全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ　３２（１）：１１８－１２３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ２０１２年１月　
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１２．０１．０２３
茅苍术愈伤组织诱导及其细胞悬浮培养研究
陶金华１，濮雪莲１，江　曙２
（１．南通大学 医学院，江苏 南通２２６０１９；２．南京中医药大学 药学院，南京２１００４６）
摘　要：采用正交试验法研究了不同的植物生长调节剂对茅苍术叶柄、叶片和根茎愈伤组织诱导的影响，结
果表明，不同外植体在各自的最佳培养条件下，叶柄、叶片和根茎愈伤组织的诱导率分别为９９．０％、８３．５％和
７１．５％，以叶柄的培养效果最好，其中２，４－Ｄ对茅苍术愈伤组织的诱导具有极显著的效果，在各种植物生长调
节剂组合中，诱导叶柄愈伤组织形成的最佳组合为０．４ｍｇ·Ｌ－１　ＮＡＡ、４．０ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ和０．４ｍｇ·Ｌ－１　ＫＴ，
培养２０ｄ左右，诱导率达到９９．０％。此外，将茅苍术叶柄细胞悬浮培养至１８ｄ时，细胞量、多糖和苍术素的含
量均达到最大值，分别为９．０７ｇ·Ｌ－１、１５．６８ｍｇ·Ｌ－１和１９．６２ｕｇ·Ｌ－１。
关键词：茅苍术；愈伤组织；细胞悬浮培养
中图分类号：Ｑ９４５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１０００－３１４２（２０１２）０１－０１１８－０６
＊ Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
ＴＡＯ　Ｊｉｎ－Ｈｕａ１，ＰＵ　Ｘｕｅ－Ｌｉａｎ１，ＪＩＡＮＧ　Ｓｈｕ２
（１．Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｎａｎｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｔｏｎｇ　２２６０１９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００４６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｎ　ｐｅｔｉｏｌｅ，ｌｅａｆ　ａｎｄ　ｒｈｉｚｏｍｅ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｏｒ－
ｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ．Ｉｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｐｅｔｉｏｌｅ，ｌｅａｆ　ａｎｄ　ｒｈｉｚｏｍｅ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗｅｒｅ　９９．０％、８３．５％ａｎｄ
７１．５％ｉｎ　ｔｈｅｉｒ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｎｄ　Ｐｅｔｉｏｌｅ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｅａｓｙ　ｔｏ　ｆｏｒｍ　ｃａｌｕｓ．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　２，４－Ｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｐｅｔｉｏｌｅ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ
