全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(5)：695— 698 2011年 9月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．05．024
采用高效液相色谱技术分析烟草
体 内的维生素 B6化合物
曾海彬 ，张剑韵2，黄龙全l*
(1．安徽农业大学 茶与食品科技学院，合肥 230036；2．安徽农业大学 生命科学学院 ，合肥 230036)
摘 要：维生素 B6(VB6)是一类化合物的总称 。近年来研究发现 VB6在植物体内发挥抗逆作用 。烟草作为
模式植物其体内 VB6的存在形态还未见报道 。本研究采用高效液相色谱结合荧光检测技术对烟草体内 VB6
的存在形态进行 了分析。结果表明：土壤栽培烟草叶、茎和根中 VB6的含量依次为 2．9、1．7、3．0#g／g鲜重 ；
组培烟草叶片的 VB~含量为 3．9 p-g／g鲜重，构成 比为磷酸吡哆胺(PMP)7 、吡哆胺(PM)14 、磷酸吡哆醛
(PLP)19 、吡哆醛(PL)29 、吡哆醇(PN)30 ；组培烟草在连续 3周的检测过程中，PLP和 PL含量下降、
PN含量上升 ，VB6总量保持相对稳定。研究结果有助于以烟草为材料，进一步开展植物体 内 VB6代谢机制
和特殊生理机制的研究。
关键词：烟草；高效液相色谱；维生素 B6；存在形态
中图分类号：Q945．14 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2011)05—0695—04
Analysis of vitamin B6 vitamers in tobacco plants
by high performance liquid chromatography
ZENG Hal—Bin ，ZHANG Jian-Yun2，HUANG Long-Quan
(1．Colege of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；
2．College of Life Sciences，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)
Abstract：Vitamin B6(VB6)is the general term for a kind of chemical compounds．vt~ exists in several forms，and
has been linked to stress responses in plants．Until now no reports about the distribution of B6 vitamers in tobacco
plants have been observed．In our experiment，the determination of VBIj vitamers in tobacco plants was described by
using HPLC with fluorescence detector．The results indicated that，the contents of VB6 in leaves，tender stem and
roots were 2．9，1．7 and 3．0 p-g／g fresh weight，respectively．Leaves of tobacco plants grown on MS basal media ex—
hibited a high content of 3．9 gg／g fresh weight．The constituent ratio of B6 vitamers were as folows：pyridoxamine
5-phosphate(PMP)7 ，pyridoxamine(PM)14 ，pyridoxal 5-phosphate(PLP)19％，pyridoxal(PL)29 and
pyridoxine(PN)30 ．During the determination period of three weeks，the contents of PLP and PL decreased，and
that of PN increased．The amount of VB6 was relatively constant．Our results would be favorable for further study
on the metabolic mechanism and special physiological mechanism in tobacco plants．
