全 文 ： Ｇｕｉｈａｉａ Ａｕｇ. ２０１６ꎬ ３６(８):９９３－９９９
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ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１４１００４７
胡凤云ꎬ 蒋妮ꎬ 叶云峰ꎬ 等. 积雪草漆斑病病原鉴定及室内药剂筛选 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(８):９９３－９９９
ＨＵ ＦＹꎬ ＪＩＡＮＧ Ｎꎬ ＹＥ ＹＦꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ [Ｊ].
Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(８):９９３－９９９
积雪草漆斑病病原鉴定及室内药剂筛选
胡凤云２ꎬ 蒋 妮２ꎬ 叶云峰２ꎬ 蒋水元１∗
( １. 广西植物功能物质研究与利用重点实验室ꎬ 广西壮族自治区中 国 科 学 院 广西植物研究所ꎬ
广西 桂林 ５４１６００ꎻ ２. 广西药用植物园ꎬ 南宁 ５３００２３ )
摘 要: 近年来ꎬ在广西各地积雪草种植基地ꎬ出现一种为害极重的病害ꎬ该病害病原菌主要为害积雪草叶
片、叶柄ꎬ可致使叶片大面积枯死ꎬ该病害发生普遍、侵染期长ꎬ严重影响积雪草药材的品质和产量ꎮ 该研究采
用常规组织分离法从积雪草病叶上分离病原菌并根据柯赫氏法则验证其致病性ꎻ通过菌落特征、菌株形态及
ＩＴＳ序列分析鉴定病原菌ꎻ在室内利用生长速率法测定 １０种杀菌剂对该菌的抑制活性ꎮ 结果表明:为害积雪
草叶片的病原菌为泛生漆斑菌(Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｉｎｕｎｄａｔｕｍ)ꎻ该菌侵染性强ꎬ接种至健康积雪草叶片后 ２４ ｈ即可
发病ꎬ并迅速扩展引起叶片萎蔫ꎻ杀菌剂 ６０％唑醚代森联水分散粒剂、４５％恶霉灵甲霜可湿性粉剂、１.８％
辛菌胺醋酸盐水剂、８０％代森锰锌可湿性粉剂室内对积雪草漆斑病病原菌的抑菌率均在 ９８％以上ꎬ抑菌效果
极强ꎬ建议在生产中轮换应用防治积雪草漆斑病ꎮ １５％咪鲜胺微乳剂、７０％甲基硫菌灵可湿性粉剂和 １０％苯
醚菌酯悬浮剂对该病原菌的抑菌率也均在 ９２％以上ꎬ抑菌效果良好ꎬ在生产中可酌情考虑使用ꎮ
关键词: 积雪草ꎬ 泛生漆斑菌ꎬ 病原菌ꎬ 药剂筛选
中图分类号: Ｑ９４５.８ 文献标识码: Ａ 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０８￣０９９３￣０７
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ
Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ
ＨＵ Ｆｅｎｇ￣Ｙｕｎ２ꎬ ＪＩＡＮＧ Ｎｉ２ꎬ ＹＥ Ｙｕｎ￣Ｆｅｎｇ２ꎬ ＪＩＡＮＧ Ｓｈｕｉ￣Ｙｕａｎ１∗
( １. Ｇｕａｎｇｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙꎬ
Ｇｕａｎｇｘｉ Ｚｈｕａｎｇ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｇｕｉｌｉｎ ５４１６００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２. Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐｌａｎｔꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２３ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓꎬ ａ ｎｅｗ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｒｅａ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉꎬ ｔｈｉｓ
ｐａｔｈｏｇｅｎ ｕｓｕａｌｌｙ ｄａｍａｇｅｓ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｐｅｔｉｏｌｅｓꎬ ａｎｄ ｉｔ ｃａｎ ｌｅａｄ ａ ｌａｒｇｅ ａｒｅａ ｏｆ Ｃ. ａｓｉａｔｉｃａ ｔｏ ｗｉｔｈｅｒ. Ｉｔ ｏｃｃｕｒｅｄ ｖｅｒｙ
ｃｏｍｍｏｎ ａｎｄ ｈａｄ ａ ｌｏｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ｏｎ Ｃ. ａｓｉａｔｉｃａꎬ ｓｏ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｃ. ａｓｉａｔｉｃａ ｄｅｃｌｉｎｅｄ ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ. Ｗｅ
ｕｓｅｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔｓꎬ ａｎｄ ｃｏｒｒｏｂｏｒａｔｅｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ Ｋｏｃｈ’ ｓ
Ｒｕｌｅ.ꎻ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｍａｉｎｌｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎ￣
ｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ (ＩＴＳ) ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬ ｕｓｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄꎬ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｅｎ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ ａｓｓａｙｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ
ｐａｔｈｏｇｅｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｉｎｕｎｄａｔｕｍ ｗａｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄꎬ ｗｈｉｃｈ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｄｉｓ￣
收稿日期: ２０１４￣１０￣２９ 修回日期:２０１５￣０５￣１５
基金项目: 广西科学研究与技术开发计划项目(桂科重 １３５５００１￣２￣６)ꎻ横向项目(２０１１￣４５００￣０４￣００００２０) [ Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｋｅｙ Ｐｌａｎｎｉｎｇ
Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ(１３５５００１￣２￣６)ꎻ Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ(２０１１￣４５００￣０４￣００００２０)]ꎮ
作者简介: 胡凤云(１９８６￣)ꎬ女ꎬ河南新县人ꎬ硕士ꎬ研究实习员ꎬ主要研究方向为药用植物病害防治ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｈｆｙ３１６＠ １２６.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 蒋水元ꎬ研究员ꎬ从事药用植物栽培学研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊｓｙ＠ ｇｘｉｂ.ｃｎꎮ
ｅａｓｅ ｏｆ Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ. Ｉｔ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｎｅｓｓ ａｎｄ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｏｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｌｅａｖｅｓ ｉｎ ２４ ｈꎬ ａｎｄ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ ｔｏ
ｂｒｉｎｇ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｗｉｌｔｉｎｇ. Ｔｈｅ ｉｎｄｏｏｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ ６０％ Ｐｙｒａｃｌｏｓｔｒｏｂｉｎ￣ｍｅｔｉｒａｍ ＷＧꎬ ４５％
Ｈｙｍｅｘａｚｏｌ￣ｍｅｔａｌａｘｙｌ ＷＰꎬ １.８％ Ｘｉｎｊｕｎａｎ ａｃｅｔａｔｅ ＡＳ ａｎｄ ８０％ Ｍａｎｃｏｚｅｂ ＷＰ ｗｅｒｅ ａｂｏｖｅ ９８％ꎬ ｔｈｅｙ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｍｉ￣
ｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ. Ｔｈｅ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｉｎｕｎｄａｔｕｍ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ ｃｏｕｌｄ ｔａｋｅ ｔｕｒｎｓ ｔｏ ｃｏｎ￣
ｔｒｏｌ ｔｈｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｆｉｅｌｄ. Ｔｈｅ ｉｎｄｏｏｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｔｈｒｅｅ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ １５％ Ｐｒｏｃｈｌｏｒａｚ ＭＥꎬ ７０％Ｔｈｉｏｐｈａｎａｔｅｍ￣
ｅｔｈｙｌ ＷＰ ａｎｄ １０％Ｋｒｅｓｏｘｉｍ￣ｍｅｔｈｙｌ ＳＣ ｗｅｒｅ ａｂｏｖｅ ９２％ꎬ ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｓａｔｉｓｆｉｅｄ. Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ
ｗｅ ｃａｎ ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｔｏ ｕｓｅ ｔｈｅｓｅ ｔｈｒｅｅ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｌｙ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａꎬ Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｉｎｕｎｄａｔｕｍꎬ ｐａｔｈｏｇｅｎꎬ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ
积雪草(Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ)ꎬ别名崩大碗、马蹄
草、雷公根、铜钱草等ꎬ为伞形科(Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ)积雪
草属(Ｃｅｎｔｅｌｌａ Ｌ.)多年生草本植物ꎮ 主要分布于我
国华东、华南、中南及西南诸省区(陈瑶等ꎬ２０００)ꎮ
积雪草全草可入药ꎬ具清热利湿、消肿解毒等功效ꎬ
能治痧氙腹痛、暑泻、痢疾、湿热黄疸、砂淋、血淋ꎬ吐
血、咳血、目赤、喉肿、风疹、疥癣、疔痈肿毒、跌打损
伤等(吴征镒ꎬ１９７９ꎻ秦路平等ꎬ１９９７)ꎮ 其质地柔
嫩、适口性好ꎬ是南方人喜爱的一种野生食材ꎬ亦可
作为凉茶饮用ꎮ 近年来ꎬ随着生活水平的提高ꎬ人们
对野生资源开发利用也越来越充分ꎮ 积雪草作为一
种药食兼用的野生植物资源ꎬ其独具风味的口感和
药用价值为人们所青睐ꎮ 目前ꎬ作为野生蔬菜资源
和民族草药被广泛利用ꎬ其需求量逐年增加ꎮ 近年
各产地对积雪草的滥采乱挖ꎬ造成资源的日益枯竭ꎬ
仅依靠野生种苗已无法充分发挥它的利用价值ꎬ因
此采取人工繁殖栽培来改变现状已非常迫切ꎬ目前
广西多地药农相继尝试人工种植积雪草ꎮ
２０１３年 ９ 月ꎬ在广西桂林市的积雪草种植基
地ꎬ出现了一种为害极重的病害ꎬ该病病原菌主要为
害积雪草叶片ꎬ初为褪绿小点ꎬ后扩展成近圆形或不
规则形小斑ꎬ病斑中心呈棕色略白ꎬ边缘暗褐或茶褐
色ꎬ病斑周围或有褪绿现象ꎮ 湿度大时病斑上可见
黑褐色小点ꎬ即病菌子实体ꎮ 叶柄也可染病ꎬ可致使
整株枯死ꎬ严重影响了积雪草药材的品质和产量ꎮ
根据该病害田间表现出的病状及病症ꎬ 笔者暂且将
表 １ 供试杀菌剂及使用浓度
Ｔａｂｌｅ １ Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
编号
Ｓｅｒｉａｌ ｎｕｍｂｅｒ
药剂名称
Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ
生产厂家
Ｆａｃｔｏｒｙ
使用浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ (ｍｇＬ￣１)
１ ８０％代森锰锌可湿性粉剂
８０％ Ｍａｎｃｏｚｅｂ ＷＰ
利民化工股份有限公司
Ｌｉｍｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ
１ ０００
２ ２５％氟吗唑菌酯悬浮剂
２５％ Ｆｌｕｍｏｒｐｈ￣ｐｙｒａｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ ＳＣ
中化农化有限公司
Ｓｉｎｏｃｈｅｍ Ａｇｒｏ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ
１ ５００
３ １０％苯醚甲环唑水分散粒剂
１０％ Ｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅ ＷＧ
绩溪农华生物科技有限公司
Ｊｉｘｉ Ｎｏｎｇｈｕａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ.
１ ５００
４ ６０％唑醚代森联水分散粒剂
６０％Ｐｙｒａｃｌｏｓｔｒｏｂｉｎ￣ｍｅｔｉｒａｍ ＷＧ
巴斯夫股份公司
ＢＡＳＦ ＳＥ
１ ５００
５ ７０％甲基硫菌灵可湿性粉剂
７０％Ｔｈｉｏｐｈａｎａｔｅｍｅｔｈｙｌ ＷＰ
日本曹达株式会社
Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｏｄａ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ
９００
６ ４５％恶霉灵甲霜可湿性粉剂
４５％Ｈｙｍｅｘａｚｏｌ￣ｍｅｔａｌａｘｙｌ ＷＰ
临沂化联作物有限公司
Ｌｉｎｙｉ Ｕｎｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ
５００
７ １０％苯醚菌酯悬浮剂
１０％Ｋｒｅｓｏｘｉｍ￣ｍｅｔｈｙｌ ＳＣ
浙江禾田化工有限公司
Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｈｅｔｉａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ
７ ５００
８ ２０％噻森铜悬浮剂
２０％ Ｓａｉｓｅｎｔｏｎｇ ＳＣ
浙江东风化工有限公司
Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｄｏｎｇｆｅｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ
３００
９ １.８％辛菌胺醋酸盐水剂
１.８％ Ｘｉｎｊｕｎａｎ ａｃｅｔａｔｅ ＡＳ
广西安嘉科技农化有限公司
Ｇｕａｎｇｘｉ Ａｎｊｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ
８００
１０ １５％咪鲜胺微乳剂
１５％ Ｐｒｏｃｈｌｏｒａｚ ＭＥ
海南博士威农用化学有限公司
Ｈａｉｎａｎ Ｂｏｓｈｉｗｅｉ Ａｇｒｏ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ
２ ０００
４９９ 广 西 植 物 ３６卷
图 １ 积雪草漆斑病田间早期症状 Ａ. 早期症状ꎻ Ｂ. 后期症状ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｎａｔｕｒａｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ Ａ. Ｅａｒｌｙ ｓｙｍｐｔｏｍｓꎻ Ｂ. Ｌａｔｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ.
