全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Oct．２０１５,３５(５):７５５－７６０　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０４００９
岑文,孔维维,郑鹏,等．秦艽１Ｇ羟基Ｇ２Ｇ甲基Ｇ２Ｇ(E)Ｇ丁烯基Ｇ４Ｇ焦磷酸还原酶基因(GmHDR)的克隆和表达分析[J]．广西植物,２０１５,３５(５):７５５－７６０
CenW,KongWW,ZhengP,etal．Cloningandexpressionanalysisof１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４Ｇdiphosphatereductasegene(GmＧ
HDR)fromGentianamacrophylla[J]．Guihaia,２０１５,３５(５):７５５－７６０
秦艽１Ｇ羟基Ｇ２Ｇ甲基Ｇ２Ｇ(E)Ｇ丁烯基Ｇ４Ｇ焦磷酸
还原酶基因(GmHDR)的克隆和表达分析
岑　文１,孔维维１,郑　鹏１,化文平１,２∗
(１．药用资源与天然药物化学教育部重点实验室 西北濒危药材资源开发国家工程实验室 陕西师范大学
生命科学学院,西安７１００６２;２．陕西学前师范学院 生物科学与技术系,西安７１００６２)
摘　要:龙胆苦苷 (gentiopicroside)等裂环烯醚萜苷类化合物是中药秦艽中主要的有效成分,属于萜类化合
物的衍生物,１Ｇ羟基Ｇ２Ｇ甲基Ｇ２Ｇ(E)Ｇ丁烯基Ｇ４Ｇ焦磷酸还原酶(１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４Ｇdiphosphate
reductase,HDR)是植物萜类物质合成的关键酶之一.该研究在实验室高通量测序的基础上,采用RTＧPCR
方法克隆了秦艽HDR 基因(即GmHDR 基因),利用生物信息学的方法分析了GmHDR 编码氨基酸序列的
理化性质、信号肽、转运肽、亚细胞定位、保守结构域和高级结构等特征,并采用实时定量PCR分析了 HDR
的表达模式.结果表明:秦艽GmHDR 基因包含一个完整的长１３９２bp的ORF框,编码４６３个氨基酸;GmＧ
HDR与萝芙木、艾菊等植物 HDR蛋白具有很高的一致性(≥８４％),无跨膜结构域,有叶绿体转运肽等结构,
主要定位于叶绿体中.实时定量PCR结果显示,GmHDR 基因在秦艽的花中进行表达量高,在叶、茎和根等
部位表达较低.GmHDR在序列上与其他植物的 HDR蛋白序列特征上存在很大的相似性;GmHDR 基因主
要在秦艽花中表达,可能主要参与花中萜类物质的合成.该研究结果可为今后研究秦艽环烯醚萜类化合物的
生物合成机制提供依据.
关键词:秦艽;GmHDR;序列分析;表达模式
中图分类号:Q９４３．２,S５６７．２３９　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０５Ｇ０７５５Ｇ０６
Cloningandexpressionanalysisof１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ
２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４Ｇdiphosphatereductasegene
(GmHDR)fromGentianamacrophyla
CENWen１,KONGWeiＧWei１,ZHENGPeng１,HUAWenＧPing１,２∗
(１．KeyLaboratoryoftheMinistryofEducationforMedicinalResourcesandNaturalPharmaceuticalChemistry,National
EngineeringLaboratoryforResourceDevelopmentofEndangeredCrudeDrugsinNorthwestofChina,Collegeof
LifeSciences,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an７１００６２,China;２．DepartmentofLifeSciencesand
Technology,ShaanxiXueqianNormalUniversity,Xi’an７１０１００,China)
Abstract:Secoiridoids,suchasgentiopicroside,arethemainactivecompoundsin“Qinjiao”,atraditionalChinese
herbalmedicinederivedfromthedriedrootsofGentianamacrophylla．Thesecompoundshavewidelybiologicaland
pharmacologicalefects,suchasstomachic,choleretic,antiＧhepatotoxicactivities,antiＧinflammatory,antifungaland
antihistamineactivities．Secoiridoidsbelongedtomonoterpenoid,werebiosynthesizedviathesecoiridoidpathway
收稿日期:２０１４Ｇ０８Ｇ２８　　修回日期:２０１４Ｇ１０Ｇ０７
基金项目:陕西省博士后基金;陕西省科技计划项目(２０１４JQ３１０５,２０１４JQ３１１２);陕西学前师范学院科研基金(１４QNKJ０７８).
