全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(5)：664— 668 2009年 9月
抗冻蛋白(afp)基因表达载体的构建
及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化
徐春香1，何勇强2，尉义明 ，卢博彬 ，胡桂兵1，陈厚彬
(1．华南农业大学 园艺学院。广州 510642；2．广西大学 生命科学与技术学院，南宁 530005)
摘 要：通过 PCR从‘京都七寸人参 ’胡萝 卜基因组 DNA中扩增抗冻蛋白基因，测序结果表明该基因的核苷
酸序列与从宁夏‘吴忠 ’胡萝 b中克隆的完全一致。先后将获得的胡萝 卜afp基因克隆和亚克隆至 pMD18一T
和 pBI121，构建植物表达载体 pBI121一afp。通过冻融法将 pBI121一afp导入根癌农杆菌 EHA105中。以香蕉
栽培品种‘北大矮蕉’的胚性细胞悬浮系为受体，采用农杆菌介导法将胡萝 卜afp基因导入其中，然后在 Ka—
namycin的选择压力下通过体细胞胚发生途径进行植株再生。共获得抗性再生植株 9株，其中两株经 PCR检
测呈阳性，可初步确定目的基因已经整合到这两株转基因香蕉植株的基因组中。
关键词：香蕉；胚性细胞悬浮系 ；根癌农杆菌介导法 ；遗传转化
中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3t42(2009)05—0664—05
Construction of a plant expression vector containing
‘ ‘ ‘ 一 ‘
an d it S transtormation
embryogenic cell S
XU Chun-Xiang1，HE Yong-Qiang2，WEI Yi—Ming1，
LU B0一Bin1，HU Gui—Bing1，CHEN Hou—Bin1
(1．College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；
2．Colege of Life Science and Technology，Guangxi University。Nanning 530005，China)
Abstract：Antifreeze protein(afp)gene was amplified by polyrnerase chain reaction using genomic DNA extracted
from the seedling of carrot CV．Jingdou Qicunrenshen．Sequencing result showed that there was no difference in nude—
otide sequence between this afp gene and that cloned from‘Wuzhong’carrot in Ningxia．afp gene was subsequently
cloned into intermediate vector pMD18一T and binary vector pBll21 to construct plant express vector pBI121一afp，
which was transformed into Agrobacterium tume
．
faciens strain EHA105 by freeze-thaw method．Agrobacterium tu一
7he faciens—mediated method was used to introduce alp gene into the embryogenic cell suspension of Musa AAA Cav—
endish CV．Beida Aijiao，followed by plant regeneration v／a embryogenesis．PCR analysis showed that 2 from 9 ob—
tained regenerated plants resistant to kanamycin were positive，which possibly indicated that afp gene has been inte—
