全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(6)：817— 820 2OO7年 l1月
珍稀濒危植物永瓣藤 DNA提取与 ISSR条件优化
谢国文，张金杏 ，郑燕玲，彭晓瑜
(广州大学 生命科学学院，广州 510006)
摘 要：以硅胶干燥叶片为材料 ，研究永瓣藤 DNA的提取方法，并对影响简单重复序列区间分子标记反应的
各条件进行了优化 。建立 了永瓣藤 ISSR的优化 反应体 系和程 序，即在 2O L反应体系 中，含 2O ng模板
DNA、2．375 mmol／L Mgz+、0．15 mmol／L dNTPs、1．5 U Taq DNA聚合酶、225 nmol／L随机引物；扩增程序
为：94℃预变性 5 min；然后 94℃ 15 s、48~50℃45 s、72℃ 1 min，35个循环，最后 72℃延伸10 min，4℃保
存。本研究为进行永瓣藤种群遗传多样性研究奠定了基础。
关键词：永瓣藤 ；珍稀濒危植物；DNA提取 ；ISSR
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2007)06—0817-04
DNA extraction and optimization 0f ISSR reaction
system for rare and endangered plant
M onimopetalum chinense
XIE Guo—Wen，ZHANG Jin-Xing ，ZHENG Yan-Ling，PENG Xiao-Yu
(College of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China)
Abstract：In the present study，DNA of Monimopetalum chinense was extracted from the silica gel dried leaves．The
optimized reaction system and programme of inter simple sequence repeats(ISSR)for M chinense are as folows：the
reactions were performed in a volume of 20 IxL containing 20 ng of template DNA，2．375 mmol／L Mg +，0．15
mmol／L dNTPs，1．5U Taq DNA polymerase，225 nmol／L primer；thermal cycling was programmed by 1 cycle for 5
min at 94℃ ，folowed by 35 cycles for 15 S at 94℃ ，45 S at 48~50℃ and 1 rain at 72℃ ，and finaly，by 1 cycle for
10 min at 72℃ ，stored at 4℃．
Key words：M onimopetalum chinense；rare and endangered plant；DNA extraction；ISSR
ISSR(Inter simple sequence repeats)简单重复
序列区问分子标记是由 Zietkiewicz等(1994)创建
的一种新的分子标记技术 ，它具有 DNA用量少 、技
术要求低 、多态性水平高 、成本低廉 ，可在一般实验
室进行基因组指纹图谱构建；同时检测多个 SSR座
位；保证了 PCR扩增的可重复性等优点。ISSR标
记已广泛用于遗传多样性分析、绘制 DNA指纹图
谱、品种鉴定、进化及分子生态学等领域的研究(李
文表等 ，2006；余艳等，2003)。
永瓣藤(Monimopetalum chinense)为我国长江
中下游南部中亚热带向北亚热带过渡的生态环境中
残存的卫矛科单种属植物。本属的现代分布范围为
赣北、皖南和鄂东南 ，即 114。3O ～118。10 E，28。3O
～ 3o。1o N。分布区域狭窄，是本地起源的单型特
有属。数量稀少 ，分布狭窄，只局 限生长在皖赣鄂接
壤地带，并呈问断分布状态，被列为国家二级濒危保
护植物(傅立国等，1989)，收入《中国植物红皮书》
(傅立国等，1992)。目前，对永瓣藤的研究仅限于生
态、生物学特性、形态解剖、细胞学等方面(谢国文
等，1998a，b，1999；廖军，1995)，至今还未研究过永
瓣藤的分子系统关系及进化历程。本研究利用硅胶
干燥的永瓣藤 叶片进行 DNA提取方法和 ISSR条
收稿 日期：2006—07-03 修回Et期 ：2007—01-29
