全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Jun．2015，35(3)：401—407 http：／／journa1．gxzw．gxib．cn
DOI：10．11931／guihaia． zw2013O9OO3
李立芹，王西瑶．马铃薯 WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式[J2．广西植物，2015，35(3)：401—407
Li LQ。Wang XY．Cloning and expression patern research under abiotic stress of the WRKY2 in potato[J]．Guihaia，2015·35(3)：401 407
马铃薯WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式
李立芹，王西瑶
(四川农业大学 农学院，成都 61113O)
摘 要 ：马铃薯 WRKY2基因的功能尚未见有报道 ，WRKY蛋 白是近年来发现的一类重要转录因子家族 ，它
们在植物应对生物胁迫 、非生物胁迫和生长发育过程 中起到关键 的调控作用。该研究采用 电子克隆法获得马
铃薯 WRKY2基因，该基因的编码区长度 1 065 bp。编码 355氨基酸 ，序列分析表明，该蛋白属于 WRKY家族
第二组成员 ，锌指结构为 C X 一C—X H—X—H。构建系统发育树结果表明它与番茄 WRKY7亲缘关系较近 ，氨
基酸序列相似性达 96％，与烟草中 WRKY蛋白的相似性为 86％，利用原核表达法在大肠杆菌中获得该蛋 白。
通过凝胶阻滞实验证明，该蛋 白在体外能结合 W—box元件，而且 这种结合 能被冷探针所竞争，同时也表明
StWRKY2不能结合含有突变 W—box DNA片段 ，证 明 StWRKY2与 W—box结合具有特异性。通过实时荧光
定量 PCR技术分析该基因在根 、茎和叶中的表达量，结果表明该基因主要在根中表达，其次是叶和茎。为进
一 步研究该基因可能参与的生理功能，对马铃薯组培苗进行 10 umol／L低磷、10／~mol／L低钾、200 mmol／L
NaC1、400 mrnol／L PEG溶液和 4℃低温处理，处理时问 6 h，实时荧光定量 PCR的结果表明该基因在低磷处
理后表达量明显下降，在 200 mmol／L NaC1和 400 mmol／L PEG处理 6 h后表达量明显升高，但在 10 umol／I
低钾和 4℃低温处理后表达量与对照相比无明显变化 。说明 StWRKY2能响应低磷 、NaC1和 PEG这三种非
生物逆境胁迫。研究结果可为进一步深入研究马铃薯 WRKY2基因的功能奠定基础 。
关键词：马铃薯；WRKY；系统发育 ；EMSA；表达模式
中图分类号：Q943．2；Q812 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2015)03—0401—07
Cloning and expression pattern research under
abiotic stress of the
LI Li_Qin，WANG Xi-Yao
(Colege ofAgronomy，Sichuan Agricultural University，Chegndu 611130，China)
Abstract：Function of StWRKY2 has not been reported．Plant W RKY proteins are found as an important class of
transcription factors in recent years，which are widely involved in biotic stress，abiotic stress and growth development
regulation，and they are mainly divided into three groups．WRKY2 was cloned from potato by homology cloning，
with length of the coding region 1 065 bp，encoding 355 amino acids by DNA sequencing．W ith the amino acid se—
quenee of StWRKY2 blasting in NCBI，19 homology amino acid sequences were selected tO analysis conservative do—
main．Amino acid analysis showed that the StW RKY2 contained 1 conserved WRKY domain (TTGACC)and be—
longed to the second group of W RKY family members，and its zinc-finger structure was C—X5一C_ 3H—x_H．Phylog—
