全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Jul．２０１４,３４(４):４５５－４５９　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０４．００５
吴柳杰,张永先,凌桂芝,等．铝胁迫下黑麦和小麦根尖分泌有机酸的研究[J]．广西植物,２０１４,３４(４):４５５－４５９
WuLJ,ZhangYX,LingGZ,etal．SecretionoforganicacidsfromrootapicesunderAlstressinryeandwheat[J]．Guihaia,２０１４,３４(４):４５５－４５９
铝胁迫下黑麦和小麦根尖分泌有机酸的研究
吴柳杰,张永先,凌桂芝∗,黎晓峰
(广西大学 农学院,南宁５３０００５)
摘　要:通过建立的活体根培养及微量根尖分泌物收集系统,对铝胁迫下黑麦和小麦根尖分泌的有机酸进行
研究.结果表明:５０、１００、２００、３００μmol􀅰LＧ１AlCl３处理后黑麦根尖分泌柠檬酸和苹果酸,而铝仅诱导小麦根
尖分泌苹果酸.铝处理３h后,根尖分泌的苹果酸显著增加,并在９h内维持较高的分泌速率.铝诱导黑麦根
尖分泌柠檬酸有明显的迟缓期,Al(３００μmol􀅰LＧ１)处理后的最初３h,根尖分泌的柠檬酸并不显著增加.在铝
溶液中添加的阴离子通道抑制剂AＧ９ＧC(２０、６０、１００μmol􀅰LＧ１)显著抑制根尖分泌有机酸.然而,将黑麦根尖
浸泡于含异三聚体G蛋白激活剂霍乱毒素(５０ng􀅰mLＧ１)后,根尖分泌的有机酸显著增加.说明建立的微量
根尖分泌物收集系统适合于铝诱导根尖分泌有机酸的研究,小麦和黑麦根尖在铝胁迫下以不同模式通过阴离
子通道分泌有机酸,而异三聚体G蛋白可能介导根尖分泌有机酸.
关键词:铝;根尖;有机酸;分泌
中图分类号:Q９４５．７８　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０４Ｇ０４５５Ｇ０５
Secretionoforganicacidsfromrootapices
underAlstressinryeandwheat
WULiuＧJie,ZHANGYongＧXian,LINGGuiＧZhi∗,LIXiaoＧFeng
(CollegeofAgriculture,GuangxiUniversity,Nanning５３０００５,China)
Abstract:Secretionoforganicacidsfromrootsapicesinryeandwheatwereinvestigatedbyasystemforinvivoroot
apexcultureandmicroＧexudatescolection,toelucidatethemechanismsforAlＧinducedsecretionoforganicacids．The
resultsshowedthatAl(５０,１００,２００,３００μmol􀅰LＧ１AlCl３)inducedsecretionofcitrateandmalatefromryerootapiＧ
ces,whilewheatrootapicessecretedmalatealoneinresponsetoAltreatment．Malatewassignificantlysecretedfrom
rootapicesofryeandwheatafterthetreatmentwithAlfor３h,andmalatewassecretedwithahighsecretionrate
within９htreatment．TherewasalagbetweenthesecretionofcitrateandAltreatmentinrye．Atinitial３h,Alfailed
toinducesignificantlysecretionofcitrate．Ontheotherhand,theaddictionofanionchannelinhibitorAＧ９ＧC(２０、６０、
１００μmol􀅰LＧ１)toAlsolution,thesecretionoforganicacidswassignificantlyinhibited．However,theamountoforＧ
ganicacidssecretedelevatedsignificantlyaftertheexposureofrootapicestoAlsolutionwithheterotrimericGＧprotein
agonistcholeratoxin(５０ng􀅰mLＧ１)．TheseresultssuggestedthatoursystemforinvivorootapexcultureandmiＧ
croＧexudatescolectionwasaavailabletoolforthestudiesonAlＧinducedsecretionoforganicacids,andorganicacids
weresecretedfromrootapicesofryeandwheatbyanionchannelsindiferentpatterns,whileheterotrimericGＧprotein
maymediatethesecretionoforganicacidsfromrootapices．
Keywords:Aluminum;rootapex;organicacids;secretion
收稿日期:２０１４Ｇ０１Ｇ２８　　修回日期:２０１４Ｇ０３Ｇ０９
基金项目:国家自然科学基金(３０７７１２８７,３１２６０７０４９７)
作者简介:吴柳杰(１９９０Ｇ),女(侗族),广西三江人,硕士研究生,研究方向为植物营养与环境生态,(EＧmail)５２６５５１６１２＠qq．com.
