
扬子毛茛
R．sieboldii(６x)
贵州六盘水
Liupanshui,
Guizhou
L．Liao０５０５１６ YZＧ１,YZＧ１０至YZＧ１９
YZＧ２,YZＧ２０至YZＧ２３
YZＧ３至YZＧ９
KF２４１０００至KF２４１０１０
KF２４１０１１至KF２４１０１５
KF２４１０１６至KF２４１０２２
２　结果与分析
２．１禺毛茛GBBSI序列
在保守区设计的简并引物扩增得到一条２９９
bp的片段.利用FPNIＧPCR步移法获取了此序列
上游９１８bp和下游１３７９bp两段序列.拼接后序
列长度为２４６５bp.经BLAST检索序列数据库比
对表明,它与红荚蒾(Viburnumerubescens)GBBSI
基因核苷酸序列的相似性为７２．７％,与美国梧桐
(Platanusoccidentalis)GBBSI基因核苷酸序列的
相似性为７１．０％.
２．２GBBSI部分内含子序列
共克隆了禺毛茛复合体及其近缘种９个类群的
１５２条序列.种间的内含子长度差异较小,除了棱
喙毛茛和扬子毛茛的少数序列为４８７bp以外,其余
序列长度均在５０１~５０６bp之间,比对后的长度为
５１２bp.种间的内含子核苷酸突变较大,５１２bp中
有１２７个核苷酸变异位点,其中７０个为简约信息
位点.
２．３系统发育分析
基于GBBSI基因内含子序列构建的系统发生
树显示,所有序列主要分为９个聚类簇(图１).长
花毛茛、铺散毛茛、扬子毛茛和匍枝毛茛构成聚类簇
Ⅰ,其中扬子毛茛和匍枝毛茛聚为一支,长花毛茛和
铺散毛茛聚为一支;聚类簇Ⅱ由褐鞘毛茛、铺散毛茛
和卷喙毛茛组成;聚类簇Ⅳ由扬子毛茛、棱喙毛茛、
铺散毛茛和褐鞘毛茛构成;匍枝毛茛、扬子毛茛和
禺毛茛构成聚类Ⅶ;聚类簇Ⅷ中包括铺散毛茛、褐
鞘毛茛、茴茴蒜、禺毛茛、扬子毛茛和匍枝毛茛等６
个类群;聚类簇Ⅲ和Ⅵ均只有长花毛茛;聚类簇Ⅴ、
Ⅸ分别由棱喙毛茛和卷喙毛茛的拷贝单独构成.
２．４网状进化关系
复合体及其近缘种的网状进化图(图２)与BI
树一致性较高.１５２条内含子序列共有９９个基因
型.这个网状结构主要由１１个分支组成.来自茴
茴蒜、禺毛茛、扬子毛茛和匍枝毛茛的１５个序列基
因型完全一致,并聚于分支１,来自铺散毛茛和褐鞘
毛茛的序列与以上基因型同源性较高,也聚于分支
１;部分来自卷喙毛茛和禺毛茛的序列聚于分支２,
７７５５期　　　　　　　 王群等:基于低拷贝核基因GBBSI的禺毛茛复合体系统进化研究
图１　禺毛茛多倍体复合体及其近缘种的BI系统树　C．长花毛茛;H．茴茴蒜;J．巻喙毛茛;L．棱喙毛茛;Y．禺毛茛;HQ．褐鞘
毛茛;PS．铺散毛茛;PZ．匍枝毛茛;YZ．扬子毛茛.下同.
Fig．１　PhylogenetictreeusingbayesianinferencefromRanunculuscantonensispolyploidcomplexanditsaliedspecies　C．R．
silerifoliusvar．dolicathus;H．R．chinensis;J．R．silerifoliusvar．silerifolius;L．R．trigonus;Y．R．cantoniensis;HQ．R．vaginatus;PS．R．
diffuses;PZ．R．repens;YZ．R．sieboldi．Thesamebelow．
８７５ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
图２　禺毛茛多倍体复合体及其近缘种的网状关系
Fig．２　NetworkrelationshipfromRanunculuscantonensispolyploidcomplexanditsaliedspecies
而来自卷喙毛茛的另一部分序列形成分支１０;分支
３和分支５均仅包括来自匍枝毛茛和扬子毛茛的序
列,其中,在分支３中匍枝毛茛的１个序列和扬子毛
茛的２个序列完全相同,在分支５中匍枝毛茛的３
个序列和扬子毛茛的４个序列完全相同;部分来自
棱喙毛茛的序列与１个来自禺毛茛的序列聚于分支
４,另有部分来自棱喙毛茛的序列聚在分支８;长花
毛茛聚集在分支６和分支１１;在分支８上,来自铺
散毛茛和褐鞘毛茛的５个序列完全相同,剩余的序
列与扬子毛茛相似;褐鞘毛茛的４个序列与铺散毛
９７５５期　　　　　　　 王群等:基于低拷贝核基因GBBSI的禺毛茛复合体系统进化研究
茛的１个序列相似,构成分支９.
３　讨论与结论
贝叶斯法不仅保留了最大似然法的基本原理,
而且引进了马尔科夫链的蒙特卡洛法,能在较短时
间内处理大型的数据集和复杂模型,提高分辨率(陈
士超等,２００７).然而,系统进化树只能表示分歧进
化的物种形成模式,无法表示杂交物种形成模式.