Key words：tobacco plants；high performance liquid chromatography；vitamin B6；existing forms
维生素 B6(vK)是一类吡啶化合物的总称，2一甲
基一3一羟基一5一羟甲基吡啶是其共 同的母体 ，吡 啶环第
四碳位被羟甲基、氨甲基 、甲酰基取代后分别形成吡
哆醇 (pyridoxine，PN)、吡哆胺 (pyridoxine，PM)和吡
哆醛(pyridoxal，PL)，三者相应磷酸酯型为磷酸吡哆
醇(pyridoxine 5-phosphate，PNP)、磷酸吡哆胺(pyri一
收稿 日期：2010—10 25 修回日期 ：2011-03 07
基金项目：安徽省自然科学基金重点项目( 2010Al16)[Support by Key Research Projects of Natural Science of Anhui Province(KJ2010Al16)]
作者简介 ：曾海彬(1985一)，男，湖北孝感人，硕士研究生，从事烟草 VB8代谢方面的研究 ，(E—mail)zenghaibinbin@126．eom。
通讯作者(Author for correspondence，E mail：lqhuang218@yahoo．corn．cn)
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doxine 5、一phosphate，PMP)和磷 酸吡 哆醛 (pyridoxal
5-phosphate，PLP)，其中 PLP是 VB6的主要辅酶形
式 ，参与氨基 酸代谢 的各种反应和其它多种代谢过
程 。近年研究发现 VB6还是一种很强的生物抗氧化
剂，可有效淬灭单线态氧分子和超氧化物负离子(Bil—
ski等，2000)；PLP或其同系物作为细胞信号传导的
调节分子，对一些细胞膜上的离子通道具有调节作用
(Ehrenshaft等，1998，1999)；PLP可保护植物免受高
盐、紫外线、渗透压等环境胁迫因子的影响(Sakai等，
2002)。微 生物 和植 物拥有 VB6从 头合成途径 (de
novo pathway)，动物从食物 中获取 VB ，通过补救途
径(salvage pathway)合成 PLP。
虽然植物是自然界 VB 的主要制造者，但植物
体内VB 的研究开展较晚，VB 代谢机制和特殊生
理机制还有待研究。烟草作为一种模式植物，也成
为 VB 研究的实验材料。2005年 Denslow等率先
从烟草克隆出编码 PLP合成酶 的 PDX1和 PDX2
基因，还发现烟草遭遇病原体侵染后体内的 VB 含
量增加(Sakai等，2005)。另一方面，烟草体内 VB
的存在形态还未见报道。本文通过高氯酸法提取
VB6，采用高效液相色谱 (High performance liquid
chromatography，HPLC)分离和荧光检测技术分析
了烟草根 、茎 、叶组织 中 VB 的存在形 态和主要存
在型的含量变化 ，为进一步以烟草为材料，研究植物
体内VB。代谢机制和特殊生理机制奠定基础。
1 材料和方法
1．1材料与试剂
烟草品种 为云烟 21。盐 酸吡哆醇 (PN—HC1)、
盐酸吡哆醛(PL-HCI)、盐酸吡哆胺 (PM一2HC1)、磷
酸吡哆胺盐酸盐(PMP—HC1)和 PLP购于美 国 Sig—
ma公司。高氯酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸
和 MS培养基的构成试剂 2，4一D、6一苄氨基腺嘌呤
(6一BA)、萘乙酸(NAA)、蔗糖、琼脂粉等均为国产分
析纯 。乙腈采用 HPLC级 ，水为超纯净水。
1．2烟草植物的栽培
采用组培的方式培育烟草幼苗。愈伤组织诱导
培养基、幼芽增殖培养基、生根培养基分别为：MS+
2。4一D 0．5 mg／L+6-BA 1．0 mg／L、MS+6-BA 1．0
mg／L+ NAA 0．2 mg／L、MS+NAA 0．2 mg／L。
上述培养基均添 加 3 蔗糖和 0．8 琼脂 ，pH5．8。
培养 温 度 (25±2)。C，光 照 14 h／d，光 照 强度 36
／,mo1．m一．s。(gg和平等，2003)。
取烟草幼嫩叶片用自来水充分洗净，经 75 酒
精消毒 30 S、0．1 升汞溶液浸泡 8 min、无菌水冲洗
5～6次后 ，将叶片切成 1．0～1．5 cm 的小方块转
接到愈伤组织诱导培养基 中。10 d后，叶片外植体
卷曲、增厚、膨胀，20 d后外植体脱分化形成疏松絮
状浅黄绿色的愈伤组织 ，3O d后从 叶片外植体产生