图 ２ 积雪草漆斑病离体接种发病症状 Ａ. ３ ｄ后发病情况ꎻ Ｂ. ６ ｄ后发病情况ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔａｃｈｅｄ ｌｅａｖｅｓ Ａ. Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｆｔｅｒ ３ ｄꎻ Ｂ. Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｆｔｅｒ ６ ｄ.
其命名为积雪草漆斑病ꎮ 目前ꎬ关于积雪草的化学
成分的研究报道较多(薛菁等ꎬ２０１４ꎻ应娜等ꎬ２０１４ꎻ
冯旭等ꎬ２０１４ꎻ姜润松等ꎬ２０１３)ꎬ对其病害方面的研
究尚未见报道ꎮ 据笔者实地调研ꎬ该病害在广西柳
州、来宾等地也有发生ꎬ病害发生率为 ４０％ ~ ５０％ꎬ
由于目前大多数药农对种植积雪草尚无经验ꎬ也没
有可参考的防治方法ꎬ多采用多菌灵、甲基托布津等
常规杀菌剂进行防治ꎬ但防效甚差ꎬ该病害成已为当
前积雪草推广种植过程中一重要瓶颈ꎮ 可见弄清该
病害的病原菌、筛选出高效低毒的杀菌剂ꎬ为当务之
急ꎮ 因此ꎬ本研究对采集的积雪草漆斑病病样ꎬ开展
了病原分离和鉴定工作ꎬ并在室内进行了药剂筛选试
验ꎬ以期为积雪草漆斑病的有效防治提供理论基础ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
感病积雪草样品、健康积雪草样品于 ２０１３ 年 ９
月采自广西桂林市雁山积雪草种植基地ꎬ保湿带回
实验室备用ꎮ 供试培养基为马铃薯葡萄糖培养基
(ＰＤＡ)ꎮ 供试药剂为苯醚甲环唑、唑醚代森联等
１０种杀菌剂ꎬ毒性均为低毒(表 １)ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 病原菌的分离与纯化 参考方中达(１９９８)的
５９９８期 胡凤云等: 积雪草漆斑病病原鉴定及室内药剂筛选
图 ３ 积雪草漆斑病病原形态 Ａ. 菌落正面ꎻ Ｂ. 菌落反面ꎻ Ｃ. 分生孢子团ꎻ Ｄ. 分生孢子ꎮ
Ｆｉｇ. ３ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ Ａ. Ｏｂｖｅｒｓｅ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙꎻ Ｂ. Ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙꎻ Ｃ. Ｐｉｏｎｎｏｔｅｓꎻ Ｄ. Ｃｏｎｉｄｉａ.
方法ꎬ采用组织分离法对采回来的病样进行分离纯
化ꎮ 即用清水将收集的病叶冲洗干净、晾干表面水
分ꎬ切取病健交界处边长约 ５ ｍｍ 的正方形组织块ꎬ
放入 ７５％酒精和 ０.１％升汞中分别进行表面消毒后ꎬ
置于准备好的 ＰＤＡ 培养基平板上ꎬ２８ ℃下恒温培
养 ３~４ ｄ后ꎬ沿菌落边缘挑取长仅可见的菌丝转皿
纯化培养ꎬ最后将分离得到的菌株经单孢纯化后保
存于 ＰＤＡ斜面培养基上ꎬ置 ４ ℃冰箱中贮存备用ꎮ
１.２.２ 病原菌的致病性测定 将纯化后的病原菌菌
株移到 ＰＤＡ 培养基平板上ꎬ于 ２８ ℃下培养 ７ ｄ 备
用ꎮ 选取健康的积雪草叶片ꎬ用灭过菌的蒸馏水冲
洗干净后晾干表面水分ꎬ采用针刺接种法接种ꎬ即用
针刺伤叶片后取直径为 ５ ｍｍ 菌丝块覆盖在伤处ꎬ
放入灭过菌的培养皿中保湿培养ꎮ 对照叶片伤口处
覆盖同样大小 ＰＤＡ 培养基块ꎮ 每处理 ３ 次重复ꎮ
并将其置于自然光下 ２５ ~ ３０ ℃培养ꎬ每隔 ２ ｄ 观察
发病情况ꎮ 对接种发病的叶片进行病原菌再分离ꎬ