eny tree results showed StWRKY2 was the most closest to S1W RKY7 (Solanum lycopersicum ) with 96
similarity，and the similarity of a W RKY protein of tobacco was 86 ．The protein-GST (glutathione~S-transferase)
complex was obtained in Escherichia coli by using the method of prokaryotic expression．StW RKY2一GST could corn一
收稿日期：
基 金项 目：
作者简介：
通讯作者 ：
2014-02—26 修 回 日期 ：2014—05—12
国家 自然科学基金(31070244)
李立芹(1974一)，女 ，山东东阿县人 ，博士，副教授，从事马铃薯分子生物学研究，(E-mail)liliqin88@163．tom。
王西瑶，博士，教授 ，从事马铃薯贮藏和分子生物学研究，(E—mail)wxyrtl@1 63．com
402 广 西 植 物 35卷
bine W—box in vivo by E1ectrophoretic Mobility Shift Assay analysis，but only GST protein could not combine W -
box．StWRKY2一GST combination with W-box could be competed by cold probe(unlabeled probe)．And the experi—
ment results also showed that StWRKY2一GST could not combine mutation W —box，this suggested StW RKY2一GST
combined W box with specificity．Analysis of StWRKY2 expression level in the root，stem and leaf tissue through
the real—time fluorescence quantitative PCR，the results showed that the gene was mainly expressed in the root．Next
was leaf and stem．In order to further study the possible function of the gene，potato seeding from tissue culture were
treated under 10 fmol／I low phosphorus，10／xmol／L lOW potassium，200 mmol／I NaC1，400 mmol／L PEG solution
and 4℃ low-temperature treatment for 6 h。real time fluorescence quantitative PCR showed that this gene expression
level decreased significantly after low phosphorus treatment，expression of StWRKY2 increased significantly after
200 mmol／I NaC1 and 400 mmol／I treatment．Expression level of StWRKY2 had no obvious change after low po—
tassium and 4℃ low temperature treatment．The results indicated that StWRKY2 could in response to low phos—
phorus，NaC1 and PEG three kinds of abiotie stresses．These results would lay a solid foundation for further study of
potato WRKY2 gene function．
Key words：potato；WRKY；phylogeny；EMSA；expression pattern
WRKY转录因子最初是从甘薯 中发现 的一类
蛋白，当时命名为 SPF1(Ishiguro ￡a1．，1994)。这
类蛋 白的特 点是在其 N端 含有 60个 高度保守 的
WRKY结 构 域 ，其 中包 括一 个 十 分保 守 的七 肽
WRKYGQK，该结构域中还含有一类类似锌指的结
构域。后来相继从其它植物例如欧芹、水稻、烟草、
大麦和紫花苜蓿中也 鉴定 出了这种蛋 白(Cormack
et a1．，2002；郭泽建等，2004；Hara et a1．，2000；Sun
et“ ．，2003i陈婷婷等，2o12)。WRKY蛋白参与植