０．４ｍｇ·Ｌ－１　ＮＡＡ、４．０ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ　ａｎｄ　０．４ｍｇ·Ｌ－１　ＫＴ；ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｒｅａｃｈｅｄ　９９．０％ ｗｈｅｎ　ｐｅｔｉｏｌｅ　ｂｅｉｎｇ
ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　２０ｄ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｗｈｅｎ　ｃｅｌ　ｆｒｏｍ　ｐｅｔｉｏｌｅ　ｃａｌｕｓ　ｗａｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　１８ｄ，ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｙｉｅｌｄｓ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｂｉｏ－
ｍａｓｓ，ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｎｄ　ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｎ　ｗｅｒｅ　９．０７ｇ·Ｌ－１、１５．６８ｍｇ·Ｌ－１　ａｎｄ　１９．６２ｕｇ·Ｌ－１ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ；ｃａｌｕｓ；ｃｅｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ
　　中药材茅苍术（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ），习称南
苍术，是菊科苍术属茅苍术的干燥根茎，江苏茅山是
其优质道地产区，故而得名茅苍术。根据《神农本草
经》史记，茅苍术具燥湿健脾、祛风散寒、明目等功
效，主治脘腹胀满、泄泻、水肿、风湿痹痛、风寒感冒
等。近年来，国内外对茅苍术化学成分及其药理学
研究表明，茅苍术根茎主要含有苍术素等活性成分；
此外，还含有多糖、糖苷等一些水溶性活性成分以及
铁、锌、镁、钙等多种人体必需的微量元素（郭兰萍
等，２００２；Ｊｕｎｉｃｈｉｋ等，２００３；王喜习等，２００８）。这些
成分具有保肝、抗心率失常、降血糖、抗菌、抗病毒、
免疫调节及抗肿瘤等多种生物学活性（Ｉｎａｇａｋｉ等，
２００１；Ｙｕ等，２００１；Ｎａｋａｉ等，２００３）。由于过度开采
以及茅苍术本身野外繁殖能力低，使得野生茅苍术
资源日益稀缺，甚至面临濒危（陈佳昕等，２００８；付梅
红等，２００９；陶金华等，２０１０）。因此，通过开展茅苍
＊ 收稿日期：２０１１－０７－２３　　修回日期：２０１１－１１－２４
基金项目：国家自然科学基金（８１１０２７４３）；江苏省高校自然科学基础研究项目（０７ＫＪＤ３６０１６４）；江苏省中医药局项目（ＨＬ０７０７６）［Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（８１１０２７４３）；Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｈｉｇｈｅｒ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（０７ＫＪＤ３６０１６４）；
Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｏｆ　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（ＨＬ０７０７６）］
作者简介：陶金华（１９８４－），女，江苏南通人，硕士，从事微生物与药用植物品质等研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｔａｏｊｉｎｈｕａ２０００＠１６３．ｃｏｍ。