所以,利用系统树很难研究杂交和异源多倍化类群
的系统发育,而网状进化结构能更好地替代简单的
分支过程(Makarenkovetal．,２００４).相比BI树而
言,网状结构能表示基因的横向转移,在分析整个系
统时分辨率更高.因此,本研究结合两者的优点对
该复合体及其近缘种的系统发育进行讨论.
３．１GBBSI基因的变异特点
在多数植物类群研究中,单拷贝或低拷贝核基
因能提供更多的信息位点,具有更强的优势(Sang
etal．,２００２).本研究选取了GBBSI基因内含子序
列,５１２bp中有７０个为简约信息位点,进化速率为
１３．７％,进化速度适中,适合于研究毛茛属种下系统
进化关系,因而该基因可以用来重建禺毛茛多倍体
及其近缘种的系统发育.
３．２匍枝毛茛与复合体亲缘关系较近
匍枝毛茛为多年生草本植物,簇生有多数粗长
须根,茎下部匍匐于地面,在节处生有根并且分枝,
叶为三出复叶,宽卵圆形叶片.扬子毛茛为多年生
草本植物,须根簇生,茎铺散,节下部偃地生根,在节
处多分枝,叶为三出复叶,圆肾形至宽卵形叶片(王
文采等,１９８０).这两个物种在形态上有较多的相似
之处,暗示它们可能有较近的亲缘关系.本研究发
现部分匍枝毛茛和扬子毛茛的GBSSI克隆序列完
全相同(图２分支１,分支３和分支５),表明匍枝毛
茛和扬子毛茛亲缘关系非常近.前期研究认为该复
合体由８个物种构成,匍枝毛茛并未加入该复合体
(Xuetal．,２０１３).以上结果显示匍枝毛茛与该复
合体关系密切,可能参与了该复合体的起源与进化.
３．３复合体中多倍体的起源
种间杂交和基因组复制在植物进化过程导致两
个亲本的核基因位点整合到后代基因组中,进而表
现为个体中存在两个不同的等位基因(Ekrtetal．,
２０１０).部分扬子毛茛的GBSSI 克隆与茴茴蒜有
相同的基因型(图２分支１),而另外一部分扬子毛
茛的GBSSI 克隆与匍枝毛茛的序列相同或相似
(图２分支１,分支３和分支５),说明扬子毛茛中存
在两个不同的等位基因,分别与匍枝毛茛和茴茴蒜
有较近的亲缘关系.扬子毛茛(６x)很可能由茴茴
蒜(２x)和匍枝毛茛(４x)杂交并加倍形成.在染色
体组方面匍枝毛茛的贡献比茴茴蒜大,Osborn
(２００３)认为在异源多倍体中基因表达的机制之一是
基因的剂量效应,印证了扬子毛茛在形态学上与匍
枝毛茛更为相似,而并非茴茴蒜.
禺毛茛有四种核型,这种种内核型多型性是由
于卷喙毛茛核型多型性所致(廖亮等,１９９５).禺毛
茛的一部分基因型和茴茴蒜的基因型聚在一支(图
２分支１),禺毛茛的另外一部分基因型和卷喙毛茛
的基因型聚在一支(图２分支２),而仅有１个基因
型与多个棱喙毛茛的基因型聚在一支(图２分支
４),表明茴茴蒜、卷喙毛茛和棱喙毛茛三个二倍体参
与了禺毛茛四倍体复合体的形成,实验结果与ITS
序列分析和荧光原位杂交(Xuetal．,２０１３)的研究
结果一致,即证实了禺毛茛的亲本是茴茴蒜、卷喙毛
茛和棱喙毛茛.
多倍体铺散毛茛和褐鞘毛茛中均有二倍体卷喙
毛茛,棱喙毛茛和茴茴蒜的基因拷贝(图１聚类簇
II,聚类簇Ⅳ和聚类簇Ⅷ).一方面说明铺散毛茛与
褐鞘毛茛的亲缘关系较近;另一方面说明二倍体的
这类基因拷贝作为直系同源拷贝遗传给后来形成的
物种,并对物种的进化有重要贡献(Sonnhammeret
al．,２００２).
３．４茴茴蒜在多倍体进化中的作用
复合体及其近缘种中的多倍体均有茴茴蒜的基
因组.Stebbines(１９７１)提出,一些二倍体植物能提
供共同的基因组与其它物种基因组杂交组合形成多
倍体植物,这个基因组称为枢纽基因组.Zohary
(１９６２)指出,多个多倍体共享一个相同的基因组,最
有可能起源于相同的二倍体物种.在该复合体中,
茴茴蒜直接参与了禺毛茛和扬子毛茛的形成,还可
能参与了铺散毛茛和褐鞘毛茛的形成,因此茴茴蒜
是该复合体起源和进化的关键种,起着枢纽基因组
的重要作用.
低拷贝核基因GBBSI在重建禺毛茛多倍体复
合体及其近缘种的系统发育时,分辨率比较高,该基
因在异源多倍体中同时含有双亲的遗传信息,能够
利用该基因推断多倍体的起源和多倍体复合体网状
进化关系,适合于多倍体复合体的系统进化研究.
０８５ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
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