物的抗病性 (Li et a1．，2006)、代谢调控(Xu el a1．，
2004)、衰 老(Robatzek et a1．，2002)和非 生物逆境
等生理过程 (Mare et a1．，2004；江文波等，2009)。
拟南芥 中 AtWRKY22和 AtWRKY29已被鉴定是
MAPK信号途径的下游组分 ，参与细菌和真菌病原
物的信号传 导 (Wang et a1．，2004)。一些 WRKY
蛋 白参与植物生长发育过程 ，例 如拟南芥 中 TTG2
编码一个 WRKY转录因子(即 AtWRKY44)，该蛋
白在表皮毛中高水平表达 ，该基因突变体叶表面毛
状体的数量减少且 没有分支 (Jonson et a1．，2002)。
拟南 芥 WRKY6对 低 硼 胁 迫 表 现 出 敏 感 表 型
(Ichiro et a1．，2O10)，说明该转录 因子在硼胁迫 生
理过程中起到正调控作用。
马铃薯 (Solanum tuberosurn)是 目前 世界上继
水稻 、玉米和小麦之后的第四大粮食作物 ，现已在世
界各地广泛种植 ，马铃薯的适应性强 ，经济价值高，
既可粮菜兼用，又能作为工业原料 ，因此马铃薯在我
国乃至全球工农业生产中占有举足轻重地位。本研
究首次报道克隆出马铃薯品种米拉 WRKY2基因，
序列分析 表 明该蛋 白属于 WRKY 家族 第二 组成
员 ，锌指结 构为 C—X —C—X 。H—X H，通过凝胶 阻滞
实验证明该蛋 白在体外具有结合 DNA 的活性 ，同
时利用实时荧光定量 PCR研究其在低磷、低钾、高
盐 、PEG和 4℃低温处理共五种非生物逆境胁迫下
的表达情况 ，这为今后深入研 究该基因的功能奠定
了坚实基础 。
1 材料与方法
1．1材料
供试马铃薯 品种米拉 ，由四川农业大学马铃薯
研究中心提供。植物材料的处理是把在 MS培养基
上生长 1个月马铃薯组培苗置于相应处理的溶液和
4℃低 温 中处理 6 h。大肠 杆菌 DH5a和 BL21、
DNA凝胶 回收纯化试剂盒 购于天根科 技(北京)有
限公司；pMD19一T克隆载体 、ExTaq DNA 聚合酶 、
T4DNA连接酶购于 TaKaRa公司(大连)。
1．2方法
1．2．1提取马铃薯米拉 总 RNA和反转 录 以组 培
苗的幼嫩叶片为材料，采用 Trizol法提取总 RNA，
然后 反转 录为 cDNA。反 转 录 的 反应 体 系 为 l0
／,L，在 DEPC水处理过 的小管 中依次加 入下列 组
分 ：Oligo dT 0．5 L；dNTP(20 rnmol／I )1／aI ；
RNA 3 ptg；补水至 6．5“I 。65℃变性 5 rain，迅速
在冰上冷却 至少 1 min，稍 微离心 ，然后 加入 5×
First—Strand buffer 2 L、0．1 mol／L DTT 1 fI ；Su—
per ScriptⅧ II RT 0．5 L。反应条件是 42℃反应
6O min，70℃处理 15 rain。反转录产物在一20℃保
存备用 。
3期 李立芹等 ：马铃薯 WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式 403
1．2．2扩增 WRKy2基 因 用同源序列克隆方法 ，利
用 Primer Premier 5．0设计 同源引物 ，引物序列为
W RKY2一F(5 一GGATCCATGGCTGTAGACTTA—
ATGACCA一3 下划线处表示酶切 位点 ，以下同)和
WRKY2一R 引 物 (5 一CCCGGGTTAAGAAGAT—
TCAAGAACAT一3 )。PCR反应体系以 0．5 L cD—
NA为模 板 ，加 入 10×ExTaq缓 冲液 2．5 L(含
Mg )，WRKY2一F和 WRKY2一R 各 0．5 L(10
／~mol／L)，20 mmol／L dNTP 0．5“L，ExTaq DNA
聚合酶 0．25 L(5 U／／,L)，加水至 25 L。PCR反
应 的条件 ：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 S，55℃
退火 30 S，72℃延伸 1 min 10 S，共 35个循环 ；最后
72℃延伸 10 min。PCR产物于 1 琼脂糖凝胶电
泳检测。
1．2．3基 因克隆及测序 扩增产物经电泳检测后，回
收 目的片段 ，然后 与 pMD19-T载 体 16℃ 连接 过
夜 ，连接产物转化大肠杆菌 DH5a感受态 ，然后在涂
有氨苄青霉素的 I B平板上进行培养过夜 ，第 二天
挑取单克隆，进行菌落 PCR检测 ，然后 随机选取 3
个独立的阳性克 隆进行测序 (上海 Invitrogen生物
工程技术服务有限公司)。
1．2．4序列分析 基 因的编码框用 NCBI提供 的在
线 0RF Finder寻 找 (http：／／www．ncbi．nlm．nih．
gov／gorf／gorf．htm1)；核苷酸及氨基酸序列 的同源
序 列 搜 索 由 NCBI提 供 的 在 线 BLAST 进 行
(http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov)；系 统 演 化树 用