术组织培养、人工栽培等研究，将在保护野生资源、
满足国内外用药需求等方面发挥重要作用。目前国
内外对茅苍术品质的研究主要集中于化学成分及外
部环境因子（气候因子、光照、土壤、水分）等方面（郭
方遒等，２００８；孙宇章等，２００８），而采用正交试验法
系统研究不同的植物生长调节剂对茅苍术不同外植
体愈伤组织诱导的影响，以及采用细胞悬浮培养法
比较同一条件下植物生长调节剂对叶柄、根茎细胞
生长及活性成分合成的差异国内外尚未见相关的报
道，本论文通过研究不同植物生长调节剂对茅苍术
不同外植体愈伤组织诱导的影响，并建立茅苍术细
胞悬浮培养方法，以期为缓解濒危药材茅苍术资源
紧张态势，提高茅苍术栽培品质及其可持续利用探
索新的途径。
１　材料与方法
１．１材料
（１）外植体：实验材料采自江苏茅山地区茅苍术
（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ）的新鲜植株。（２）培养基：愈
伤组织诱导培养基是在 ＭＳ培养基中添加不同浓度
的ＮＡＡ、２，４－Ｄ、ＫＴ；细胞悬浮培养基除了不添加
琼脂外，其它成分组成和愈伤组织诱导培养基相同。
实验中所采用化学试剂为分析纯。（３）仪器与设备：
净化工作台（ＳＷ－ＣＪ－１ＦＢ，苏州净化设备有限公司），
紫外可见分光光度计（７５２型，上海光学仪器有限公
司），ＨＰ１１００高效液相色谱仪（四元梯度泵、在线真
空脱气机、柱温箱和二极管阵列检测器（ＤＡＤ）。
１．２方法
１．２．１愈伤组织诱导　选取生长健壮的茅苍术幼嫩
叶片、叶柄、根茎部位，用自来水反复冲洗干净后，依
次用７５％乙醇消毒３０ｓ，０．１％升汞消毒１０ｍｉｎ，无
菌水冲洗５次后，切成３～５ｍｍ小段，接种于含有
不同植物生长调节剂的 ＭＳ培养基中，２５℃进行培
养，按正交试验设计进行，每项试验平行做２组，每
组接种１００个外植体，２０ｄ后统计愈伤组织诱导结
果。愈伤组织诱导率＝形成愈伤组织的外植体数／
接种的外植体数×１００％。
１．２．２细胞悬浮培养体系的建立　将愈伤组织继代
培养２～３次后，选取生长旺盛，质地疏松的愈伤组
织约２．０ｇ，接种于装有３００ｍＬ　ＭＳ液体培养基的
１　０００ｍＬ三角瓶中，２５℃，１２０ｒｐｍ悬浮振荡培养。
５ｄ继代１次，连续继代２～３次，将细胞悬浮培养物
用８０目镍网过滤，滤液分装后继续培养，作为起始
悬浮培养液。每隔３ｄ取５瓶细胞培养液进行离心
（５　０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）后，于６０℃烘干，测定细胞干重。
１．２．３细胞多糖的测定　蒽酮－硫酸比色法（江曙
等，２００９）：在每份茅苍术细胞干燥物中加入１０ｍＬ
蒸馏水，超声提取２次，每次３０ｍｉｎ，过滤。Ｓｅｖａｇ
法除蛋白，在提取液中加入等量的氯仿：正丁醇为５
∶１的混合溶液，振荡混匀，离心（５　０００ｒｐｍ，１５
ｍｉｎ）。取上清液，加入４倍量无水乙醇，４℃冰箱放
置过夜，离心（５　０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ），沉淀物６０℃干
燥后，加入２ｍＬ蒸馏水，即得茅苍术细胞粗多糖溶
液，测定时稀释。分别取１．０ｍｇ·ｍＬ－１的标准葡萄
糖溶液０，１，２，３，４，５，６ｍＬ，用蒸馏水定容至５０ｍＬ
后，各取１ｍＬ于具塞试管中，再分别加入４ｍＬ
０．２％蒽酮一硫酸试剂（冰水浴中），然后沸水浴１０
ｍｉｎ，取出冷却至室温放置１０ｍｉｎ后，在６２０ｎｍ处
测定标准葡萄糖溶液的吸光度，以吸光度（ｙ）为纵
坐标，葡萄糖浓度（ｘ，ｍｇ·ｍＬ－１）为横坐标，得到回
归方程：ｙ＝２９．４５９ｘ＋０．０５４，ｒ＝０．９９９２。取１ｍＬ
茅苍术细胞粗多糖的稀释液，加人４ｍＬ　０．２％蒽
酮－硫酸试剂（冰水浴中），其他操作步骤同标准曲线
制作，在６２０ｎｍ处测吸光度，计算茅苍术细胞多糖
的含量。
１．２．４苍术素含量的测定　将茅苍术悬浮细胞培养
液于５　０００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎ，弃上清液，在细胞沉淀