作者简介:岑文(１９８７Ｇ),女(布依族),新疆额敏农九师人,硕士研究生,主要从事分子生物学研究,(EＧmail)cenwen＠snnu．edu．cn.
∗通讯作者:化文平,博士,讲师,主要研究药用植物次生代谢,(EＧmail)huawenping＠１２６．com.
(sometimesalsocaled“ridoidpathway”)inhighplant．１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４Ｇdiphosphatereductase
(HDR)isoneofthekeyenzymesinthepathwayofiridoidbiosynthesis．Inthispaper,weclonedthegenesequence
ofHDRfromG．macrophylla,andanalyzedthecharacteristicofsequenceandexpressionpatternsinordertoknow
itsrolesinsecoiridoidbiosynthesis．BasedonourlibrarygeneratedbyhighＧthroughsequencingofG．macrophylla
transcriptome,weclonedHDRgenefromG．macrophylla(namedasGmHDR)byRTＧPCR．AndtheGmHDR
codingaminoacidsequencecharacterization,suchasphysicochemicalcharacteristics,signalpeptide,transitpeptide,
subcelularlocalization,conserveddomainandsecondarystructure,analyzedwithbioinformaticsmethods．Thenwe
alsodetectedtheexpressionpatternsofGmHDRindiferentpartsofG．macrophyllabyrealtimePCR．One１６３０Ｇ
bplengthsequenceofGmHDRgenewasobtainedfromG．macrophylla．GmHDRcontainsacompletedopenreadＧ
ingframe(ORF)of１３９２bp,whichencodedapolypeptidewith４６３aminoacids．GmHDR,theencodingproteinby
GmHDR,hashighhomology(identities≥ ８４％)toHDRproteinsfromRauvolfiaverticillata,Tanacetum
partheniumandotherplants．OneneighborjoiningtreewasconstructedtoshowevolutionshipbetweenGmHDRand
HDRproteinsfromotherplantsusingMEGA５．２soft．ThephylogenetictreealsogaveasameconclusionthatGmＧ
HDRhadaclosedrelationwithHDRproteinsfromCatharanthusroseusandRauvolfiaverticillata．Furtheranalysis
withbioinformaticsmethodsshowedthatGmHDRwasoneproteinwithouttransmembranedomain,andhadone
transitpeptidewith３６aminoacidspredictedwithChloroPserver．TheseindicatedthatGmHDRproteinmightbeloＧ
catedinthechloroplast．RealtimequantitativePCRresultsshowedthatGmHDRhadaveryhighexpressionlevelin
theflowersofG．macrophylla,andGmHDRgeneexpressedlowerinroots,stemsandleavesofGentianamacroＧ
phylla．Conclusion:ThesequenceofGmHDRhadalotofsimilarfeatureswithHDRproteinsfromotherplants,
suchasconservedfourＧcysteinesites,transitpeptideintheirNterminal．GmHDRmainlyexpressedintheflowersof
G．macrophylla．TheseresultsindicatedthatGmHDRmaybeprincipalinvolvedinterpenoidbiosynthesis,whichare
accumulatedinflowersofG．macrophylla．TheresearchisnotonlyveryhelpfulforresearchonHDRrolesin
G．macrophylla,butalsowillaythefoundationforthefurtherstudyonbiosyntheticpathwayofsecoiridoidcomＧ
poundsinG．macrophylla．
Keywords:Gentianamacrophylla;GmHDR;sequenceanalysis;expressionpattern
　　秦艽(Gentianamacrophylla)是我国传统的常
用中药,始载于«神农本草经»,列为中品.具有祛风
湿,舒筋络,流利关节,清利湿热退黄疸等作用,临床
用于治疗骨关节病、面神经炎、肛肠疾病等有较好的
疗效(郭伟娜等,２００８).随着中药研究技术的发展,
相继发现了秦艽的一些新的药理作用,如抗肿瘤、调
节中枢神经系统及免疫系统、升血糖等(穆帧强等,
２００９).近年来越来越重视对传统中药的研究、开发
和利用,但由于人们随意采挖,野生秦艽资源面临枯
竭,已严重供不应求.研究药物有效成分合成途径,
利用分子育种来提高药材资源量是缓解中药资源危
机的最佳选择之一.