MEGA4软件进行 。
1．2．5原核表达载体构建、目的蛋 白诱导和纯化 利
用引物 WRKY2一F和 WRKY2一R对测序正确 的质
粒进行 PCR扩增并 回收 目的基因。通过双酶切和
连接的方法把 目的基因连接到 pGEX一4T一2载体上 ，
然后利用原核表达方法进行 目的蛋 白表达，采用谷
胱甘 肽一Sepharose 4B珠 子对 目的蛋 白进 行纯化 。
采用 Bradford法测定蛋 白浓度 ，纯化后 蛋白冷冻干
燥保存 于冰箱待用 。
1．2．6凝 胶 阻滞 实验 (EMSA) 将 含 有 W—box
DNA 序 (CATAAGAGTTGACCTTGACCACTA)
和突变 序 列 (CATAAGAGTTCTCCTTCTCCAC—
TA)串联重复 3次，用化 学合成 的方法合成双链 。
凝胶阻滞 实验 按 照 Light Shift Chemiluminescent
EMSA Kit(Pierce)试剂盒标准步骤进行 。
1．2．7马铃薯 WRKY2基 因的定量分析 对正常生
长和五种胁迫处 理 的马铃薯幼苗 采用 Trizol法提
取总 RNA，逆转录后获得 cDNA。采用同样的方法
获得马铃薯幼苗根 、叶和茎 的 cDNA。然后利用荧
光实时定量 PCR技术对 目的基 因进行扩增 ，检测
StWRKY2在不同器 官和不 同处理后 的表达情况。
扩增正 向引物为 (5，_TTCTCCGTCGCCGGCGAC一
3 )和 反 向引 物 为 (5 一TCATGCTAATAGCAGG—
GACT一3 )。以 EF1a作 为 内标 基 因，扩增 引物 为
EF1 aF(5 一CCAGATTGGAAAACGGATAT一3 )和
EF1 aR (5 一CACCAGTTGGGTCCTTCTTG一3 )。
反应体系为 2o L，反应条件为 95℃ 5 rain，然后
95℃ 15 S；60℃ 60 S，40个循环。
2 结果与分析
2．1目的基因的 PCR扩增及克隆
以马铃薯组 培苗 cDNA为模 板，进 行 PCR扩
增 ，扩增产物用 1 琼脂糖凝胶电泳检测后 ，可见 1
条约为 1 kb的条带(图 1)。该条带回收纯化后 ，与
pMD19-T载体连接 ，转化 产物经过菌落 PCR筛选
后 ，将获得阳性克隆送到生物公司进行测序 。
2000bp
’O
7
0
5o
0
b3
图 1 StwRKy2基因扩增结果
M．标 记 2000；1．PCR产 物。
Fig．1 St WRKY2 PCR product
M．Marker 2000；1．PCR product．
2．2序列分析及 系统进化树构建
序列分 析结果 表 明 ，该基 因的开 发 阅读 框 为
1 065 bp，编码 355氨基 酸。用 StWRKY2的氨基
酸序列在 NCBI网站中的 Blast进行在线 比对，从 中
选出同源性较高的 19条氨基酸序列进行保守域分
析 ，并通过 比对从 中选择 同源性较高 的 WRKY结
构域进行作 图，结果表明克隆的 WRKY2含有 1个
保守 WRKY结 构域 ，其锌指 结构模 式 为 C—X 一C—
X H—X—H，属于 WRKY家族的第二组(图 2)。同
时根 据 这 2O 个 蛋 白 的 氨 基 酸 序 列 (包 括
StWRKY2)构建系统发育树 (图 3)。分析发现，该


406 广 西 植 物 35卷
见报道，烟草 WRKY EIG—D48被报 道是受到病原
菌的诱导表达 (Takemoto et a1．，2003)。因此推测
StwRKY2可能与马铃薯的抗病 性相 关，但这还需
要通过进一步相关实验证明。
转录因子通过结合到靶基因启动子上 的顺式作
用元件从而调节基因的转录 ，WRKY转录因子中的
WRKY结构域主要是结合顺式作用元件 W—box部
位(Eulgem et a1．，2000)。EMSA实验是 目前研究
蛋白与 DNA互作时应有最广，而且具有简单、快速
和灵敏的特点。Ciolkowski et a1．(2008)研究 了不
同 W—box侧翼序列对拟南芥中 5个 WRKY转录因
子结合 W—box的影响；Verk et a1．(2O11)研究证明
AtWRKY28能结合到 可能靶基 因 ICS1(参与 sA
途径的基因)启动子上 ，从而调节该基因表达 。本研
究采用 EMSA 实验证 明 StWRKY2能够结合 w—
box，而不能结合突变的 W—box，说明该蛋白具有转
录因子的 DNA结合活性 。
本研究通过 RT—PCR对 StWRKY2的表达部
位进行分析 ，发现其主要在根中表达 ，推测其可能参
与马铃薯对非生物逆境的响应 。实验结果表明该基
因在在低磷处理 6 h后表达量 明显 降低，说 明
StWRKY2参 与 低 磷 胁 迫 反 应。拟 南 芥 中
AtWRKY6通过抑制下游靶基 因 pho1的表达参 与
低磷胁迫反应，在拟南芥中过量表达 AtWRKY6的
植株表现 出低磷敏感 的表型，因此 AtWRKY6在这
样的信号通路中作为一个负调控因子 (Chen et a1．，
2009)。S wRKy2在 200 mmol／I NaCl和 400
mmol／L PEG处理后表达量 明显升高 ，表明它响应