∗通讯作者:凌桂芝,硕士,实验师,从事逆境植物学研究,(EＧmail)lgz５１５＠１２６．com.
　　过多的铝离子是酸性土壤中植物生长的主要障
碍因子(Foy,１９８８).根伸长受阻是植物对铝毒害
原初反应(Delhaizeetal．,１９９３a;Ma,２０００).伴随
着根系生长受阻,铝也抑制植物对养分和水分的吸
收,进而导致地上部生长受阻,产量下降.在长期的
进化过程中一些植物逐渐形成了适应酸性土壤环境
的机制.这些机制可分为两种不同的类型,即排铝
机制和内部耐铝机制 (Taylor,１９９１;Kochian,
１９９５).一些耐铝植物种类或品种在铝胁迫下分泌
的有机酸能与铝螯合形成毒性较低的有机化合物,
从而解除铝的毒害 (Ma,２０００;Lietal．,２０００,
２００９).因此,铝诱导根尖分泌有机酸被认为是一种
重要的排铝机制(Ma,２０００;Kochianetal．,２００５).
这些有机酸是铝胁迫的专一性反应,主要从根尖离
子通道蛋白分泌并受有机酸代谢及有机酸转运子基
因及转录因子所调控(Delhaizeetal．,１９９３b,２０１２;
Dingetal．,２０１４;Lietal．,２０００,２００９;Sunetal．,
２０１４;Yangetal．,２０００).
有机酸分泌特性及相关机制的研究多采用根系
或离体根尖为材料,人们对根尖在铝胁迫下分泌有
机酸机制的认识还不充分.因此,本研究自主设计
了幼苗培养及活体根尖分泌物收集的微型装置,研
究了铝胁迫下黑麦和小麦活体根尖分泌有机酸的特
点,旨在为铝诱导根尖有机酸分泌的研究提供理论
依据和技术支撑.
１　材料与方法
１．１实验材料
供试的黑麦品种为 King(Secalecerealecv．
King),小麦品系为ETＧ８(Triticumaestivum).
１．２植株培养
１．２．１根尖培养及有机酸分泌物收集系统　幼苗培
养及活体根尖分泌物收集的微型装置由根尖室(A
室,１０mm×５０mm)、隔离室(B室,１０mm×５０
mm)和保护室(C室,１２０mm×５０mm)组成(图
１).幼根经A、B、C室间的卡槽平置于装置中,其中
根尖(０~１０mm)置于 A室,根基端置于C室.B
室注３％的琼脂(４０℃),在供试根摆好根尖后注入
以固定根系并阻隔A、C室溶液.琼脂凝固后,分别
在A、C加入处理溶液和氯化钙溶液(０．５mmol􀅰
LＧ１,pH４．５).在装置上方用湿润的虑纸覆盖以避免
处理溶液挥发.
图１　活体根尖培养及其分泌物微量收集系统
Fig．１Thesystemforinvivorootapexculture
andmicroＧexudatescolection
１．２．２供试植物培养　参照Lietal．(２０００)的方法
培养幼苗.每日的光照与黑暗培养时间分别为１０
和１４h,对应温度分别为２５℃和２０℃.３日龄幼
苗为供试材料.
１．３根尖分泌物的收集及处理方案
分别将小麦、黑麦根尖置于上述装置中,在 A
室加入含０．５mmol􀅰LＧ１氯化钙的处理溶液１．０
mL.各处理均设３个重复.处理结束后,以移液器
收集处理溶液于离心管中,在１００００×g离心力下
离心,取上清液测定其中有机酸.
０、５０、１００、２００、３００μmol􀅰LＧ１AlCl３溶液,处理
６h;０、１００μmol􀅰LＧ１AlCl３溶液,处理９h,期间每３
h收集一次根尖分泌物,每次收集后立刻加入相同
处理溶液,直至试验结束;０、２０、６０、１００μmol􀅰LＧ１
９ＧAＧC(阴离子通道抑制剂)溶液(含１００μmol􀅰LＧ１
AlCl３);３００μmol􀅰LＧ１AlCl３(Control),３００μmol􀅰
LＧ１AlCl３含５０ng􀅰mLＧ１霍乱毒素(CTX)及１００
μmol􀅰LＧ１９ＧAＧC(CTX＋９ＧAＧC).
１．４有机酸的测定
根尖分泌的苹果酸和柠檬酸采用酶动力学Ｇ分
光光度法测定(Lietal．,２０００).
１．５数据处理与分析
试验数据采用Duncan新复极差法进行差异显
著性检验.