观察分离得到的病原菌菌落是否与原接种菌株
相同ꎮ
１.２.３ 病原菌形态学鉴定 将分离纯化得到的病原
菌接种于 ＰＤＡ培养基平板上ꎬ２８ ℃培养 １５ ~ ２０ ｄꎬ
记录菌落生长速度、形态和颜色ꎮ 在普通光学显微
镜下观察并描述病原菌的产孢结构和分生孢子的形
态学特征ꎬ随机测量 １００个病原菌分生孢子的大小ꎬ
并拍照ꎬ对病原菌进行形态学鉴定ꎮ
１.２.４ 分子生物学鉴定 将病原菌接种于 ＰＤＡ 培养
基平板上培养 ７ ｄ后ꎬ挑起可见菌丝接入 ＰＤ液体培
养基中ꎬ振荡培养 (２８ ℃ꎬ８０ ｒｍｉｎ￣１) ７ ｄ 后收集
菌丝ꎬ用无菌水冲洗ꎬ抽滤ꎬ冷冻干燥ꎬ－２０ ℃低温保
存备用ꎮ
病原菌 ＤＮＡ 的提取参照易润华等(２００３)的
ＣＴＡＢ 法ꎮ 采用通用引物 ＩＴＳ４ ５′￣ＴＣＣ ＴＣＣ ＧＣＴ
６９９ 广 西 植 物 ３６卷
图 ４ 病原菌 ＩＴＳ￣ｒＤＮＡ片段序列图
Ｆｉｇ. ４ ｒＤＮＡ￣ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ
ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣ￣３′ 和 ＩＴ５ ５′￣ＧＧＡ ＡＧＴ ＡＡＡ ＡＧＴ
ＣＧＴ ＡＡＣ ＡＡＧ Ｇ￣３′ꎬ对菌株 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 区域进行
ＰＣＲ 扩增ꎮ ＰＣＲ 反应体系:含 １０ ×缓冲液 ( ２０
ｍｍｏｌＬ￣１ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ２０ ｍｍｏｌＬ￣１ ＫＣｌ)２.５ μＬꎬｄＮＴＰ
(各 ２.５ ｍｍｏｌＬ￣１)２ μＬꎬ引物 ＩＴＳ４(１０ μｍｏｌＬ￣１)、
ＩＴＳ５ (１０ μｍｏｌＬ￣１)各 ０. ５ μＬꎬＤＮＡ 模板 １０ μＬ
(约 １００ ｎｇ)ꎬＴａｑ 酶 (５ ＵμＬ￣１)０.５ μＬꎻ加 ｄｄＨ２Ｏ
至 ２５ μＬꎮ ＰＣＲ 反应条件:９５ ℃预变性 ５ ｍｉｎꎬ然后
进入循环ꎬ９５ ℃变性 ３０ ｓꎬ５８ ℃退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃复性
８０ ｓꎬ３５个循环ꎬ最后 ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
ＰＣＲ产物委托北京诺赛基因组研究中心有限
公司进行测序ꎬ将测序结果放入 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中
进行 Ｂｌａｓｔ比对ꎬ搜索同源性序列ꎮ 根据这些序列与
数据库中已鉴定出的菌株的 ＩＴＳ 序列的相似度ꎬ从
分子水平进一步明确收集的菌株的分类地位ꎮ
１.２.５ 杀菌剂室内抑菌筛选 采用生长速率法进行ꎬ
即将供试各种药剂母液分别加入到熔化后冷却至
４５ ℃左右的 ＰＤＡ 培养基中ꎬ配制成待测浓度的含
药培养基ꎬ充分摇均后倒皿ꎮ 打取菌龄相同直径为
５ ｍｍ病原菌菌饼倒放于含药平板中央ꎮ 设不加药
的 ＰＤＡ培养基为空白对照ꎬ置于 ２８ ℃恒温下培养ꎬ
每种药剂设 ３ 个重复ꎬ每 ３ ｄ 观察菌落生长情况ꎮ
当对照菌落生长接近满皿时ꎬ用十字交叉法测量菌
落的大小ꎬ按以下公式计算抑菌率ꎮ
抑菌率(％)＝ [(ｄｃｋ－ ｄ１) / ｄｃｋ]×１００
式中ꎬｄｃｋ: 对照菌落净生长距离ꎻｄ１:处理菌落
净生长距离ꎮ
菌落净生长距离(ｍｍ) ＝ 菌落平均生长直径－