grated into the genome of banana plants．
Key words：Banana；embryogenic cel suspension；Agrobacterium tumefaciens—mediated method；genetic transformation
收稿 日期：2008—08—25 修回日期：2008。1l一12
基金项目：广西科学基金(桂科基0009017)；广东省自然科学基金(o70。6698)；广东省科技攻关项目(2006A20201007)；农业竹业专 (nyhyzx07—029)
[Supported by Guangxi Science Foundation(GKJ0009017)；Natural Science Foundation of Guangdong(07006698)；Key Technologies Research and Develop-
ment Program of Guangdong Province(2006A20201007)；the Special fund for Agro-industry(nyhyzx07—029)]
作者简介：徐春香(1969一)，女，江西九江人，副教授 ，主要从事香蕉生物技术方面的研究，(E—mail)chxxu@seau．edu．cn。
5期 徐春香等 ：抗冻蛋 白(alp)基因表达载体的构建及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化 665
香蕉(M~sa spp．)是重要的热带亚热带水果与
粮食作物 ，2006年我国年产量超过 600万吨(中国
农业年鉴编辑委员会 ，2006)。除了枯萎病等严重病
害外，我国香蕉的生产还受到冷害的威胁。如 20世
纪 9O年代 ，我国香蕉主产区就先后 4次遭遇重大寒
潮的袭击。最根本、最有效的措施就是栽培优质、抗
性强的品种。然而，香蕉 的主要栽培品种均为三倍
体，难以通过传统的杂交育种方式获得品质好、抗性
强的优良新品种。利用包括基因工程技术在内的生
物技术培育香蕉抗病新 品种成为必要。至今 ，国内
外均未见有香蕉抗寒遗传转化的研究报道。
香蕉胚性细胞悬 浮系 (Embryogenic cell SUS—
pension，ECS)是遗传转化的理想受体 ，因为通过体
胚发生途径的植株再生通常是单细胞起源的，可大
幅度减少甚至避免嵌合体的产生(Roux等，2004)。
近年来，国际上香蕉遗传转化已开始采用 ECS为受
体(Ganapathi等，2001；Khanna等，2004)，但至今
国内所有的香蕉遗传转化报道均以茎尖为受体(李
华平等，2000；黄霞等，2002；林德球等，2004)。
从胡萝 卜(Daucus carota)中克隆的抗冻蛋白
基因(Antifreeze protein，．fp)不仅 具抗冻 活性
(Worral等，l998；Fan等，2002)，还有提高生物耐
冷性的功能(赵凌等，2006)。本文在成功建立香蕉
ECS和体细胞胚发生途径植株再生体系的基础上
(徐春香等，2004a，b；Xu等，2005)，采用根癌农杆菌
介导法，将从胡萝 卜中克隆 的 ．fp基 因导人香 蕉
ECS，然后通过体细胞胚发生途径进行植株再生，以
期为通过基因工程技术培育香 蕉抗 寒新 品种奠定
基础 。
1 材料和方法
1．1材料
目的基因供体为市售‘京都七寸人参’胡萝 卜
(DaUCU5 carota)，播种萌芽后采用 CTAB法提取幼
叶基因组 DNA备用。遗传转化的受体为‘北大矮
蕉’(Musa AAA Cavendish)的 ECS，保存在华南农
业大学热带亚热带果树实验室。大肠杆菌(E．coli)
菌株为 JM109，根癌农杆 菌(Agrobacterium tume一
． ciens)菌株是 EHA105。基 因克隆载 体为 pMD
l8一T，植物表达载体为 pBll21。
1．2方法
1．2．1 afp基因的克隆 根据已发表的胡萝 卜．fp
基因序列(尹明安等，2001)设计 l对特异引物 ，分别
在正向和反向引物的 5 端加入 XbaI和 SacI酶切位
点，以方便后续步骤 中 目的基 因与植物表达载 体
pBI121的连接并保证 目的基 因按 正确方 向插 入。
引物序列：正向 5 TCTAGA(XbaI酶切位点)ATG