龙胆苦苷(gentiopicroside)、獐牙菜苷(sweroＧ
side)、獐牙菜苦苷(swertiamarin)等多种裂环烯醚
萜苷类化合物是中药秦艽中的主要有效成分,均属
萜类化合物的衍生物(Weietal．,２０１２).在高等植
物中,类异戊二烯均来源于前体物质异戊烯基焦磷
酸(isopentenyldiphosphate,IPP)和二甲基烯丙基
焦磷酸(dimethylalyldiphosphate,DMAPP).IPP
和DMAPP的合成依赖于两个独立的生物合成途
径:甲羟戊酸途径(MVA)和２Ｇ甲基ＧDＧ赤藓糖醇Ｇ４Ｇ
磷酸途径(MEP)(SeetangＧNunetal．,２００８).１Ｇ羟
基Ｇ２Ｇ甲基Ｇ２Ｇ(E)Ｇ丁 烯 基Ｇ４Ｇ焦 磷 酸 还 原 酶 (１Ｇ
hydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４ＧdiphosphatereＧ
ductase,HDR)是 MEP途径上最后一个关键酶,催
化 羟 甲 基 丁 烯 基Ｇ４Ｇ焦 磷 酸 (hydroxy methyl
butenylＧ４Ｇdiphosphate,HMBPP)生 成 IPP 和
DMAPP(Wangetal．,２００８).目 前 已 从 喜 树
(Wangetal．,２００８)、兰花(Huangetal．,２００９)、杜
仲(刘攀峰等,２０１３)、拟南芥(Hsiehetal．,２００５)、
银杏(Luetal．,２００８)等植物中相继克隆到 HDR
基因.BotelaＧPaviaetal．(２００４)在拟南芥中证明
HDR 基因对紫杉醇的前体物质紫杉二烯合成起主
要调控作用;张雯等(２００８)在银杏中 HDR 基因的
过表达可大幅提高银杏内酯的含量.HDR 基因已
成为萜类代谢工程的理想潜在靶点,其基因结构、生
物学功能与作用机理日益受到关注.在环烯醚萜类
物质含量高达１０％的药用植物秦艽中,HDR 基因
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的研究尚未见相关报道,本研究通 过 对 秦 艽
GmHDR 基因的克隆、相关的生物信息学分析,及
借助realＧtimePCR技术对秦艽不同器官GmHDR
表达量的检测,初步了解GmHDR 的表达规律,以
期为秦艽萜类次生产物的生物合成机制提供参考.
１　材料与方法
１．１植物材料
２０１１年７月于陕西省太白县中药驯化园内采
集花期的秦艽(Gentianamacrophylla)样品及标
本.标本由陕西师范大学生命科学学院田先华教授
进行鉴定.１年龄样品移栽于陕西师范大学试验田
中.按照秦艽根、茎、叶、花四个不同器官部位采集
样品后,用于基因器官特异性表达检测.收集的样
品立即于液氮中速冻,保存至超低温冰箱(Ｇ８０℃)
内以用于总RNA提取.
１．２主要试剂
RNA提取试剂盒购自 OMEGA 公司;SYBR
GreenⅡPremixExTaq和反转录试剂盒均购自
TaKaRa生物公司.
１．３方法
１．３．１秦艽总 RNA 的提取　用 OMGEA 公司的
RNA提取试剂盒分别提取秦艽根茎叶的总RNA,
并以其为模板严格按照反转录试剂盒PrimeScript
􀆿 RTreagentKit(TaKaRa)说明书合成秦艽
cDNA第一条链.
１．３．２GmHDR 基因的克隆　依据实验室高通量数
据 库 中 Unigene５５５９ 基 因 序 列,采 用 Premer
Premier５．０软件在完整 ORF框两端设计引物
(GmHDRＧS:５′ＧCTTTCGTGACTGTTTCTGGTＧ
TCCＧ３′和 GmHDRＧR:５′ＧCACACTCCCACTTTT
TTCCGTAAＧ３′),以反转合成的cDNA为模板,经
RTＧPCR扩增,从秦艽cDNA文库中扩增得到了１
条HDR 基因(命名为GmHDR).
１．３．３GmHDR 蛋白的生物信息学分析　采用生物
信息学软件(http://web．expasy．org/protparam/;
http://www．cbs．dtu．dk/;http://psort．hgc．jp/;
http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)对GmHDR 基因
编码氨基酸序列进行在线分析.分别采用ExPASy
ProtParam﹑SignalP４．１Server(http://www．cbs．
dtu．dk/services/SignalP/)﹑ ChloroP１．１Server
(http://www．cbs．dtu．dk/services/ChloroP/)﹑
TMHMM２．０Server(http://www．cbs．dtu．dk/
services/TMHMM/)﹑ PredictProtein(https://
www．predictprotein．org/home)和NCBIＧCDS等工
具预测蛋白质的理化性质、信号肽、转运肽、跨膜结
构、亚细胞定位及保守结构域;用在线工具SOPMA
及SWISSＧMODEL完成蛋白质二级结构和三维结
构的分析.用BlastX和ClustalW 完成氨基酸序
列的同源性比对和多序列比对.以 MEGA５．２构建
植物HDR蛋白序列的分子进化树.