菌饼直径ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 病害症状
２０１３年 ９月ꎬ该课题组在桂林市积雪草种植基
地发现了积雪草漆斑病ꎬ该病主要为害积雪草叶片ꎬ
也可为害叶柄ꎮ 叶片受害ꎬ初为褪绿小点ꎬ后扩展成
近圆形或不规则形小斑ꎬ病斑中心呈棕色略白ꎬ边缘
暗褐或茶褐色ꎬ病斑周围或有褪绿现象(图 １)ꎮ 湿
度大时病斑上可见黑褐色小点ꎬ即病菌载孢体ꎮ 叶
柄也可染病ꎬ受害叶柄初呈水渍状ꎬ病健交界处不明
显ꎬ继而病部凹陷ꎬ上下扩展可导致叶呈萎蔫状ꎬ最
后致使整株枯死ꎮ 该病害在积雪草整个生长发育期
都可发生ꎬ染病后如不及时防治发病中心可迅速扩
展ꎬ造成严重损失ꎮ
２.２ 病原菌的分离和致病性测定
在广西桂林市雁山积雪草种植基地内采集到的
７９９８期 胡凤云等: 积雪草漆斑病病原鉴定及室内药剂筛选
积雪草漆斑病病害标样ꎬ经分离纯化后得到形态特
征一致的分离物 ８个ꎮ 采用针刺接种法将这些菌株
接种到健康的积雪草叶片上保湿培养ꎬ２４ ｈ 即可明
显看出伤口染病皱缩ꎬ接种 ３ ｄ 后ꎬ接种叶片菌丝块
周围出现大面积水渍状ꎬ伴随失绿现象ꎬ６ ｄ 后叶片
大面积失绿变为黄褐色ꎬ菌丝块周围出现黑色小点
(图 ２)ꎬ７ ｄ可扩展至整张叶片及叶柄ꎬ导致叶片腐
烂ꎬ症状与田间自然发病症状相似ꎻ对照叶片不发
病ꎬ而且人工接种后发病叶片经再分离所得菌株形
态和培养性状均与接种菌相同ꎮ
２.３ 病原菌形态学鉴定
病原菌在 ＰＤＡ平板上培养ꎬ菌落为圆形或近圆
形ꎬ中间呈絮状突起ꎬ放射性扩散ꎬ边缘菌丝略薄ꎬ轮
廓整齐ꎬ气生菌丝白色质密ꎮ 菌落米白色ꎬ基底黄白
色至浅棕色ꎬ略带有黄色轮纹ꎬ后期菌落边缘产生墨
绿色至黑色粘液状分生孢子团ꎬ孢子团干燥后变硬
(图 ３)ꎮ 显微观察表明ꎬ子实体孢子座状ꎬ由分生孢
子梗紧密排列而成ꎬ周围集结成密丝组织状壁的边
缘菌丝ꎬ无刚毛ꎮ 分生孢子梗无色或基部淡色ꎬ分枝
ｌ ~ ３ 次ꎬ未次分枝顶生 ｌ ~ ５ 个轮生产孢细胞ꎮ 产孢
细胞瓶体型ꎬ无色或顶部暗色ꎬ紧密排列ꎮ 分生孢子
圆柱形或椭圆形ꎬ无色或淡柑榄色ꎬ成团时墨绿色至
黑色ꎬ单孢ꎬ单胞ꎬ两端钝圆或稍尖ꎬ大小 (１. ３７ ~
２.４２) μｍ × (０.３５~０.６３) μｍꎮ 参照吴文平(１９９１)
的描述ꎬ将该病原菌鉴定为半知菌类 ( Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ
ｆｕｎｇｉ)丝孢纲(Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ)瘤座孢目(Ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉ￣
ａｌｅｓ)瘤座孢科(Ｔｕｂｅｒｃｕｈａｒｉａｃｅａｅ)漆斑菌属(Ｍｙｒｏｔｈ￣
ｅｃｉｕｍ)ꎮ
２.４ 分子生物学鉴定
通过 ＣＴＡＢ法提取病原菌 ＤＮＡꎬ并进行 ＰＣＲ扩
增ꎬ对其产物进行测序ꎬ获得 ６０６ ｂｐ 的 ＤＮＡ 序列
(图 ４)ꎮ 图 ４ 显示ꎬ通过 Ｂｌａｓｔ 比对搜索发现ꎬ该序
列与 ＧｅｎＢａｎｋ核酸数据库中已报道的漆斑菌属的
ＩＴＳ序列同源性高达 １００％ꎮ 积雪草漆斑病病病原
菌形态特征与吴文平 ( １９９１)描述的泛生漆斑菌
(Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｉｎｕｎｄａｔｕｍ)的形态学特征相似ꎬｒＤＮＡ￣
ＩＴＳ 序列分析结果进一步从分子水平证明其为泛生
漆斑菌ꎮ
２.５ 杀菌剂室内抑菌效果
杀菌剂室内抑菌试验结果如表 ２ 所示ꎬ６０％唑