２　结果与分析
采用本研究建立的系统,成功收集黑麦和小麦
在铝胁迫下根尖分泌的有机酸(图２、图３).虽然铝
并不能诱导小麦根尖分泌柠檬酸,但铝胁迫下根尖
分泌的苹果酸显著增加.５０μmol􀅰LＧ１AlCl３处理６
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h后,小麦根尖分泌的苹果酸为(０．１７±０．０３)nmol􀅰
apexＧ１,是对照处理[０μmol􀅰LＧ１ AlCl３,(０．１０±
０．０３)nmol􀅰apexＧ１]的１．７倍.当 AlCl３处理浓度
增加至１００μmol􀅰LＧ１,苹果酸分泌量达到(０．６９±
０．１２)nmol􀅰apexＧ１,是对照处理的６．９倍.然而,
铝处理浓度高于２００μmol􀅰LＧ１,小麦根尖分泌的苹
果酸并不进一步增加.
铝能诱导黑麦根尖分泌苹果酸和柠檬酸(图
３).铝胁迫下黑麦根尖大量分泌苹果酸,且分泌量
随着铝处理浓度的升高而升高.５０、１００、２００、３００
μmol􀅰LＧ１的AlCl３处理后,苹果酸的分泌量分别为Ｇ
Al(０μmol􀅰LＧ１AlCl３,对照)处理的５．６、８．９、４６．３、
７４．２倍.５０μmol􀅰LＧ１AlCl３的处理黑麦根尖即显
著分泌柠檬酸,其分泌量是对照的２．８倍.但铝浓
度高于５０μmol􀅰LＧ１的处理柠檬酸分泌量的增加不
显著.
图２　铝(Al)诱导小麦根尖分泌有机酸　误差线代表±
标准误,同种有机酸的小写字母表示差异显著,P＜０．０５,下同.
Fig．２　AlＧinducedorganicacidssecretionfrom wheat
rootapices　Verticalbarsrepresent±SD(n＝３)．LowercaseletＧ
tersmeansignificantdiference,P＜０．０５．Thesamebelow．
　　不同铝处理时间小麦根尖苹果酸分泌率有明显
差异(图４).铝处理后的最初３h,小麦根尖苹果酸
分泌速率达对照的８倍.随着铝处理时间的延长,
苹果酸分泌率呈上升趋势,但９h后分泌速率明显
放缓,但在铝处理后的６~９h,苹果酸的分泌速率
依然达０~３h的４．４倍.在铝处理后的９~１８h,
苹果酸持续分泌.这些结果说明小麦根尖以模式I
分泌有机酸.
铝对黑麦根尖分泌柠檬酸和苹果酸的诱导过程
明显不同(图５).与小麦根尖苹果酸分泌模式相
似,在铝处理后最初３h,根尖分泌的苹果酸约为对
照的７倍.但是,在开始铝处理的前３h,柠檬酸分
图３　铝诱导黑麦根尖分泌有机酸
Fig．３　AlＧinducedorganicacidssecretionfromryerootapices
图４　小麦根尖分泌苹果酸的历程
Fig．４　Timecourseofmalatesecretionfrom
wheatrootapicesunderAltreatment
泌率与对照处理间的差异不显著.但随着铝处理时
间的延长,柠檬酸分泌量均呈上升趋势.这些结果
说明黑麦根尖以模式II分泌柠檬酸.
AＧ９ＧC为阴离子通道抑制剂.采用２０、６０、１００
μmol􀅰LＧ１AＧ９ＧC处理后,小麦根尖分泌的苹果酸被
显著抑制(图６).虽然２０μmol􀅰LＧ１AＧ９ＧC对铝诱
导黑麦根尖柠檬酸分泌的抑制不显著,但显著抑制
苹果酸分泌.AＧ９ＧC处理浓度增至６０、１００μmol􀅰
LＧ１后,黑麦根尖柠檬酸和苹果酸分泌量分别相当于
对照处理的４６％、３０％和３３％和３４％.这说明阴
离子通道是根尖分泌有机酸的有效途径.
霍乱毒素(CTX)是异三聚体G蛋白的激活剂.
在铝处理溶液中加入５０ng􀅰mLＧ１的CTX后,黑麦
根尖有机酸分泌量显著增加(P＜０．０５)(图７).然
而,在溶液中添加 AＧ９ＧC后,有机酸的分泌显著受
阻,说明阴离子通道也介导铝胁迫下CTX诱导的
有机酸分泌.