１．３．４GmHDR 基因的表达分析　以１．３．１中合成
的样品cDNA 稀释５０倍后为模板进行realＧtime
PCR反应.以持家基因βＧactin 为内参(βＧactinS:
５′ＧCATCTGAAACGCTCGGCACCＧ３′和βＧactinR:
５′ＧTGAAAGAAAAACTGGCTTACATCGCＧ３′),
检 测 GmHDR 基 因 的 表 达 量.采 用 Primer
Premier５．０ 设 计 realＧtime PCR 扩 增 引 物
(GmHDRＧS:５′ＧAATACATCTACCACCCACCAＧ
CGAACTＧ３′和 GmHDRＧR:５′ＧGCAACTGGCAＧ
TAAACGATTCTAAACCＧ３′).PCR反应程序为
９５℃３min,９５℃１０s,６０℃３０s,５０个循环.每
个样品重复３次.采用“比较Ct法的相对定量”法
对数据进行分析,并用SPSS１３．０中oneＧwayANOＧ
VA方法进行单因素方差分析,利用Tukeytest分
析各样品间基因表达的显著性(P＜０．０５).
２　结果与分析
２．１GmHDR 基因全长序列的克隆及分析
根据高通量的测序数据,采用PCR扩增得到１
条１６００bp左右的基因片段.经过测序验证,获得
了GmHDR基因片段长１６３０bp(GenBank注册号
为KM０４６９９２),包含１个１３９２bp的完整开放读码
框(OpenReadingFrame,ORF),编码４６３个氨基
酸残基.
２．２GmHDR蛋白的生物信息学分析
２．２．１不同物种之间 HDR 基因所编码蛋白质的同
源性分析　采用NCBI网站BLASTX程序进行蛋
白序列的比对分析,结果显示GmHDR与其他植物
中的HDR蛋白具有很高的同源性,属于LYTB超
蛋白家族成员.其中,GmHDR与长春花(CathaＧ
ranthusroseus,ABI３０６３１．１)、萝芙木(Rauvolfia
verticillata,ABV８９５８２．１)、艾 菊 (Tanacetum
parthenium,AER００４７１．１)、甘 薯 (Ipomoea
７５７５期　 岑文等:秦艽１Ｇ羟基Ｇ２Ｇ甲基Ｇ２Ｇ(E)Ｇ丁烯基Ｇ４Ｇ焦磷酸还原酶基因(GmHDR)的克隆和表达分析
图１　秦艽GmHDR 基因扩增产物凝胶电泳.
M．DNAmarkerD２０００;１．PCR产物.
Fig．１　AgarosegelelectrophoreticanalysisofPCRproducts
ofGmHDR　M．DNAmarkerD２０００;１．PCRproducts．
batatas,ADZ２９０９６．１)、青 蒿 (Artemisiaannua,
ADC８４３４８．１)、丹 参 (Salvia miltiorrhiza,
AGJ０３１４９．１)和 落 叶 松 (Larix kaempferi,
AHA４４８３２．１)等植物HDR蛋白的一致性分别达到
８４％、８４％、８２％、８２％、７９％、７９％ 和 ７６％.
ClustalW多序列比对结果显示GmHDR蛋白序列
和其余植物HDR蛋白一样拥有４个保守的半胱氨
酸残基(图２),有研究预测其可能与铁硫桥的协调
及酶催化作用有关(Huangetal．,２００９).利用软件
MEGA５．２,选用 NeighborＧJoining方法,以最适算
法模型JTT＋G＋I＋f,构建不同物种 HDR蛋白的
系统进化树(图３).对不同物种的分子系统进化进
行分析,结果显示 GmHDR与长春花和萝芙木的
HDR最接近.
２．２．２GmHDR蛋白的特性分析　ProtParam软件
预测结果显示GmHDR蛋白的理论等电点为５．４４,
分子质量为５２．２２kDa,蛋白不稳定系数(instability
indexII)为３１．１４,属于稳定类蛋白.利用SOPMA
程序对GmHDR氨基酸序列的二维结构进行预测,
结果显示GmHDR的蛋白二级结构组成为αＧ螺旋
占４５．１４％、βＧ转角占６．２６％、无规卷曲占３４．３４％和
延伸链占１４．２５％.用 TMHMM ２．０Server对
GmHDR蛋白进行跨膜结构域的预测,结果显示
GmHDR蛋白没有跨膜螺旋.利用 SignalP４．１
ServerＧprediction对GmHDR蛋白进行信号肽的预
测,结果显示GmHDR蛋白没有信号肽,非分泌蛋
白.利用ChloroP１．１Server对GmHDR蛋白进行
转运肽的预测,结果显示GmHDR蛋白含有转运肽
序列为３６个氨基酸残基.结合PredictProtein对
GmHDR蛋白的亚细胞定位,显示该蛋白主要定位
于叶绿体(可信度７．０).