基金项目：国家自然科学基金(30470146，39460011)；广州大学重点科研项 目[Supported bytheNationalNatural Science Foundation ofChina
(30470146，39460011)；Key Item of Scientific Research Foundation of Guangzhou University3
作者简介：谢国文(1957一)，男，江西莲花人 ，教授，从事植物系统进化、生物多样性和保育生态学研究。
通讯作者(Author for corresp0ndence)
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件的优化，为进一步探讨该珍稀濒危保护植物的遗
传多样性提供参考。
1 材料和方法
1．1材料
在永瓣藤的分布区域安徽、江西和湖北三省选
择代表性居群，根据居群的大小，每个居群随机选取
了12～21个个体，为研究该濒危物种遗传多样性作
好前期工作。每个居群分单株取新鲜叶片，分别用
变色硅胶进行快速干燥，带回实验室于室温下保存。
1．2方法
(1)DNA提取及扩增 ：采用改进后的 CTAB微
量法(Doyle，1991；葛颂等，1994)从经硅胶干燥的叶
片中提取总 DNA。PCR反应在 PTO200(MJ Re—
search)PCR仪上进行。从购自于加拿大哥伦比亚
大学的100个引物(UBC set No．9)中筛选出效果
好的引物用于 PCR扩增并进行 ISSR—PCR反应体
系的优化。(2)ISSR反应产物的检测：PCR扩增产
物通过琼脂糖凝胶电泳，经 EB染色后检测多态性。
PCR产物均在含溴化乙锭(ethidium bromide，0．1
gg／mL)的 1．5 琼脂糖凝胶 中，以 0．5 x TBE为 电
泳缓冲液电泳分离，用上海生工生物工程有限公司
100bp的DNA ladder(100～1 000 bp)作为分子量
标记，最后用紫外成像系统(Lab Works Software
Version 3．0；UVP，Upland，CA91786，USA)成像并
记录结果。
2 终聚与分
2．1 DNA提取
采用改进后的 CTAB微量法从经硅胶干燥的
叶片中提取总 DNA，全部样品都成功提取出 DNA。
经用 0．8 9／6的琼脂糖胶电泳、紫外成像系统下检测
DNA，所提取的 DNA都为一清晰明亮的主带(图
1)。进～步从永瓣藤 ISSR—PCR扩增试验结果看，
应用优化的反应体系提取的 DNA都能扩增出清
晰、稳定的条带，达到了ISSR—PCR反应的要求。
2．2永瓣藤 ISSR-PCR反应体 系的优化
由于 ISSR作为一种重复性好的分子标记，常
用于遗传多样性的检测。进行研究时，不同的物种
要求的反应条件不尽相同，许多因素都会影响 PCR
反应的质量和重复性(邹喻苹等，2001)。
图 1 DNA琼脂糖胶电泳检测
Fig．1 Result of DNA agsrose electrophoresis
表 1 ISSR引物序列与适宜的退火温度
Table 1 Sequence of ISSR primers and
opportune annealing temperature
引物 列
Primer ： L0 to J
退火温度(℃)
Annealing
temperature
2．2．1模板 DNA的质量与浓度 进行 ISSR—PCR
DNA最适浓度的筛选时，选取较为通用的 4个引物
(810，8l1，835，857)，在 Mg抖浓度 为 1．5 mmol／L
时，用不同浓度的 DNA(5、10、2O、5O、100 ng／gL)作
模板进行扩增。结果显示当模板 DNA浓度为 2O
ng／gL时可得到较好的扩增式样。引物 810，8l1，
835，857分别产生 6，5，6，4条清晰的带谱。
2．2．2引物和 Mg 的浓度 筛选出多态性高、谱带
清晰、重复性好的引物用于居群遗传多样性的研究
是整个研究最关键的一步。在本研究中，ISSR—PCR
的引物筛选出了 1O种(表 1)经试验得出浓度为 180
nmol／L较佳。为确定反应的最佳 Mg 浓度，以
Mg抖终浓度为 1．5、1．8、2．0、2．375、2．75、3．0、3．5
mmol／L，DNA为 2O ng，退火温度 5O℃进行 了扩
增，结果发现当 Mg抖浓度为 1．5 mmol／L和 2．375
mmol／L的时候 ，引物 81O，811，835，857都能扩增
出良好的式样。
2．2．3 dNTPs和 Taq酶 的用量 经试验在永瓣藤
ISSR-PCR中dNTPs浓度以0．15 mmol／L较合适。
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6期 谢国文等：珍稀濒危植物永瓣藤 DNA提取与 ISSR条件优化 819
本实验设置 1、1．2、1．5、1．8、2．0、2．5 U 六个 Taq