的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点。将带
芽点的愈伤组织转接到幼芽增殖培养基上培养25 d
后，从愈伤组织上分化出幼芽 ；当芽长为 2～3 cm时
切取幼芽转接至生根培养基上 ，继续培养 35 d长出
约 2 cm 的根 。将 茎高约 5 cm 的幼苗转 移至不含
PN的 MS培养基和营养土泥炭藓 ：蛭石 ：珍珠岩
一1：1：1上开始实验 。试验时间为 3周 ，每隔 7 d
抽样分析烟草体内的VB 。
1．3 VB 的 HPLC分析方法
参照张剑韵 等(2004)的方法，加 以改进。精确
称取 VB6标准 品：PMP 1．4 mg，PM 1．4 mg，PLP
14．1 mg，PL 1．6 mg，PN 1．7 mg；用不含乙腈 的流
动相 A溶解定容 50 mL后稀释成各级使用浓度。
称取 0．5 g样品用液氮充分研磨后转入 5 mL离心
管，按 1／3的比例加人 1 mol／L的高氯酸后涡旋，离
心(8 000 r／min，4℃)2O rain去除蛋 白质 ；取上清加
入等体积的 1 mol／L磷酸缓冲液(pH5．5)后再次离
心(8 000 r／min，4℃)10 min去 盐。所得 上清 经
0．45 m微孔滤膜过 滤后用于 HPLC分析 。为避
免 VB 的光分解，以上操作均在暗室中进行。
分析装置为 Waters 600高效液相色谱仪 ，配有
2475荧光检测仪。色谱柱为H&E公司的XP ODS-
A 5“m 120 A(250×4．6 mm)，柱温保持 30℃。流动
相 A (分 析 用 )：1 (V／V)CH。CN-25 mmol／L
KH2PO4—25 mmol／L NaC104(pH2．5)；流动 B(色谱
柱 清 洗 用)：10 (V／V)CH3CN 一25 mmol／L
KH2PO4—25 mmol／L NaCIO4(pH2．5)；流速均为 0．5
mL／min。荧光检测器调整激发波长 290 nm，荧光波
长 395 nm。进样量均为 5 L。
2 结果与分祆
2．1设定条件下标准 VB 化合物的检出
在所述的 HPLC装置和分析条件下 ，标准 VB
化合物的保留时间依次为 ：PMP 6．0 min、PM 7．3
min、PLP 12．2 min、PL 16．4 min和 PN 24．9 min
5期 曾海彬等：采用高效液相技术分析烟草体内的维生素 Bs化合物 697
(图 1)。配制系列浓度的 5种 VB。标品混合液，分
别 以峰面积为横坐标、注入量为纵坐标计算 回归方
程 ，相 关 系数 分 别 为 ：PMP 0．9998、PM 0．9995、
PLP 0．9997、PL 0．9995、PN 0．9995，可作为定量分
析的依据(图 2)。VB。各型的最低检测量分别为
PMP 2．9×10～ng／uL、PM 1．3×10～ng／~L、PL
6．5×10～ng／gL、PN 2．0×10 ng／~L和 PLP 4．3
×10 ng／ L。VB 化合物 5种形式的保留时间相
对标准偏差为 0．01 ～0．3 ；峰 面积 的相对偏差
为0．37 ～2．95 。重现性和稳定性 良好。取已
知含量的烟草样品 3份，分别加入 VB 五种形式标
准品的混合液，每个添加水平测 3次，根据样品含量
和加标后测定值计算加标回收率，VB 五种形式的
回收率范围分别为：PMP 87 ～ll2 、PM 89 ～
115 、PLP 107 ～ 118 、PL 95 ～ 107 、
PN100 ～103 之间，回收率最高为 118 ，最低
为 87 ，表明此方法能较好地分析 VB 。
图 1 标准维生素 B6化合物的 HPLC色谱图
Fig．1 HPLC pattern of standard VB6 compounds
00
图 2 标准维生素 B6化合物检量线
Fig．2 Standard curves for determination
of each B6 vitamers
图 3 烟草叶片组织 VB6提取液的 HPLC图谱
Fig．3 HPLC pattern of VB6 extract
from tobacco leaves
oo
2．2采用所述方法对烟草植物组织的分析结果
烟草叶片组织 VB 提取液经 HPLC分析，在
PMP、PM、PLP、PL和 PN 的洗脱位置上均出现了
相应的洗脱峰(图3)。在烟草叶片组织 VB 提取液
中加入标准 VB 化合物后 ，无 论是否改 变分析条
件，洗脱峰均未出现分离，可以认为所检出的物质确
实是相应的VB。化合物。此外，整个检测过程没有
出现明显的干扰物质 。
表 1为烟草不同组织 VB 化合物 HPLC定量
分析结 果 。烟 草 叶片组 织 中的 VB 的平 均值 为