这两种渗透胁迫。与病菌防御反应相关 的 At—
WRKY70和 AtWRKY54能够通过调 节气孑L开度
进而参与拟南芥的渗透胁迫反应，这两个基因的双
突变体 能 够增 强 对 PEG 胁 迫 的抗性 (Li et a1．，
2013)。与此类似的是与病原菌防御反应相关 的小
麦 WRKY10表达水平在 PEG、NaC1、冷和 H () 处
理后迅速升高，在烟草 中过量表达 TaWRKY10可
以提高转 基 因烟草对干 旱和盐 胁迫 的抗 性，说 明
TaWRKY10在这两种胁迫反应 中起到正调控 的作
用 (Wang et a1．，2013)。
马铃薯作为一种世界范 围内重要 的经济作物 ，
相对于水稻、玉米和小麦 比较而言，WRKY转 录因
子的研究较少 ，第一个报道 的 StWRKy1在转录水
平上是受到软腐病诱导表达(Dellagi et a1．，2000)；
马铃薯 WRKY6基 因已被克隆，该蛋 白在大肠杆菌
中已成功表达 (Li et a1．，2011)；马铃薯 DNA芯片
数据表明 WRKY转录因子参 与菌根早期形成的过
程，进一步研究表明该转录因子家族通过调节植物
防卫相关 的基 因控制 菌根 的形 成 (Galou et a1．，
2012)。相信随着基因组学与分子生物学发展 ，越来
越多马铃薯 中 WRKY转 录因子功能将被 阐述 ，这
对于马铃薯中重要功能基因的鉴定和遗传育种工作
具有重要意义。
参考文献 ：
ChenTT(陈婷 婷)，Yang QC(杨 青川 )，Ding W(丁旺 )。et a1．
2O12．Cloning and subcelular localization of a WRKY transcrip—
tion factor gene of Medicago Ⅱ， (紫花苜蓿 WRKY转录因
子基因的克隆与亚 细胞定位 )[J]．Acta Pratac Sin(草 业学
报)，21(4)：159—167
Chen YF，Li I Q，Xu Q，et“ ．2009．The WRKY6 transcription
factor modulates PHOSPHArE 1 expression in response to low
Pi stress in ArabidopsisLJj．Plant(Jell，21(11)：3 554—3 566
Ciolkowski I，W anke D，Birkenbih1 RP，et a1．2008．Studies on
DNA binding selectivity of W RKY transcription factors lend
structural clues into WRKY domain functionl J．Plant Mol B
0 ，68(2)：81— 92
Cormack RS，Eulgem T，Rusbton PJ，et a1．2002．I eucine zipper-
containing W RKY proteins widen the spectrum of immediate
early elicitor induced W RKY transcription factors in parsley
[J]．Biochim BiophysA(ta，1 576(1 2)：92—10O
Dellagi A，Helibronn J，Avrova AO，et a1．2000．A potato gene enco
ding a W RKY like transcription factor is induced in interactions
with Erwinia carotovora subsp．atroseptica and Phytophthora in
festans and is coregulated with class I endochitinase expression
1 J I．Mol Plant Microb Interact，13(10)：1 092 1 l()l
Eulgem T，Rushton PJ，Robatzek S，et a1．2000．The WRKY su
perfamily of plant transcriptional factors[J]．Trends Plant Sc i，
5(5)：199— 206
Gallou A，Declerck S，Cranenbrouck S．2012．Transcriptional regu
lation of defence genes and involvement of the WRKY transcrip—
tion factor in Arbuscular rtycorrhizaf potato root colonization
LJj．Funct Integr Genom，12(1)：l83—198
Guo zJ(郭泽 建)，Kan YC(阚云超)，(；hen XJ(陈旭君 )，et a1．
2004．Characterization of a rice W RKY gene whose expression is