AAT ATT GAA TCA TCT TTC TGC 3 ，反向 5
GAGCTC(Sacl酶切位 点)CTA GCA TTC TGG
CAA TGG AGC A 3’。由于胡萝 卜．fp基因中不
含内含子(尹明安等，2001)，所 以直接 以其基 因组
DNA为模板进行 PCR扩增。PCR反应条件 ：94℃
预变性 4 rain，94℃变性 1 min，55℃退火 l min，72
℃延伸 1 rain，反应进行 3O个循环，72℃最终延伸
10 min。PCR产物经纯化回收后 与 pMD 18一T载
体(Takara)连接(按生产商推荐的方法进行)，构建
重组质粒(命名为T—afp)。重组质粒按文献(Sam—
brook等，1992)进行转化、筛选与抽提。经酶切鉴
定呈阳性的克隆用于序列测定。酶切反应体系为：
10×缓冲液 2 L，XbaI l L(Takara)，Sac I l L
(Takara)，待检质粒 1O L，加 ddH2O至总体积 2O
L，37℃下反应过夜。序列分析由宝生物工程(大
连)有限公司完成。
1．2．2“
． 基因植物表达栽体的构建与工程茵的获
得 测序结果表明含正向插入目的片段的重组质粒
用 Xba I和Sac I对其进行双酶切，纯化回收约1．1
kb的 目的 DNA片段；再用相同的酶对 pBI121进行
双酶切，回收约 10 kb大小的线状 pBI121载体，并
将二 者 进 行 连 接，构 建 植 物 表 达 载 体 ，命 名 为
pBI121一．fp。pBI12卜．fp对 大肠 杆 菌的转 化、筛
选、抽提与酶切的方法均参 照文献(Sambrook等，
1992)进行 。经酶切鉴定 呈阳性 的 pBI121一．fp克
隆采用液态冻融法(Sambrook等，l992)转化根癌
农杆菌，经 PCR检测呈阳性的克隆用于香蕉 ECS
的遗传转化。引物序列与PCR反应条件同 1．2．1。
1．2．3香蕉 ECS受体 系统遗传转化体 系的建立
过夜培养(14～l6 h)的工程菌液，4 000 g离心 1O
min，弃上清，用ZZL液体培养基(Dhed’a等，l991)
重悬浮至 OD㈣=0．4左右(含 AS 150／Lmot·I )，
加入约占总体积三分之一，继代后培养 7 d的悬浮
细胞，使 AS的终浓度约为 100／~mol·L ，于 21～
22℃、20~30 r·rain。条件下进行侵染。侵染结束
后，吸干悬浮细胞表面的菌液后将其转入含 100
／~mol·L- AS的 ZZSS(Dhed’a等，1991)培养基中
21～22℃下黑暗条件下共培养 6 d。共培养结束后
666 广 西 植 物 29卷
的细胞转到筛选培养基(ZZSS+50 mg·L- 卡那霉
素和 500 mg·L 羧苄青霉素)上，28℃下暗培养 ，
每 2周继代 1次，继代 2次后将羧苄青霉素浓度降
至 300 mg·L～。8周后 ，按徐春香等(2004b)所描
述的方法进行体细胞胚与植株再生 ，整个植株再生
过程添加羧苄青霉素的浓度均为 100 mg·L- ，添
加卡那霉素浓度除生根培养基中为 100 mg·L～，
其余在体细胞胚再生、成熟、萌发培养基中均为 5o
mg·I ～，每 2周更换培养基一 次。以未经转化 的
ECS在不添加卡那霉素和羧苄青霉素的培养基上
进行体细胞胚与植株再生为对照。
以从 l g细胞转化所获得的抗性植株与从 1 g
对照所获得的再生植株数之比为遗传转化效率 。
1．2．4 PCR检测 CTAB法提取转基因植株和对照
的基因组 DNA。用 n厂p基因特异性引物进行 PCR
检测。引物序列及 PCR反应条件均同 1．2．1。
2 结果与分析
2．1胡萝 卜afp基因植物表达载体的构建
以胡萝 卜幼叶基因组 DNA为模板，经 PCR扩
增、纯化回收后所获得的目的片段见图 l，其长度约
1．1 kb，与预期一致，表明目的基因已被成功扩增。
200O
1 0O0
750
5O0
250
1 00
图 1 胡萝 卜基因组 DNA中目的基 因片段的扩增
Fig．1 The amplification of interest fragment
from genomic DNA of carrot
M．DNA marker DL2000；1．PCR产物 。
用 Xba I和 Sac I对重组质粒 T--． 进行酶切
所获得的结果见图 2，表明 目的基 因已被成功克隆