７５４４期　　　　　　　　　吴柳杰等:铝胁迫下黑麦和小麦根尖分泌有机酸的研究
图５　黑麦根尖分泌有机酸的历程
Fig．５　Timecourseofmalate(A)andcitrate(B)secretionfromwheatrootapicesunderAltreatment
图６　AＧ９ＧC对铝诱导的小麦(A)和黑麦(B)根尖有机酸分泌的影响
Fig．６　EfectofAＧ９ＧConAlＧinducedorganicacidssecretionfromrootapicesofwheat(A)andrye(B)
图７　霍乱毒素对铝诱导黑麦根尖分泌有机酸的影响
Fig．７　EfectofcholeratoxinonAlＧinducedsecretion
oforganicacidsfromrootapicesofrye
３　讨论
分泌物的分泌特性是根系生物学研究的重要领
域,分泌物的收集是开展相关研究的前提.铝胁迫
下根系分泌物的研究方法主要采用根系收集法和离
体根收集法.根系收集法采用大容量(１~５L)培养
杯培养植株,形成大量根系后进行铝处理并收集根
系分泌物进行研究.该方法有明显不足处,包括①
操作步骤繁多,培养时间长(１２~２０d),培养条件较
难控制,研究结果的重现性较差;②只适合于根系分
泌物的研究,难以开展根尖分泌物的研究;③处理液
体积大,研究成本高,药品用量大,不适用价格昂贵
的药理学研究.离体根尖收集法虽然可收集根尖分
泌物,但供试材料为离体根尖,活性较低,研究结果
不一定反映活体植株的真实状况,且切口渗漏液也
干扰研究结果.
本研究建立了基于活体根尖分泌物研究的植株
培养及微量有机酸分泌物收集系统.采用本系统进
行的有机酸分泌的研究结果表明,黑麦和小麦根尖
在铝胁迫下分别分泌柠檬酸、苹果酸两种有机酸和
苹果酸.有机酸的分泌与铝的处理浓度和处理时间
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有关.小麦和黑麦分泌有机酸的模式不同.阴离子
通道是铝胁迫下有机酸的分泌主要通道.这些特点
与采用根系收集法开展的根系有机酸分泌结果一致
(Lietal．,２０００,２００９;Yangetal．,２０００;Delhaizeet
al．,１９９３b).这些结果说明,本研究建立的植株培
养及有机酸分泌物收集微型系统适合于铝胁迫下根
尖分泌有机酸的研究.
采用根系为材料(Lietal．,２０００)的研究发现,
铝诱导小麦和黑麦根系苹果酸分泌速率分别在开始
铝处理后的２h和１０h左右达最高.本研究中,铝
对黑麦根尖分泌有机酸的诱导过程与根系分泌的诱
导过程相似(Lietal．,２０００).然而,小麦根尖分泌
苹果酸的诱导过程与根系的过程不同.铝处理９h
后,苹果酸的分泌速率方达高峰.由于在小麦根系
中次生根的数量远高于种子根的数量,本研究结果
说明小麦次生根与种子根在铝胁迫下苹果酸分泌效
率方面可能有所差异.可见,本研究建立的系统能
更详尽的反映铝诱导根尖分泌有机酸的信息.
在本研究建立的微量有机酸分泌物收集和分析
系统中,根尖处理溶液的体积可少至１．０mL,因此
可以最大限度地减少研究费用.霍乱毒素(CTX)
是异三聚体G蛋白激活剂,它催化异三聚体G蛋白
ADP核糖基化使异三聚体G蛋白α亚基处于活性
状态(Simonetal．,１９９１).CTX是探测异三聚体G
蛋白介导的细胞信号的重要工具,广泛应用于异三
聚体 G 蛋白介导的细胞信号研究中(Maetal．,
１９９９).本研究采用微量有机酸分泌物收集和分析
系统,研究CTX对黑麦根尖在铝胁迫条件下有机
酸分泌的效应,CTX用量仅为常规根系分泌物分析
系统(以１L体积计)的千分之一.CTX处理后黑
麦根尖在铝胁迫下分泌的柠檬酸和苹果酸增加(图
７),暗示异三聚体G蛋白可能介导铝诱导有机酸的
分泌.
总之,本研究建立的根尖培养及微量分泌物收
集系统是经济有效的有机酸分泌物研究系统,可应
用于铝胁迫下有机酸分泌机制的研究;铝胁迫下黑
麦和小麦根尖可以不同模式通过阴离子通道分泌有
机酸,而异三聚体G蛋白可能会介导铝诱导有机酸
的分泌.
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