induced upon pathogen attack and mechanical w。unding(一种转
录受病原物接种 和机械创 伤诱 导 的水稻 WRKY基 因的鉴
定)[J]．Aeta Bot Sin(植物学报)，46(8)：955—964
Hara K ，Yaq M ，Kusano T，et a1．2000．Rapid systemic accumula—
tion of transcripts encoding a tobacco W RKY transcription factor
upon wounding[J]．Mol Genet Genornics，263(1)：30—37
Ichiro K，Yoko ID ，Masami YH ，et a1．20l0．W RKY6 is involved
in the response to boron deficiency in Arabidopsis 拍aliana
f J f．Physiol Plant，139(1)：80 92
Ishiguro S，Nakamura K． 1994． Characterization of a cDNA
encoding a nove1 DNA binding protein，SPF1，that recognizes
SP8 sequences in the 50 upstream regions of genes coding for
sporamin and beta amylase from sweet potato[J]．Mol Genet
Gcno7tlics，244(6)：563— 57l
Jang WB(江文波)，Yu DQ(余迪求)．2009．Arabidopsis WRKY2
3期 李立芹等：马铃薯 WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式 407
transcription factor may be involved in osmotic stress redponse
(拟南芥 WRKY2转 录调控 因子可能 参与 调控渗 透胁迫 反
应)[J]．Acta Bot Yunnan(云南植物研究)，31(5)：427—432
Jonson CS，Kolevski B，Smyth DR 2002．TRANSPARENT
TES GLA—BRA 2。a trichome and seed coat development
gene of Arabidopsis．encode a WRKY transcription factor
LJj．Plant Cell，14(6)：l 359—1 375
Li J，Besseau S，Toronen P，et a1．2013．Defense-related transcrip—
tion factors W RKY70 and WRKY54 modulate osmotic stress
tolerance by regulating stomatal aperture in Arabidopsis
LJ ．New Phytol，7(1)：1—16
Li J，Brader G，Kariola T，et a1．2006．WRKY7O modulates the se-
lection of signaling pathways in plant defence[J]．Plant J，46
(3)：477— 491
I』LQ(李 立 芹 )，Huang YB(黄 玉 碧 )，Wang XY(王 西 瑶 )．
2011．Cloning，sequence analysis and prokaryotic expression of
the WRKY6 of potato(马铃薯 WRKY6基因的克隆、序列分析
与原核表达研究 )[J]．Acta Pratac Sin(草业 学报)，20(2)：
177 183
Robatzek，Somssich IE．2002．Targets of At W RKY6 regulation
during plant senescence and pathogen defense[J]．Genes Dev，16
(9)：l 139— 1 149
Sun CX，Palmqvist S，Olsson H ，et a1．2003．A novel W RKY tran—
scription factor，SUSIBA2，participates in sugar signaling in
barley by binding to the sugar_responsive elements of the iso 1
promoter[J]．Plant Cell，15(9)：2 076—2 092
Takemoto D，Yoshioka H，Doke N，et a1．2003．Disease stress-in—
ducible genes of tobacco expression profile of elicito卜responsive
genes isolated by subtractive hybridization[J_J．Physiol Plant，
l18(4)：545— 553