物中加入２０ｍＬ乙酸乙酯超声提取２次，每次３０
ｍｉｎ，然后进行提取液的浓缩，得样品溶液，测定时
稀释。色谱条件：色谱柱：Ｐｏｌａｒｉｓ　５μＣ１８－Ａ，２５０
ｍｍ×４．６ｍｍ（Ｍｅｔａｃｈｅｍ）；柱温：２５℃；进样体积
１０μＬ；检测波长３４０ｎｍ；流速１．０ｍＬ·ｍｉｎ－
１；流动
相∶乙腈（Ａ）－水（Ｂ）８５∶１５。此外，精密称取苍术
素对照品适量，用甲醇配成１．２４６ｇ·Ｌ－１左右的储
备液，避光保存。以峰面积为纵坐标，苍术素浓度
（ｍｇ·Ｌ－１）为横坐标作图，即得回归方程：Ｙ＝９
７８９．９　Ｘ－７２４．１，ｒ＝０．９９９６，苍术素在７７．９～６２３．０
ｍｇ·Ｌ－１范围内呈良好的线性关系。
１．２．５正交试验设计　对茅苍术不同外植体愈伤组
织的诱导试验均设计成４因素３水平（表１）。
２　结果与分析
２．１植物生长调节剂对茅苍术不同外植体愈伤组织
诱导的影响
２．１．１植物生长调节剂对茅苍术叶柄愈伤组织诱导
９１１１期　　　　　　　　　陶金华等：茅苍术愈伤组织诱导及其细胞悬浮培养研究
的影响　茅苍术叶柄在含有不同植物生长调节剂的
ＭＳ培养基上培养１０ｄ左右，在切口处可见半透明
的愈伤组织，随着培养时间的延长颜色逐渐变为黄
白色。经培养２０ｄ后，进行愈伤组织诱导率的统
计，根据极差Ｒ的大小，其影响顺序为Ｂ＞Ａ＞Ｃ。
直观分析可知，茅苍术叶柄愈伤组织诱导的最佳植
物生长调节剂配比是 Ａ１Ｂ２Ｃ２，即在 ＭＳ培养基中
添加０．４ｍｇ·Ｌ－１　ＮＡＡ、４．０ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ和０．４
ｍｇ·Ｌ－１　ＫＴ，诱导率达到９９．０％。通过方差分析可
知，ＮＡＡ和２，４－Ｄ对叶柄愈伤组织均产生极显著
的诱导效果，而ＫＴ为不显著因素（表２、表３）。
表１　植物生长调节剂对茅苍术外植体愈伤
组织诱导的正交试验因素水平表
Ｔａｂｌｅ　１　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｎ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
水平
Ｌｅｖｅｌ
因素Ｆａｃｔｏｒ
Ａ　ＮＡＡ，ｍｇ·Ｌ－１　 Ｂ　２，４－Ｄ，ｍｇ·Ｌ－１　 Ｃ　ＫＴ，ｍｇ·Ｌ－１
１　 ０．４　 ２．０　 ０．２
２　 ０．８　 ４．０　 ０．４
３　 １．２　 ６．０　 ０．６
表２　植物生长调节剂对茅苍术叶柄
愈伤组织诱导的正交试验
Ｔａｂｌｅ　２　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ
ｏｎ　ｐｅｔｉｏｌｅ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
试验号
Ｔｅｓｔ
ｎｕｍｂｅｒ
因素Ｆａｃｔｏｒ 诱导率Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ（％）
Ａ　 Ｂ　 Ｃ
试验
Ｔｅｓｔ　１
试验
Ｔｅｓｔ　２
平均值
Ａｖｅｒａｇｅ
ｖａｌｕｅ
１　 １　 １　 １　 ８９　 ８６　 ８７．５
２　 １　 ２　 ２　 １００　 ９８　 ９９．０
３　 １　 ３　 ３　 ５９　 ６７　 ６３．０
４　 ２　 １　 ２　 ８５　 ８２　 ８３．５
５　 ２　 ２　 ３　 ８２　 ８０　 ８１．０
６　 ２　 ３　 １　 ３４　 ２９　 ３１．５
７　 ３　 １　 ３　 ７７　 ７２　 ８８．５
８　 ３　 ２　 １　 ９６　 ９７　 ８２．５
９　 ３　 ３　 ２　 ４１　 ４６　 ４３．５
Ｋ１　 ２４９．５　 ２５９．５　 ２０１．５
Ｋ２　 １９６．０　 ２６２．５　 ２２６．０
Ｋ３　 ２１４．５　 １３８．０　 ２３２．５
Ｒ　 ５３．５　 １２４．５　 ３１．０
２．１．２植物生长调节剂对茅苍术叶片愈伤组织诱导
的影响　茅苍术叶片在含有不同植物生长调节剂的