(3．0±0．4) g／g FW；构 成 比为 PMP 7 、PM
14 、PLP 19 、PL 29 、PN 30 ；其 中 PLP、PL
和 PN为 VB 的主要存在型。烟草不同部位 VB
的含量依次为根>叶>茎 。实验还发现生长在 MS
培养基上烟草的 VB 含量高于种植在土壤中的同
龄植株。
因为 PLP、PL和 PN 是烟草 VB 的主要存 在
型，连续 3周对生长在 MS培养基上烟草叶片组织
中的 PLP、PL和 PN含量进行 了测定 ，结果发现在
连续 3周的检测过程 中，叶片组织 中的 PLP和 PL
含量下降，PN含量上升，VB。总量基本稳定(表 2)。
3 讨论
高效液相色谱结合荧光检测器检测是分析生物
体内 VBs存在形态的有效方法，具有灵敏度高、选
择性强 、重复性好和分析速度高的优点 ，但在检测时
间段内干扰峰的出现仍然是难以解决的问题 。一般
来说，植物材料检测时出现的干扰峰多于动物材料，
以致许多植物难以采用 HPLC对其 VB。的存在形
698 广 西 植 物 31卷
态进 行 分 析。从 烟 草 植 物 组 织 VB 提 取 液 的
HPLC分析结果来看 ，没有出现明确的干扰峰 ，所分
析的 5种 VB。化合物都能分别定量，结果表示烟草
可作为试验模型 ，用以开展植物体 内 VB 代谢机制
和特殊生理机制的研究。
食 品材料 中 VB 的定量 目前仍然采用微生物
法 ，该方法虽然不能对不 同 VB 进行分别定量 ，但
检测 过 程 中：干 扰 因 素 少 ，仍 具 有 权 威 性 。采 用
HPLC方法 测 得烟 草 叶片组 织 中的 VB。含 量 为
(3．0~0．4)／~g／g FW，与多数蔬菜植物的 VB 含量
表 1 烟草叶片等组织维生素 B6化合物含量的 HPLC分析
Table 1 VB6 contents determined by HPLC in tobacco plants(~g／g fresh weight)
注 ： 土壤栽培 ；一 组织培养 。 Grown in soil；一 Grown on MS basal media．
表 2 烟草叶片组织中 PLP、PL、PN和 VB6总量的变化
Table 2 Changes of PLP，PL，PN and VB6 total contents in tobacco leaves(~g／g fresh weight)
接近(孙远明等 ，2002)。温其标 (1997)的研究结果
发现小麦、大麦、玉米、小米和高粱等谷物 中所含
VB 的主要形式是游离吡哆醇和吡哆醇葡萄糖苷，
PLP和 PMP含量甚微 ，其中小麦和小米的 VB 含
量为 3．0 mg／kg，高粱只有 0．5 mg／kg；另外，大麦
中 PN的比例达到了85 ，其他谷物中则以生理活
性小的吡哆醇葡萄糖苷为主(比VB。的非糖苷形式
较难被人体吸收利用)。吕岱竹等(2008)对热带水
果中 VB 的含量进行分析，结果在龙眼和莲雾中未
检测 出 VB6。
目前已经 明 确 细菌 首 先合 成 PNP，在 PNP／
PMP氧化酶 的作 用下 ，PNP进一步被氧化成 PLP
(Notheis等 ，1995；Zhao等，1995)。植 物和真菌相
类似，拥有直接合成 PLP的酶系(Ehrenshaft等，
1999)。PLP含有强活泼性 的醛 基 ，极易和细胞 中
的亲核物质和蛋白质形成复合体。因此，生物体体
内游离存在的 PLP一般维持在一个较低 的水平 ，过
量生成 的 PLP受磷酸酶的作用迅速水解 为 PL，PL
受 PL还原酶的作用可以转变为 PN(Mitsuhiro等，
1999)。实验 所 观察 到 的叶片 组织 中 PLP、PL和
PN含量的变化，可能反映了烟草体内VB 的主体
代谢流 向。
由于 PNP无标准品出售 ，本文未对烟草植物组
织 中的 PNP进行分析。在我们的早期研究 中，采用
相同的 HPLC方法 ，由 PLP衍生化得到的 PNP的
洗脱位置在 PM 和 PLP之间(张剑韵等 ，2004)。在
整个烟草 组织 VB 的 HPLC分 析过程 中，PM 和
PLP位置之 间始 终没有 出现有意义 的洗脱峰 。因
此 ，可以认为烟草体内的 PNP含量很低 。
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71O 广 西 植 物 31卷
明多种疾病的发生和发展与自由基对组织细胞的损
伤关系密切，本文也为进一步对其小叶红叶藤挥发
油进行抗衰老、抗老年痴呆等老年退行性疾病相关
药理作用的研究奠定基础，其抗氧化机理有待进一
步研究。
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