M are C，Mazzucotelli E，Crosatti C，et a1．2004．Hv-W RKY38：a
new transcription factor involved in cold and drought response in
barley[J]．Plant Mol Biol，55(3)：399—4l6
Verk MC，Bol JF，Linthost HJ．2011．WRKY transcription factors
involved in activation of SA biosynthesis genes[J]．BMC Plant
Biol，19(11)：89一 l11
Xu YH，Wang JW ，Wang S，et a1．2004．Characterization of
GaW RKY1。a cotton transcription factor that regulates the ses—
quiterpene synthase gene(+)一3-cadinene synthase-A[J]．Plant
Physiol，135(1)：507— 515
W ang C，Deng P，Chen L，et a1．2013．A W heat W RKY transcrip—
tion factor TaW RKY 10 confers tolerance to multiple abiotic
stresses in transgenic tobacco[J]．PLos One，8(6)：l一13
Wang J，Zhang S，Stacey G．2004．Activation of a mitogen-activated
protein kinase pathway in Arabidopsis by chitin[J]．Mol Plant
Pathol，5(2)：125— 135
(上接第 419页 Continue from page 419)
Sonneveld T，T0but KR，Robins TP．2003．Allele-specific PCR de—
tection of sweet cherry selfincompatibility alleles S1 to S1 6 using
consensus and alele-specific primers[J]．Theor Appl Genet，107：
1 O59— 1 070
Sonneveld T，Robbins TP，Boskovic R，et a1．2001．Cloning of six
cherry self-incompatibility aleles and development of alele-
specific PCR detection[J]．Theor Appl Genet，102：1 046—1 055
Tao R ，Yamane H ，Sugiura A．1999．M olecular Typing of S al
leles through identification characterization and cDNA
cloning for S-RNases in sweet cherry[J]．Am Soc Hortic
Sci．24(3)：224— 233
Verdoodt L，Van Haute A，Goderis IJ，et a1．1998．Use of multi—al
lelic self-incompatibility gene in apple to assess homozygocity in
shoots obtained through haploidinduction[J]．Theor Appl Genet，
96：Z94— 300
W iliams W ，Brown AG．1 956．Genetic response to selection in cul—
tivated plants：gene frequencies in Prunus avium[J]．Heredity，
10：237— 245
Xue Y，Carpenter R，Dickinson HG，et a1．1996．()rigin of
allelic diversity in Antirrhinum S—locus RNases[J]．Plant
Cell，8：805— 814
Zhang XM(张晓明)，Wang HX(T鸿霞)，et a1．2007．Sweet cherry S
genotype PCR identification technology(甜樱桃 S基 因型 PCR鉴
定技术研究)[J]．J Fruit Sci(果树学报)，24(4)：466—471
Zhou J(周杰)．2008．Analysis of sweet cherry varieties S genotype
identification and genetic diversity(甜樱桃品种 S基 因型鉴定及
遗传多样性 分析 )[D]．Tai’an(泰安 )：Shandong Agricultural
University(山东农业大学)