至 pMD18一T载体。测 序结果 表 明：‘京 都七 寸人
参’胡萝 卜的目的基因长 l 099 bp，其核苷酸序列与
从宁夏‘吴忠’胡萝 卜中克隆的 a．fp基因(尹明安
等，2001)完全一致，核苷酸同源性为 100 (核苷酸
序列省略)，证明所克隆的目的片段正是 “厂户基因。
231 30
ge39
4361
8l；
564
1 25
200O
g80
500
250
1 O0
图 2 重组质粒 T—n， 酶切结果
Fig．2 Restriction enzyme digestion of
recombinant T—afp plasmid
M1．x-Hind 1I DNA marker；1．2．重组质粒 Xba I和
Sac I双酶切 ；M2．DNA marker DL2000．
20OO
黜
5O0
250
1 00
图3 重组植物表达载体 pBI121-afp酶切结果
Fig．3 Restriction enzyme digestion of
recombinant pBI121一a
．fp plasmid
MI．k-Hind 11 DNA marker；1-4．重组质粒 Xba I
和 Sac I双酶切；M2．DNA marker DL2000．
测序结果还表明 目的片段在克隆载体内的连接方向
为正向的(测序结果略)。用 Xba I和 Sac I对植物
表达载体 pBI12卜a．fp进行 酶切 ，也可切下大小约
为 1．1 kb，与预期一致的产物(图3)，表明植物表达
载体构建成功。随机挑取几个经液态冻融法转化的
根癌农杆菌 EHA105克隆进行 PCR检测，结果均
呈阳性反应(图 4)，表明携带胡萝 卜“fp基因的植
物表达载体已成功转化至根癌农杆菌中，可用于下
一 步香蕉 ECS的遗传转化。图 5是重组质粒
pBI12卜．fp的区段示意图。
2．2转化子的筛选与体细胞胚发生途径植株再生
‘北大矮蕉 ’的 ECS转人筛选 ZZSS培养基后 ，
2周内转化材料的生长情况与对照问的差异不明
显：对照没有褐化现象，极少量直径很小的细胞团在
接种后 2周内褐化死亡(通常在边缘)，转化后的实
验材料基本也不会发生褐变现象，只有极少量的细
5期 徐春香等：抗冻蛋 白(afp)基因表达载体的构建及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化 667
胞团褐化死亡 ，通常呈点状分布而不是 固定在边缘。
约在接种至筛选培养基 4周后 ，在抗生素的持续作
4-500
30OO
1 75O
1 5O0
1 000
750
500
250
图 4 EHA1O5菌株中afp基因的 PCR扩增
Ng．4 PCR amplification of a fpgene in EHA105 strain
M．250bp ladder marker；1—2．空 白对照；3．质粒；
4-8．转化 EHA105克隆 。
用下，转化材料中死亡的细胞量逐渐增多，可以很明
显地观察到呈点状分布的黑褐色斑点 ，细胞的增殖
量明显少于对照。而对照的细胞在不含任何抗生素
的 ZZSS培养基上迅速增 长，初期少量的死亡细胞
因所占比例下降而不易被观察到。8周后，转化材
料中的黑褐色斑点逐步连成一片 ，与黄白色细胞相
间并存 ，并已有少量再生体细胞胚 出现 (图 6：A)。
在RD1体细胞胚再生培养基筛选8周后，再生体细
胞胚进一步增大(图 6：B)，在 RD2体细胞胚成熟培
养基上培养 4周后，大多数再生体细胞胚在抗生素
的选择压力下逐渐褐化死亡，只有少量体细胞胚萌
发(图 6：C)。将获得 的再生体胚转人 REG培养基
后萌生叶(图 6：D)，在生根培养基上已萌发的再生
材料其叶鞘进一步伸长 ，并诱导产生根，最终获得完
整的再生植株(图 6：E)。
图 5 质粒 pBI1 2l ，P的区段示意图
Fig．5 The construction of plasmid pBI1 21一afp
图 6 ‘北大矮蕉’胚性细胞悬浮系遗传转化后体细胞胚发生途径植株的再生
Fig．6 Plant regeneration from the embryogenie cel suspension of MuSa AAA CV
,
‘Beida Aijiao’via embryogenesis after transformation
A．ZZSS培养基筛选 8周；B．RD1培养基 8周；c．RD2培养基 4周；D．REG培养基4周；E．生根培养基 4周。