醚代森联水分散粒剂、４５％恶霉灵甲霜可湿性
粉剂、１.８％辛菌胺醋酸盐水剂、８０％代森锰锌可湿
性粉剂这 ４种杀菌剂对积雪草漆斑病病原菌的抑菌
率均在 ９８％以上ꎬ具有极强的抑菌效果ꎬ建议在生
产中轮换使用ꎮ １５％咪鲜胺微乳剂、７０％甲基硫菌
灵可湿性粉剂、１０％苯醚菌酯悬浮剂这 ３ 种杀菌剂
对该病原菌的抑菌率也都在 ９２％以上ꎬ抑菌效果良
好ꎬ在生产中可酌情考虑使用ꎮ １０％苯醚甲环唑水
分散粒剂抑菌率只有 ６４. ３２％ꎬ效果较差ꎬ２５％氟
吗唑菌酯悬浮剂和 ２０％噻森铜悬浮剂对该病害
几乎不具抑菌效果ꎬ不建议使用ꎮ
３ 讨论与结论
近年来ꎬ随着积雪草需求量的增加ꎬ越来越多的
药农开始种植积雪草ꎬ积雪草漆斑病可能给积雪草
生产造成的影响亦不容忽视ꎬ但至今仍未见相关病
原的报道ꎮ 为明确该病病原和有效控制病害的发
生ꎬ本研究结合形态学特征及分子生物学方法ꎬ对积
雪草漆斑病的病原进行了研究ꎬ首次将广西发现的
积雪草漆斑病的病原菌鉴定为泛生漆斑菌ꎮ 泛生漆
斑菌为漆斑菌属模式种ꎬ我国已报道的漆斑菌属真
菌有 ４种ꎬ即露湿漆斑菌(Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｒｉｄｕｍ)、疣
孢漆斑菌(Ｍ. ｖｅｒｒｕｃａｌｉａ)、禾漆斑菌(Ｍ. ｇｒａｍｉｎｅｕｍ)
和白毛漆斑菌(Ｍ. ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈｕｍ) (吴文平ꎬ１９９１)ꎬ其
中以露湿漆斑菌寄主范围最广ꎬ能寄生在棉花、玉
米、铁苋菜、白术、冬瓜、白薇、薯蓣、酸枣、大豆、常春
藤等多种植物上ꎬ可引起多种植物的病害(吴文平ꎬ
１９９１ꎻＦｉｔｔｏｎ ＆ Ｈｏｌｌｉｄａｙꎬ１９７０ꎻＳｒｉｖａｓｔａｖａ 和赵云芬ꎬ
１９９８ꎻ贲海燕等ꎬ２００９)ꎮ 泛生漆斑菌一般作为内生
菌存在于植物体内(Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌꎬ２０１０)ꎬ在自然条
件下直接侵染积雪草叶片引起积雪草病害还是首次
发现ꎬ在其它植物上还未见报道ꎮ 由于泛生漆斑菌
可引起的植物病害较少见ꎬ目前关于其防治方面的
研究尚处于空白状态ꎮ 因此ꎬ作者收集了 １０种低毒
杀菌剂(ＬＤ５０>５００)对该菌进行了室内抑菌试验ꎬ结
果发现 ６０％唑醚代森联水分散粒剂、４５％恶霉
灵甲霜可湿性粉剂、１.８％辛菌胺醋酸盐水剂、
８０％代森锰锌可湿性粉剂等杀菌剂对积雪草漆斑病
病原菌有极强的抑菌效果ꎬ可作为参考来防治田间
病害ꎻ１５％咪鲜胺微乳剂、７０％甲基硫菌灵可湿性粉
剂、１０％苯醚菌酯悬浮剂这 ３ 种杀菌剂对该病原菌
的抑菌率也都在 ９２％以上ꎬ抑菌效果良好ꎬ在生产
中可酌情考虑使用ꎮ
本研究选用的杀菌剂均为低毒药剂ꎬ对人畜及
环境安全危害小ꎬ不易出现农药残留ꎬ因此这些药剂
８９９ 广 西 植 物 ３６卷
表 ２ 不同杀菌剂对积雪草漆斑病病原菌的抑制效果
Ｔａｂｌｅ ２ Ｆｕｎｇｉｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ ｔｏ Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｉｎｕｎｄａｔｕｍ
药剂名称
Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ
使用浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ (ｍｇＬ￣１)
菌落平均直径
Ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ (ｃｍ)
抑菌率
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ (％)
６０％唑醚代森联水分散粒剂
６０％ Ｐｙｒａｃｌｏｓｔｒｏｂｉｎ￣ｍｅｔｉｒａｍ ＷＧ
１ ５００ ０.５１±０.０１０ ａＡ ９９.８６
４５％恶霉灵甲霜可湿性粉剂
４５％ Ｈｙｍｅｘａｚｏｌ￣ｍｅｔａｌａｘｙｌ ＷＰ
５００ ０.５３±０.０２１ ａＡ ９９.５７
１.８％辛菌胺醋酸盐水剂
１.８％ Ｘｉｎｊｕｎａｎ ａｃｅｔａｔｅ ＡＳ
８００ ０.５９±０.０５５ ａＡＢ ９８.７１
８０％代森锰锌可湿性粉剂
８０％ Ｍａｎｃｏｚｅｂ ＷＰ
１ ０００ ０.６２±０.０３５ａＡＢ ９８.２７
１５％咪鲜胺微乳剂
１５％ Ｐｒｏｃｈｌｏｒａｚ ＭＥ
２ ０００ ０.８１±０.０１５ ａｂＡＢ ９５.５４
７０％甲基硫菌灵可湿性粉剂
７０％ Ｔｈｉｏｐｈａｎａｔｅｍｅｔｈｙｌ ＷＰ
９００ ０.８２±０.０３６ ｂＢ ９５.４０
１０％苯醚菌酯悬浮剂
１０％ Ｋｒｅｓｏｘｉｍ￣ｍｅｔｈｙｌ ＳＣ
７ ５００ １.０５±０.１５０ ｃＣ ９２.０９
１０％苯醚甲环唑水分散粒剂
１０％ Ｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅ ＷＧ
１ ５００ ２.９８±０.２７１ ｄＤ ６４.３２
２５％氟吗唑菌酯悬浮剂
２５％ Ｆｌｕｍｏｒｐｈ￣ｐｙｒａｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ ＳＣ
１ ５００ ７.０１±０.０９３ ｅＥ ６.３３
２０％噻森铜悬浮剂
２０％ Ｓａｉｓｅｎｔｏｎｇ ＳＣ
３００ ７.３５±０.１１５ ｅＥＦ １.４４
对照 ＣＫ ０ ７.４５±０.０６７ ｆＦ ０
注: 使用 ＤＰＳ对不同处理进行差异显著性分析ꎬ小写字母表示 ０.０５显著水平ꎬ大写字母表示 ０.０１显著水平ꎮ
Ｎｏｔｅ: ＤＰＳ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｌｅｖｅｌ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ０.０５ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｃａｐｉｔａｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ａｔ
０.０１ ｌｅｖｅｌ.
均可应用于生产ꎬ但具体田间防效及综合防治技术
的建立尚待进一步试验ꎮ
由于研究报道该菌的文献较少ꎬ该菌的生物学
特性尚不清楚ꎬ需进一步研究ꎬ以期更全面、精确地
掌握该菌的生活习性ꎮ 本课题组调查发现ꎬ该病害
已在广西多个积雪草种植区发生ꎬ且病害发生与气
温和雨量关系密切ꎮ 春、秋阴凉天气及雨季发病较
严重ꎬ苗期种植密度过大也会成为该病发生的主要
原因ꎬ连作种植也可使该病情发生加重ꎮ 因此ꎬ积雪
草漆斑病和栽培环境及条件密切相关ꎬ所以要将化
学药剂、栽培管理和栽培技术共同结合来进行防治ꎮ
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(下转第 ９８５页 Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｏｎ ｐａｇｅ ９８５ )
９９９８期 胡凤云等: 积雪草漆斑病病原鉴定及室内药剂筛选