酶(上海生工生物工程有限公司生产)含量梯度，1．5
U时能够得到最佳效果。
以上试验表 明，永瓣藤 ISSR—PCR反应组分的
最佳组合见表 2。
表 2 永瓣藤 1SSR-PCR反应组分的最佳组合
Table 2 Optimum combination of content for
ISSR—PCR reaction of M ．chinense
表 3 永瓣藤 ISSR-PCR的反应程序
Table 3 Optimum ISSR—PCR program of M _chinense
2．3永瓣藤 ISSR—PCR反应程序的优化
2．3．1退火温度 ISSR引物有不同的 GC百分含
量，确定一个合适的退火温度非常重要。退火温度
是影响扩增特异性 的主要原 因之一，不同的退火温
度与时间可 以导致 扩增 产物大小上 的差异 ，ISSR—
PCR扩增 ，退火温度 明显影响扩增谱带式样 (姜静
等 ，2003)。而有些研究者则认为，不论 引物组成如
何均采用 50~52 oC退火温度，也能获得清晰的谱带
(邹喻苹等，1998)。
退火温度过低 ，扩增特异性差 ，杂带较多，背景
图 2 部分 ISSR引物在永瓣藤中得到的扩增产物
Fig．2 ISSR amplification products generated from M．chinense genomic DNA
A，B．分别为引物 810，835的扩增结果。A．with primer 810；B．with primer 835．100 bp ladder DNA marker
模糊；退火温度过高，引物与模板结合差，电泳条带
弱，甚至没有扩增。对其他引物进行梯度 PCR，也得
到同样结果。退火温度越高 ，扩增的特异性越高 。在
选择最佳退火温度时，如扩增结果相近，宜选择较高
退火温度，以提高反应的特异性(穆立蔷等，2006)。
本试验根据永瓣藤 ISSR-PCR反应的最佳体
系，先根据原初的 PCR反应条件进行引物的初筛，
选择能看到清晰条带的引物进行退火温度的确定。
从 100个 ISSR引物中筛选出扩增稳定、重复性强
的引物用于 PCR扩增，再针对筛选出的引物逐个进
行梯度退火试验，确定引物的最佳退火温度(表 1)。
由于有些 ISSR-PCR的引物在 5O℃时有弱带的存
在，因此 ，将退火温度设置 了以下 6个梯度对 100个
引物进行筛选 ：52、51、49．5、49、48．5、48℃。经过
反复试验筛选出了 1O个在 48～5O℃扩增效果良好
的引物用于下一步的研究，它们分别是：808，810，
811，835，842，857，876，880，889，890(表 1)。
2．3．2循环次数 当永瓣藤 ISSR—PCR循环次数为
3O次时，DNA不能够得到充分的扩增，扩增带少而
模糊 ；而循环 次数 为 35次 时，带型清 晰、稳定 ，故
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PCR循环次数确定为 35次达到最佳效果(表 3)。
2．4永瓣藤 ISSR-PCR扩增效果
应用优化好的反应体系和程序，即在 20 L反
应体系 中，含 20 ng模板 DNA，2．375 mmol／L
Mg抖，0．15 mmol／L dNTPs，1．5U Taq DNA聚合
酶，225 nmol／L Primer；扩增程序为：94℃预变性 5
min，而后进行 35个循环，每个循环包括 94℃变性
15 s、48~50℃退火(退火温度随引物而定，表 1)45
s、72℃复性1 min；最后 72℃延伸 10 min。产物扩
增好后置于 4℃冰箱保存，以备进行永瓣藤种群遗
传多样性研究用。部分引物扩增的结果见图2。
本研究承蒙葛学军，王德莲等先生的热情帮助，
谨 此致谢 !
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《广西植物》被评为“中国精品科技期刊并获得
“中国科协精品科技期刊工程(项目)资助
据中国科协学会学术部(科协学发E20071162号)文，关于下达 2007年度中国科协精品科技期刊工程项目
的通知 为带动我国科技期刊质量的整体提高，促进国际交流与合作，提高中国科技期刊在国际上的地位和市
场竞争力，推进实施精品科技期刊战略、科教兴国战略、人才强国战略。中．国科协在国家财政部的大力支持下，
组织实施了中国精品科技期刊工程，支持一批学术期刊成为我国学科或专业领域的领衔期刊，成为在同学科领
域内的世界知名科技期刊。根据评审结果，全国有 ii0种科技期刊人选，其中A类 5项，B类 40项，C类 65项。
《广西植物》人选为C类，成为2007年广西唯一人选并受资助的期刊。
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