A．Screening on ZZSS medium for 8 weeks；B．Eight weeks after inoculation on RD1 medium；C
． Fouf weeks after inoculati0n
on RD2 medium；D．Four weeks after inoculation on REG medium；E
． Four weeks after inoculation on rooting medium
2．3遗传转化效率
实验中从每克未经转化和筛选的细胞所获得的
再生植株数为 1 080株 ，而从 0．76 g转化细胞经筛
选后共获得抗性再生植株 9株，折算从每克经转化
和筛选的细胞所获得的再生植株数为 11．8株。因
此，所获得的遗传转化效率约为 1．1 。
668 广 西 植 物 29卷
2．4 PCR分析
提取 9株抗性植株的基因组 DNA，以非转基因
体细胞胚发生途径再生植株为对照进行 PCR检测，
从其中2株转基因植株能扩增出与 目的基因大小一
致的条带(约 1．1 kb)(图 7)，从 而证明了转基因植
株 中．fp的存在。PCR阳性率为 22．22 。
20O0
1 000
750
500
25O
1 00
图 7 转基因植株 n-厂 的 PCR扩增检测
Fig． PCR amplification of a{．p in transgenic plants
M．DNA marker DL2000；I．空 白对照；2．质粒 ；
3．阴性对照 ；4—5．转基 因植株。
3 讨论
Worral等(1998)首次从 英国胡萝 b(var．／U—
tumn)中克隆到n． 基因。尹明安等(2001)从耐寒
性很强的中国宁夏 ‘吴忠 ’胡萝 卜中也 克隆到 n厂p
基因，其核苷酸序列与英国胡萝 卜的同源性为 98．
5 9，6。本研究从‘京都七寸人参’胡萝 b克隆到的
n 基因与宁夏‘吴忠’胡萝 卜中克隆到的同源性高
达 100 ，这表明胡萝 卜中的afp基因高度保守。
尽管 国内已有一些成功建立香蕉 ECS的报道
(徐春香等，2004a；2oo4b；Xu等，2005)，但至今尚未
见有以香蕉 ECS为受体系统进行遗传转化的报道。
本文在成功建立我国香蕉栽培品种 ECS的基础上，
采用根癌农杆菌介导法将胡萝 卜afp基因导入香
蕉 ECS，成功获得 了转基 因植株 ，为通过基因工程
技术培育香蕉新品种奠定基础，同时也能为其他功
能基因对香蕉 ECS的转化提供参考。
本研究中所获得的遗传转化效率相对较低。可
能原因如下：1)本次实验中采用的 ECS年龄偏老(2
年)，有研究表明年龄小于 6个月的香蕉 ECS最适
于遗传转化(Remy，2000)；2)与遗传转化效率的计
算方法有一定的关系，本研究中以从 l g细胞转化
所获得的可能的转化植株与从 1 g对照所获得的再
生植株数之比为遗传转化效率，较准确、合理地对
ECS为受体时所获得的遗传转化效率进行了计算；
3)抗生素在植株再生过程中长期(约 6个月)、不间
断的使用影响了转化效率。如果只经过 2个月的抗
生素筛选后去除抗生素的选择压力，有可能大幅度
地提高遗传转化的效率 ，但同时也会降低 PCR检测
的阳性率。此外 ，提高 ECS的质量、探讨离心和真
空等技术在香蕉 ECS遗传转化 中的应用 ，将有利于
遗传转化效率的提高。
Worral等 (1998)将从冷诱导的胡萝中克隆的
afp基因的 eDNA序列导人烟草后 ，成功检测到了
“
．厂户基因的组成型表达，发现转基 因烟草提取物可
以抑制冰晶的生长。将从胡萝 卜中克隆的 n． 基
因转入烟草，结果发现转基因烟草的耐冷性比野生
型烟草的还要强(Fan等，2002)。赵凌等(2006)利
用花粉管通道法将从胡萝中克隆的 ．fp基因转入
籼稻中，获得了转基因后代，并对 T3代和 T4代转
基因植株进行苗期耐冷性鉴定，结果发现这些转基
因苗获得了不同程度的耐低温性。本研究中获得的
PCR检测呈阳性的转化植株其抗寒性能还有待于
进一步研究 。
参考文献：
中国农业年鉴编辑委员会．2006．中国农业年鉴[M]．北京：中
国农业出版社 ．192一l94
Dhed’a D．Dumortier F，Pards B．ela1．1991．Plant regeneration in