２．３GmHDR基因的表达分析
植物次生代谢产物的分布往往具有很强的器官
特异性,其相关基因的表达同样也有器官特异性.
以秦艽的根、茎、叶、花为材料,选择秦艽actin为内
参,对秦艽不同器官中GmHDR 基因表达水平进行
实时荧光定量检测.结果显示,GmHDR 在秦艽的
所有被测组织中均有表达,但表达水平不同,在花中
表达水平最高,显著高于其他组织;而根、茎、叶间的
表达差异不显著(图４).
３　讨论
MEP途径是高等植物萜类合成的一条重要途
径,对于植物生存必不可少.HDR作为 MEP途径
上最后一个限速酶,对萜类物质合成起重要调控作
用.如在黄花蒿中过表达HDR 和ADS 可以提高
青蒿素的产量(龙世平,２０１３);而拟南芥的HDR 无
义突变株中因类胡萝卜素合成缺陷表现出白化
(Huangetal．,２００９).HDR 基因在喜树、兰花等
植物的不同器官部位中的表达量存在很大差异,而
在同一植物不同器官部位的萜类代谢物的类型和含
量也存在类似差异(Wangetal．,２００８;Huanget
al．,２００９).因此,在药用植物秦艽中其主要有效成
分在根中富集,研究GmHDR 在药用植物秦艽不同
器官中的表达模式对进一步了解龙胆苦苷等萜类代
谢物的生物合成具有重要意义.
本研究中秦艽GmHDR 在所有被测组织中均
有所表达,从一定程度上反应了 MEP途径中产生
的异戊烯基焦磷酸用于合成叶绿素等异戊二烯类物
质对植物生长发育的重要性.另外其表达模式与喜
树CaHDR、拟南芥AtHDR 和兰花OncHDR 的表
达模式类似,均为在花中的表达水平最高,显著高于
在根、茎、叶中的表达量.但兰花和拟南芥中HDR
在叶中的表达量要高于根中的表达量,与秦艽和喜
树中HDR在根中的表达水平略高于叶的表达特征
不同(Wangetal．,２００８;Hsiehetal．,２００５;Huang
etal．,２００９).这与不同器官组织中的类胡萝卜素
等萜类物质的含量相关(Huangetal．,２００９).
植物 MEP途径中的基因都具有N端的转运肽
序列,这对蛋白质从细胞质基质到叶绿体至关重要
(RodríguezＧConcepciónetal．,２００２).本研究进一
步证明了此观点,秦艽 HDR蛋白N端具有转运肽
８５７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
图２　GmHDR氨基酸序列与其它物种 HDR氨基酸序列的系统进化树　▲ 表示cysteine残基位点
Fig．２　PhylogeneticanalysisofGmHDRproteinwithotherrelatedproteins　CrHDR(ABI３０６３１．１);IbHDR(ADZ２９０９６．１);
TpHDR(AER００４７１．１);AaHDR(ADC８４３４８．１);GbHDR(ABC８４３４４．１);▲showedsitesofcysteine．
序列,定位于叶绿体,这与赤松、拟南芥、银杏和火距
松等中HDR蛋白的亚细胞定位结果一致(Kimet
al．,２００８,２００９).同时也符合 MEP途径的细胞定
位.因而可以推断GmHDR蛋白参与了秦艽 MEP
途径的萜类合成过程.
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图３　秦艽 GmHDR与不同植物中的 HDR的序列
比对
Fig．３　 MultiplealignmentofGmHDRofGentiana
macrophyllawithHDRsinotherplants　RauvolfiavertiＧ
cillata(ABV８９５８２．１),Picrorhizakurrooa (ABM８９２２６．１),Hevea
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(ABC８４３４４．１),G．biloba１(ABB７８０８８．１),G．biloba２(ABBＧ
７８０８９．１),Larixkaempferi(AHA４４８３２．１)．
图４　GmHDR 在秦艽不同部位中的表达
Fig．４　GmHDRgeneexpressionindifferentorgans
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