全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Mar． 2013，33(2) :177 － 180 http:/ / journal． gxzw． gxib． cn
DOI:10． 3969 / j． issn． 1000-3142． 2013． 02． 007
党峰峰，林金辉，陈成聪，等． 过量表达水杨酸羟基酶 NahG降低烟草对青枯菌的抗性［J］． 广西植物，2013，33(2) :177 －180
Dang FF，Lin JH，Chen CC，et al． Overexpression of salicylate hydroxylase NahG declines resistance to Ralstonia solanacearum infection in tobacco［J］．
Guihaia，2013，33(2) :177 －180
过量表达水杨酸羟基酶 NahG降低
烟草对青枯菌的抗性
党峰峰1，林金辉1，陈成聪1，陈永萍3，官德义2，何水林1，2*
(1．福建农林大学 生命科学学院，福州 35002;2．福建农林大学 作物遗传改良和综合利用
教育部重点实验室，福州 35002;3．福建农林大学 园艺学院，福州 35002 )
摘 要:研究构建了 pMDC32-NahG植物表达载体，并获得了其超表达的转基因烟草 T1 代株系。结果表明:
这些株系与其野生型植株没有明显表型差异，但却表现出较野生型植株更敏感的青枯菌侵染抗性。同时，研
究还发现 NahG的超表达还显著提高了茉莉酸(JA)-依赖的基因 NtPR1-b的表达，降低了(SA)-依赖的相关基
因 NtPR3和 NtPRQ的表达。这表明 SA累积的缺陷降低了烟草对青枯菌侵染的抗性。
关键词:水杨酸;NahG;青枯菌
中图分类号:Q943． 2 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2013)02-0177-04
*
Overexpression of salicylate hydroxylase NahG
declines resistance to Ralstonia solanacearum
infection in tobacco
DANG Feng-Feng1，LIN Jin-Hui1，CHEN Cheng-Cong1，
CHEN Yong-Ping3，GUAN De-Yi2，HE Shui-Lin1，2*
(1． College of Life Sciences，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China;2． National Education Minster
Key laboratory of Crop Genetic Improvement and Comprehensive Utilization，Fujian Agriculture and Forestry University，
Fuzhou 350002，China;3． College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China )
Abstract:Studies showed that the plant expression vector of pMDC32-NahG was construed in tobacco K326，and ob-
tained NahG-OE T1 lines． Comparing to wild type K326，NahG-OE lines did not exhibited any phenotypic difference，but
exhibited higher susceptibility to Ralstonia solanacearum inoculation． Meanwhile，it was found to be coupled with up-reg-
ulated expression of JA-depended NtPR1-b，and down-regulated expression of SA-depended NtPR3 and NtPRQ． Results
suggested that SA-degrading NahG tobacco plants declined resistance to R． solanacearum infection．
Key words:salicylic acid;NahG;Ralstonia solanacearum
植物生长和发育过程中经常会遭受各种病原微
生物的入侵，由于植物缺乏像动物那样的逃避机制
与免疫细胞(Dangl ＆ Jones，2001;Ausubel，2005) ，
在长期进化过程中形成了精细复杂的天然免疫系统
* 收稿日期:2012-10-20 修回日期:2012-12-09
基金项目:国家自然科学基金 (30971718);国家高等教育博士研究基因重大专项(20093535110004)、转基因重大专项 (2009ZX08001-015B);福建省
自然科学基金 (2008J049)
作者简介:党峰峰(1986-) ，男，陕西富平人，硕士研究生，研究方向为植物基因表达与调控，(E-mail)cenascdfist@ 163． com。
* 通讯作者:何水林，博士，教授，博士生导师，研究方向为植物生物技术与分子生物学，(E-mail)shlhe2007@ yahoo． com． cn。
(Jones ＆ Dangl，2006;Chisholm et al．，2006)。植株
激素在病原菌防御应答过程中扮演了重要角色(Pi-