ＭＳ培养基上培养８ｄ左右，在切口处可见半透明的
愈伤组织。经培养２０ｄ后，进行愈伤组织诱导率的
统计，根据极差Ｒ的大小，其影响顺序为Ｂ＞Ａ＞Ｃ。
直观分析可知，茅苍术愈伤组织诱导的最佳植物生
长调节剂配比是 Ａ１Ｂ２Ｃ２，即在 ＭＳ培养基中添加
０．４ｍｇ·Ｌ－１　ＮＡＡ、４．０ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ和０．４ｍｇ·
Ｌ－１　ＫＴ，诱导率达到８３．５％。通过方差分析可知，
２，４－Ｄ对茅苍术叶片愈伤组织诱导的影响极显著，
而ＮＡＡ和ＫＴ为不显著因素（表４、表５）。
表３　植物生长调节剂对茅苍术叶柄愈伤
组织诱导的正交试验结果方差分析
Ｔａｂｌｅ　３　Ｖａｒｉａｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ
ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｎ　ｐｅｔｉｏｌｅ　ｃａｌｕｓ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
方差来源
Ｖａｒｉａｎｃｅ
ｓｏｕｒｃｅ
平方和
Ｓｕｍ　ｏｆ
ｓｑｕａｒｅｓ
自由度
Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｆ
显著性
Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
Ａ　 ４９２．２　 ２　 １０．１ ＊＊
Ｂ　 ３３６３．５　 ２　 ６９．１ ＊＊
Ｃ　 １７８．２　 ２　 ３．７
误差Ｅｒｒｏｒ　 ４８．７　 ２
　Ｆ０．０５（２，９）＝４．２６，Ｆ０．０１（２，９）＝８．０２
表４　植物生长调节剂对茅苍术叶片
愈伤组织诱导的正交试验
Ｔａｂｌｅ　４　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ
ｏｎ　ｌｅａｆ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
试验号
Ｔｅｓｔ
ｎｕｍｂｅｒ
因素Ｆａｃｔｏｒ 诱导率Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ（％）
Ａ　 Ｂ　 Ｃ
试验
Ｔｅｓｔ　１
试验
Ｔｅｓｔ　２
平均值
Ａｖｅｒａｇｅ
ｖａｌｕｅ
１　 １　 １　 １　 ７１　 ６９　 ７０．０
２　 １　 ２　 ２　 ８６　 ８１　 ８３．５
３　 １　 ３　 ３　 ４９　 ４４　 ４６．５
４　 ２　 １　 ２　 ６７　 ６２　 ６４．５
５　 ２　 ２　 ３　 ５９　 ５１　 ５５．０
６　 ２　 ３　 １　 ２９　 ３１　 ３０．０
７　 ３　 １　 ３　 ４６　 ４２　 ４４．０
８　 ３　 ２　 １　 ６９　 ７４　 ７１．５
９　 ３　 ３　 ２　 ３５　 ３９　 ３７．０
Ｋ１　 ２００．０　 １７８．５　 １７１．５
Ｋ２　 １４９．５　 ２１０．０　 １８５．０
Ｋ３　 １５２．５　 １１３．５　 １４５．５
Ｒ　 ５０．５　 ９６．５　 ３９．５
２．１．３植物生长调节剂对茅苍术根茎愈伤组织诱导
的影响　茅苍术根茎在含有不同植物生长调节剂的
ＭＳ培养基上培养１５ｄ左右，产生半透明的愈伤组
织，随着培养时间的延长颜色逐渐变深。经培养２０
ｄ后，进行愈伤组织诱导率的统计，根据极差Ｒ的大
小，其影响顺序为Ｂ＞Ｃ＞Ａ。直观分析可知，茅苍
术根茎愈伤组织诱导的最佳植物生长调节剂配比是
Ａ２Ｂ１Ｃ２，即在 ＭＳ 培养基中添加 ０．８ ｍｇ·Ｌ－１
ＮＡＡ、２．０ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ和０．４ｍｇ·Ｌ－１　ＫＴ，诱导
０２１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３２卷
率达到７１．５％。通过方差分析可知，２，４－Ｄ对根茎