eterse et al．，2009) ，尤其是水杨酸(SA(Dempsey et
al．，1999) ，诱导植物产生系统获得性抗性的关键信
号分子之一(Gaffney et al．，1993)。通过调控 SA信
号途径相关的防御应答(Malamy ＆ Klessig，1992) ，
抵抗各种病原微生物的入侵(Alvarez，2000)。相
反，在拟南芥和烟草中，通过异源表达假单胞菌
(Pseudomonas)水杨酸羟基酶(salicylate hydroxy-
lase，NahG)基因，抑制了水杨酸的累积，证实了 SA
累积的缺陷降低了植株对病原微生物入侵的抗性
(Gaffney et al．，1993，Bi et al．，1995，Friedrich et
al．，1995)。
烟草是一种重要的经济作物和典型的忌连作茄
科植物，我国南方烟草生产常因频繁发生青枯病等
土传性病害而经常导致严重的经济损失(Hayward，
1997)。目前解决烟草等作物青枯病的主要手段是
抗病育种，烟草抗病育种具有周期长，抗性丧失快等
缺点(Granda，1975)。研究烟草抗病分子机制，在此
基础上探索新的抗病策略将在解决烟草等茄科作物
抗病问题中发挥重要的作用。鉴于此，本研究在获
得假单胞菌 NahG 基因的基础上，研究了该基因过
量表达对烟草青枯菌侵染的抗性，为进一步剖析烟
草功能基因在防御应答青枯菌侵染过程中的分子机
制奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 植物生长与环境
烟草(K326) ，由福建农林大学何水林教授提
供，对于青枯菌菌株 FJC100301 敏感，栽培于温室。
K326 和过量表达 NahG(NahG-OE)的 T1 代种子经
过 75%乙醇 30 s，10%的过氧化氢 10 min，无菌水清
洗 5 次，播种于含有 75 mg·L-1的 Kan的MS培养基
上 14 ～ 21 d。生长一致 K326 和 NahG-OE株系幼苗
移栽于无菌的营养基质中 (泥炭土︰土︰珍珠岩 =
2 ︰ 1 ︰ 1，v︰ v︰ v)14 ～ 21 d。之后大小一致的
K326 和 NahG-OE株系小苗移栽于无菌的营养基质
中 21 ～ 28 d。温室条件:温度为(25 ± 2)℃，光照强
度为 1 500 ～ 2 000 lx，相对湿度为 70%，16 h-light /8
h-dark周期。
1． 2 青枯菌培养与接种
青枯菌菌株 FJC100301 分离于福建省福清发病
的辣椒植株，参照 Kelman(1954)描述方法进行。青
枯菌的培养及抗病性接种鉴定参照 Minkyun Kim描
述方法进行(Jung et al．，2007)。
1． 3 NahG过量表达植株的构建
通过 gateway 克隆技术(Invitrogen，USA)将
NahG全长的 cDNA克隆于含有 CaMV35S启动子的
pMDC32 植物表达载体中，形成的 pMDC32-NahG载
体并导入农杆菌菌株 LBA105中(Oh et al．，2005) ，进
一步通过农杆菌介导的遗传转化法进行烟草 K326 的
遗传转化。T0 代植株通过卡那霉素抗性进行筛选，
最后 5 个株系通过卡那霉素基因特异性引物进行
PCR验证。
1． 4 实时荧光定量 PCR
根据 Applied Biosystems 7500 Real-time PCR 和
SYBR Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)指导
说明进行靶标基因(引物见表 1)相对表达量分析。
K326 和 NahG-OE 株系的 RNA 的分离与 cDNA 的
合成分别通过 TRIzol(InvitrogenTM，Carlsbad，CA)和
PrimeScriptTM RT-PCR kit 10 μL反应体系用于靶标
基因和内参基因的扩增，反应条件均为:95 ℃ 30 s;
95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 循环;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1
min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。数据分析采用 Livak 方
法(Livak ＆ Schmittgen，2001) ，即 K326 和 NahG-OE
株系靶标基因的相对表达水平通过 2-ΔΔCT进行分析。
1． 5 K326 和 NahG-OE株系植株的抗病性鉴定
K326 和 NahG-OE株系植株的抗病性鉴定采用
针注方法从盆栽烟株顶芽下第 3 伸长叶叶背的叶
脉，用针(4 号针头)将菌液注射到叶片细胞间隙，病
情病级和抗性标准均参照 Minkyun Kim 方法进行
(Jung et al．，2007)。
2 结果与分析
2． 1 NahG过量表达载体的构建与遗传转化
NahG基因全长 cDNA 从南开大学蔡宝立教授
友情提供含有 NahG基因的原核表达载体上克隆得
到，进一步经过 gateway 技术构建 pMDC32-NahG 植
物表达载体(图 1:A)。通过农杆菌介导的烟草叶
盘法转化方法，获得了转基因烟草 T0 代植株，收获
种子并对种子进行卡那霉素浸种处理，所获得的植
株构成 T1 代株系 5 个(图 1:B) ，并未发现 NahG-
OE与 K326 存在任何表型差异。
871 广 西 植 物 33 卷
表 1 研究主要应用的引物
Table 1 Main primers for PCR used in this study
Gene Accession No． Left primer(5 to 3) Right primer(5 to 3) bp
NtPR1-b M60460 TGATGCCCTTTTGGATTCTATG AGTTCCTGCCCCGCTTT 175
NtACS1 X65982 CATTAGCGAGGATTCGGAGTT GTGGTGAATG AGGGATAGGA GA 180
Ntacc deaminase Z46349． 1 TCTGAGGTTACTGATTTGGATTGG TGGACATGGTGGATAGTTGCT 264
NtPR3 X51425 CAGGAGGGTATTGCTTTGTTAGG CGTGGGAAGATGGCTTGTTG TC 222
NtPRQ M29868． 1 ACCACAGGACAACAAGCCATCT ATCTTCCACTGCGTCATTCCGT 163
NtEF1α D63396 TGCTGCTGTAACAAGATGGATGC GAGATGGGGA CAAAGGGGATT 134
图 1 烟草中水杨酸羟基酶 NahG过量表达 A．过量表达 NahG植物表达载体构建模式图 LB，RB． T-DNA左端和右端;attR1，
attR2． Gateway克隆技术重组位点;2 × 35SPro． 2 个拷贝花椰菜花叶病毒 35S启动子;Nos-T．终止密码子;Kanr．卡那霉素抗性基因。B．
RT-PCR分析了卡那霉素抗性基因表达水平在 5 个过量表达 NahG T1 转基因株系和野生型 K326 植株，NtEF1-α作为内对照。
Fig． 1 Overexpression of salicylate hydroxylase NahG in tobacco A． Schematic representation of the pMDC32-NahG constructs LB，
RB． left and right borders of the T-DNA;attR1，attR2． recombination sites for Gateway cloning;2 × 35SPro． two copies of the Cauliflower Mosaic Vi-
rus 35S promoter;Nos-T． nos-terminator;Kanr． Kanamycin resistance gene． B． RT-PCR analysis NahG gene transcript levels in five NahG-OE lines
and wild-type tobacco plants，NtEF1-α served as endogenous control．
图 2 过量表达 NahG增强烟草植株对青枯菌的抗性 A． 7 周大的 NahG-OE 株系和 K326 植株进行青枯菌抗性分析，采用叶脉注
射，每株注射 10 μL 108 cfu /mL(OD =0． 8) ，接种后 13 d，拍照。B．病情指数统计分析，范围 0 ～ 4:0(植株健康) ，1(1 ～ 25%枯萎) ，2(26%
～50%枯萎) ，3(51% ～75%枯萎) ，4(76% ～100%枯萎或者死亡)。C． 接种后 13 d，统计分析 NahG-OE 和 K326 植株进行青枯菌生长情
况。数值来源于三个生物学重复平均 cfu(菌落形成单位)。误差线代表标准误，Student-Newman-Keuls检验，星号用来表示显著性差异(*
P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01)。
Fig． 2 Overexpressing NahG enhances the resistance of tobacco plants to R． solanacearum A． Seven-week-old plants of the repre-
sentative transgenic NahG-OE line and its parental wild type line(WT-K326)13 days after inoculation of their third leaves with 10 μL suspension of
108 colony forming units(cfu)mL-1 of the highly virulent R． solanacearum strain FJC100301． B． R． solanacearum-inoculated plants score using a dis-
ease index ranging from 0 to 4:0(no wilting) ，1(1 to 25% wilted) ，2(26 to 50% wilted) ，3(51 to 75% wilted) ，and 4(76 to 100% wilted or dead)．
Averages presented are based on three biological replicates each comprising five plants． C． R． solanacearum growth in third leaves of wild type(WT-
K326)and NahG-OE tobacco plants 0 and 13 days post-inoculation(dpi)． Values presented are average cfu based on three biological replicates，each
comprising three plants． Error bars indicate the standard error． A sterisk indicates a significant difference(SNK-test，* P ＜ 0． 05 or ＊＊P ＜ 0． 01)．