愈伤组织产生极显著的诱导效果（表６、表７）。
表５　植物生长调节剂对茅苍术叶片愈伤
组织诱导的正交试验结果方差分析
Ｔａｂｌｅ　５　Ｖａｒｉａｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ
ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｎ　ｌｅａｆ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
方差来源
Ｖａｒｉａｎｃｅ
ｓｏｕｒｃｅ
平方和
Ｓｕｍ　ｏｆ
ｓｑｕａｒｅｓ
自由度
Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｆ
显著性
Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
Ａ　 ５３５．１　 ２　 ４．５
Ｂ　 １６１４．４　 ２　 １３．６ ＊＊
Ｃ　 ２６８．７　 ２　 ２．３
误差Ｅｒｒｏｒ　 １１８．４　 ２
　Ｆ０．０５（２，９）＝４．２６，Ｆ０．０１（２，９）＝８．０２
表６　植物生长调节剂对茅苍术根茎
愈伤组织诱导的正交试验
Ｔａｂｌｅ　６　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｎ
ｒｈｉｚｏｍｅ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
试验号
Ｔｅｓｔ
ｎｕｍｂｅｒ
因素Ｆａｃｔｏｒ 诱导率Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ（％）
Ａ　 Ｂ　 Ｃ
试验
Ｔｅｓｔ　１
试验
Ｔｅｓｔ　２
平均值
Ａｖｅｒａｇｅ
ｖａｌｕｅ
１　 １　 １　 １　 ６６　 ６９　 ６７．５
２　 １　 ２　 ２　 ７１　 ６６　 ６８．５
３　 １　 ３　 ３　 ２６　 ３３　 ２９．５
４　 ２　 １　 ２　 ７１　 ７３　 ７１．５
５　 ２　 ２　 ３　 ４９　 ４３　 ４６．０
６　 ２　 ３　 １　 ２１　 １８　 １９．５
７　 ３　 １　 ３　 ３６　 ４２　 ３９．０
８　 ３　 ２　 １　 ５７　 ６５　 ６１．０
９　 ３　 ３　 ２　 ２９　 ３４　 ３１．５
Ｋ１　 １６５．５　 １７８．０　 １４８．０
Ｋ２　 １３７．０　 １７５．５　 １７１．５
Ｋ３　 １３１．５　 ８０．５　 １１４．５
Ｒ　 ３４．０　 ９７．５　 ５７．０
２．２植物生长调节剂对茅苍术不同外植体愈伤组织
生长的影响
　　据上述正交试验结果，将不同的外植体分别培
养于最佳的植物生长调节剂组合培养基中，培养２０
ｄ后进行统计分析，结果表明三种外植体来源以叶
柄为最好，愈伤组织生长旺盛，质地疏松，是进行细
胞悬浮培养的适宜材料（表８，图１）。
表７　植物生长调节剂对茅苍术根茎愈伤
组织诱导的正交试验结果方差分析
Ｔａｂｌｅ　７　Ｖａｒｉａｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ
ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｎ　ｒｈｉｚｏｍｅ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
方差来源
Ｖａｒｉａｎｃｅ
ｓｏｕｒｃｅ
平方和
Ｓｕｍ　ｏｆ
ｓｑｕａｒｅｓ
自由度
Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｆ
显著性
Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
Ａ　 ２２２．１　 ２　 １．１
Ｂ　 ２０５９．７　 ２　 １０．１ ＊＊
Ｃ　 ５４７．１　 ２　 １．７
误差Ｅｒｒｏｒ　 ２０４．２　 ２
　Ｆ０．０５（２，９）＝４．２６，Ｆ０．０１（２，９）＝８．０２
２．３茅苍术细胞悬浮培养体系的建立
在选定的色谱条件下，苍术素的峰型良好，出峰
时间约７．７４ｍｉｎ，样品中各峰分离良好（图２，图３）。
根据茅苍术的入药部位以及本次正交试验结果，分
别进行了来自于茅苍术根茎和叶柄的细胞悬浮培养
研究。结果表明，茅苍术叶柄和根茎部细胞生长均
呈现Ｓ形生长曲线，且叶柄细胞悬浮培养至１８ｄ
时，细胞量达到最大值９．０７ｇ·Ｌ－１，叶柄细胞生长
的稳定期较长，而植物次生代谢产物一般均在稳定
期合成，从而有助于茅苍术多糖及苍术素等活性成
分的积累（图４）。此外，茅苍术叶柄及根茎悬浮培
表８　植物生长调节剂对茅苍术不同外植体愈伤组织生长的影响
Ｔａｂｌｅ　８　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｎ　ｃａｌｕｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｆｒｏｍＡｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
外植体
Ｅｘｐｌａｎｔ
最早形成时间（ｄ）
Ｆｏｒｍｅｄ　ｆｉｒｓｔ　ｔｉｍｅ
干重（ｇ）
Ｄｒｙ　ｗｅｉｇｈｔ
颜色
Ｃｏｌｏｒ
质地
Ｔｅｘｔｕｒｅ
长势
Ｇｒｏｗｔｈ
叶柄Ｐｅｔｉｏｌｅ　 １０　 ０．０２９ 黄白色Ｙｅｌｏｗ－ｗｈｉｔｅ 疏松，颗粒状 Ｍｏｒｅ　ｌｏｏｓｅ，ｇｒａｎｕｌａｒ　ｓｈａｐｅ ＋＋＋＋
叶片Ｌｅａｆ　 ８　 ０．０２１ 黄绿色Ｙｅｌｏｗ－ｇｒｅｅｎ 较疏松，颗粒状Ｌｏｏｓｅ，ｒａｎｕｌａｒ　ｓｈａｐｅ ＋＋＋
根茎Ｒｈｉｚｏｍｅ　 １５　 ０．０１２ 黄白色Ｙｅｌｏｗ－ｗｈｉｔｅ 较疏松，瘤状Ｌｏｏｓｅ，ｔｕｍｏｒ　ｓｈａｐｅ ＋＋
　注：＋表示生长的强弱；＋越多表示生长越旺盛。
　Ｎｏｔｅ：＋ｉｎ　ｔｈｅ　ｔａｂｌｅ　ｍｅａｎｓ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｓｔａｔｕｓ；ｍｏｒｅ＋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｍｏｒｅ　ｖｉｇｏｒｏｕｓ　ｇｒｏｗｔｈ．
养细胞多糖及苍术素含量的动态变化与细胞生长的
动态变化基本一致（图５，图６）。从图中可以看出，
来自于叶柄的细胞生长明显较快，细胞量最大值是
起始接种细胞量的１０．６７倍，而来自于根茎的细胞
量最大值是其起始接种细胞量的８．１７倍。此外，叶
柄细胞多糖及苍术素含量在较短的时间内达到最大
值，且二者最大值分别是叶柄起始接种细胞多糖和
苍术素含量的５０．５８倍和４５．６３倍；根茎细胞多糖
及苍术素含量在培养至２１ｄ时达到最大值，分别是
根茎起始接种细胞多糖和苍术素含量的５６．３９倍和
１２１１期　　　　　　　　　陶金华等：茅苍术愈伤组织诱导及其细胞悬浮培养研究
图１　茅苍术叶柄诱导形成的愈伤组织
Ｆｉｇ．１　Ｐｅｔｉｏｌｅ　ｃａｌｕｓ　ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
图２　苍术素对照品 ＨＰＬＣ图谱
Ｆｉｇ．２　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｎ
图３　茅苍术细胞提取液 ＨＰＬＣ图谱
Ｆｉｇ．３　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ
ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
图４　茅苍术叶柄及根茎悬浮培养细胞生长的动态变化
Ｆｉｇ．４　Ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｐｅｔｉｏｌｅ　ａｎｄ　ｒｈｉｚｏｍｅ
ｃｅｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
图５　茅苍术叶柄及根茎悬浮培养细胞多糖的动态变化