2． 2 过量表达 NahG增强了烟草对青枯菌的敏感性
采用高致病性青枯菌菌株 FJC100301，随机挑
选 3 个株系的植株进行抗病性鉴定，13 d 后开始观
察统计发病程度。结果表明，与野生型 K326 相比，
3 个 NahG-OE 株系均展现了较高的青枯菌敏感性。
一个典型的株系 NahG-OE-1 用于记录与详细抗性
分析。在接种后 13 d(13 dpi，days post inoculation) ，
NahG-OE-1 株系发生了相当严重的烟草青枯病，而
野生型 K326 仅仅发生中度的烟草青枯病(图 2:
A)。在接种后 13 d和 18 d，病情指数分析发现野生
型 K326 烟草青枯病病情程度仅为 NahG-OE-1 株系
的 71%和 82%(图 2:B) ，而在 NahG-OE-1 株系植
株中青枯菌的扩增速度显著性高于在野生型 K326
植株中(图 2:C)。可见，过量表达 NahG 增强了烟
9712 期 党峰峰等:过量表达水杨酸羟基酶 NahG降低了烟草对青枯菌的抗性
草对青枯菌的敏感性。
2． 3 过量表达 NahG对防御相关基因表达的影响
为了进一步验证上述抗病表型分析结果，进一
步分析了 NahG超表达对防御反应相关基因的表达
的影响。结果表明，NahG 过量表达显著上调了茉
莉酸(JA)依赖的 NtPR1-b 基因转录水平。相反的，
下调了水杨酸(SA)依赖的 NtPR3 和 NtPRQ(图 3)
防御相关基因的表达水平。
图 3 NahG-OE-1 和 WT-K326 植株中防御相关基因
组成型表达 A． QRT-PCR 分析了防御相关基因相对表达水
平在 NahG-OE-1 和 WT-K326 植株中。WT-K326 中防御相关基
因的表达水平作为对照，表达水平设为“1”。误差线代表标准
误，Student-Newman-Keuls 检验，不同字母用来表示显著性差异
(小写字母不同代表 P ＜ 0． 05;大写字母不同代表 P ＜ 0． 01)。
Fig． 3 Constitutive expression of defense markers in
NahG-OE-1 or WT-K326 tobacco A． QRT-PCR analysis of
relative transcript levels of tobacco defense marker genes in NahG-
OE-1 tobacco or wild type(WT-K326)plants． Defense-related genes
transcript contents of WT-K326 are used as control，which is set to 1．
Error bars indicate the standard error． Different letters indicate sig-
nificant difference as determined by Student-Newman-Keuls Test
(lowercase difference P ＜ 0． 05;uppercase difference P ＜ 0． 01)．
3 讨论
到目前为止，研究表明 SA 信号途径在植物防
御应答过程中具有重要的作用。在 SA 信号途径介
导的各种抗性中，研究主要集中在假单胞菌等的模
式菌株与模式作物拟南芥和水稻。青枯菌，土传性
植物病害，严重威胁到我国南方烟草等茄科作物的
生长。为进一步探索 SA 信号途径在烟草功能基
因，如 WRKY，NAC，ERF 等转录因子正或者负调控
的青枯菌侵染过程中的作用。在本研究中，构建了
SA累积缺陷的 NahG超表达烟草植株，结果表明显
著降低了对青枯菌侵染的抗性。而且，NahG 超表
达烟草植株在降低对青枯菌抗性的同时与 SA 依赖
的防御相关基因的下调相关。研究发现，SA累积的
缺陷降低了 SA-依赖的相关基因的转录水平，但同
时增强了 JA-依赖相关基因的转录水平。这些结果
与前人关于报道的 SA和 JA信号途径之间 crosstalk
结果一致。
研究表明，在过量表达水杨酸羟基酶 NahG 的
植株中，降低了对各种病原微生物入侵的抗性。但
在烟草等茄科作物防御青枯菌侵染过程中 NahG 基
因作用鲜有报道。青枯病是一种重要的茄科植物病
害，在高温高湿下发病危害严重。本研究发现
NahG的超表达可显著提高转基因烟草对青枯病的
敏感性，表明了 SA 累积在烟草等茄科植物对青枯
菌抗性中具有重要作用，因此深度剖析 SA 信号途
径在烟草等茄科植物防御青枯菌侵染过程中的作用
机制，为进一步提高其对青枯菌抗性具有重要的研
究价值。
致谢 非常感谢南开大学蔡宝立教授友情提供
含有 NahG基因的原核表达载体，福建农林大学方树
民教授在青枯病病株样本收集过程中的友情帮助。
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081 广 西 植 物 33 卷
图 3 硒标准曲线
Fig． 3 Selenium standard curve
桉树躯干 Se 1． 21 1． 00 2． 13 92． 16 1． 43
桉树根 Se 1． 17 1． 00 2． 14 97． 14 0． 92
3 结论
本实验测定了桉树各部位的硒含量，加标回收
率在 92% ～99%之间。结果表明，桉树中硒主要集
中在躯干和树根部分，少量存在于树皮和树叶中。
在探究掩蔽剂的实验中，得出铁氰化钾，聚环氧琥珀
酸和酒石酸有较好的掩蔽效果，乙二胺的效果最差。
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