Ｆｉｇ．５　Ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｐｅｔｉｏｌｅ　ａｎｄ　ｒｈｉｚｏｍｅ　ｃｅｌ
ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
图６　茅苍术叶柄及根茎悬浮培养
细胞苍术素的动态变化
Ｆｉｇ．６　Ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｐｅｔｉｏｌｅ　ａｎｄ　ｒｈｉｚｏｍｅ　ｃｅｌ
ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｎ　ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ
４６．２９倍。根茎细胞中多糖及苍术素的含量分别达
到２．０４ｍｇ·Ｌ－１和２．４５μｇ·Ｌ－
１，分别比叶柄细胞
２２１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３２卷
中多糖及苍术素的含量提高了１７．９％和１３．４％。
由此可见，虽然叶柄细胞能在较短的时间内适应培
养环境，细胞增殖迅速，较快地进入稳定期，但不利
于多糖和苍术素的生物合成。而根茎细胞生长较
慢，进入稳定期的时间相对滞后，单位细胞量中多糖
及苍术素的含量较高，但由于根茎细胞总量较少，所
以培养液中多糖及苍术素总积累量低于叶柄细胞培
养液中的总量。因此，通过进一步优化茅苍术叶柄
细胞悬浮培养条件，促进叶柄细胞多糖及苍术素的
生物合成，进一步延长细胞生长的稳定期，从而有助
于多糖、苍术素等茅苍术活性成分的积累。
３　结论与讨论
适宜的植物外植体有助于愈伤组织的诱导，不
同的植物生长调节剂对外植体愈伤组织诱导的影响
存在差异。本文研究表明，茅苍术不同外植体叶柄、
叶片、根茎均可诱导出愈伤组织，尤其是叶柄愈伤组
织的诱导率较高，每种外植体产生的愈伤组织颜色、
质地没有显著的区别，但在长势上表现出一定的差
异，来自于叶柄的愈伤组织长势最好。研究发现２，
４－Ｄ对茅苍术３种外植体愈伤组织均产生极显著的
诱导效果。因此，今后可从生理生化角度进一步探
讨２，４－Ｄ对叶柄愈伤组织诱导的影响，从而有助于
提高愈伤组织的诱导率、质量和产量，为茅苍术无菌
苗和细胞悬浮培养的研究提供实验材料。
目前利用植物细胞悬浮培养技术进行药用植物
次生代谢产物生物合成研究是中药生物技术的重要
内容。而优良的植物悬浮培养细胞种质来源多是通
过愈伤组织的诱导及单细胞的分离和筛选获得。因
而愈伤组织的外观形态和生理状态直接影响到后续
建立细胞悬浮系的质量，愈伤组织越疏松，细胞的分
散程度就越大。因此，挑选颗粒细小、疏松易碎、外
观湿润鲜艳的白色或淡黄色愈伤组织有利于诱导悬
浮细胞系（江曙等，２００９）。通过对茅苍术根茎和叶
柄愈伤组织的筛选、继代后，进行细胞悬浮培养，从
细胞生长曲线可看出利用茅苍术的愈伤组织进行细
胞悬浮培养是可行的，这也为茅苍术细胞悬浮培养
的进一步研究奠定了基础。通过建立茅苍术细胞悬
浮培养体系，研究茅苍术细胞的生理、生化特点，并
探索其活性成分的积累规律，对缓解珍稀濒危药物
植物资源的短缺矛盾具有重要的理论意义和应用价
值，有助于实现中药资源的可持续发展。
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ｌａｔｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｆｒｏｍ　ｒｈｉｚｏｍｅｓ　ｏｆ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｌａｎｃｅａ［Ｊ］．Ｃａｒｂｏ－
ｈｙｄｒａｔｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，４６：１２５－１２９
３２１１期　　　　　　　　　陶金华等：茅苍术愈伤组织诱导及其细胞悬浮培养研究