cel suspension cultures of the cooking banana ev．Bluggoe(Musa
spp．ABB group)[J]．Fruits。46(2)：125—135
Fan Y，Liu B。Wang H，et a1．2002．Cloning of an antifreeze pro—
tein gene from carrot and its influence on cold tolerance in trans—
genie tobacco plants[j]．Plant Cell Rep，21(4)：296—301
Ganapathi TR．Higgs NS．Balint—Kurti PJ．eta1．2001．Agrobacte—
rium-mediated transformation of embryogenie cell suspensions of
the banana cuhivar Rasthali(AAB)[J]．Plant Cell Rep，20(2)：
157— 162
Huang X(黄霞)，Huang XL(黄学林 )，Li Z(李哲)，et a1．2002．
Factors Mfecting the early phase of Agrobaeterium‘mediated ge—-
netic transformation of banana(影响根癌农杆菌介导的香蕉基
因转化早期的主要因素)[J]．Acta Univ Sunyatseni(Sci Nat)
(中山大学学报 ·自然科学版)．41(5)：68—72
Khanna H．Becker D．Kleidon J，et a1．2004．Centrifugation assis-
ted Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(CAAT)
of embryogenie cel suspension of banana(Musa Spp．Cavendish
AAA and Lady finger AAB)[J]．Mol Breeding，14：239—252
Li HP(李华平)，Hu JS(胡晋生)，Wang M(王敏)，et a1．2000．
Genetic transformation system of banana meristems(香蕉茎尖遗
传转化法研究)[J]．Chin J Trop Crops(热带作物学报)。21
(4)：33—38
Lin DQ(林德球)，Qv LH(屈 良鹄)。Zhang HD(张宏达)．2004．
(下转第 710页 Continue on page 710)
710 广 西 植 物 29卷
效果好，质量浓度在 l4．55～116．40 t~g／mL范围内
与峰高呈良好的线性关系(r一0．9999)，平均回收率
为 97．56 9／6。将该方法应用于样品的测定，其稳定
性、重现性和准确性 良好，可作为牙膏的质量控制
方法 。
参考文献：
邓婷婷 ，刘素纯，贺建华．2008．柚皮提 取物有效成分的研究概
况[J]．中国食物与营养，6：16—19
Feng BM(冯保民)，Yuan YG(苑艳光)，Pei YH(裴月湖)．2001．
Chemical and pharmacological advances of the study on Citrus
grandis(柚的化学与药理研究进展)[J]．J Shenyang Pharm
Univ(沈阳药科大学学报)，18(3)：228—232
Han CX(韩彩轩)．2003．Detection of naringin from healthy foods
by using reversed phase high perform ance liquid chromatography
(反相高效液相色谱法测定保健食品中的柚皮苷)[J]．China
Trop Med(中国热带医学)，3(3)：357—358
He ZD(贺肇东)，Chen Q(陈强)，Zhu BF(朱贲峰)，et a1．2008．
De termination of naringin in fructus ponciri trifoliatae by Rp-
HPLC(P HPLC法测定 绿衣枳实 中柚 皮苷 的含量)[J]．J
Strait Pham(海峡药学)。20(5)：37—38
Huang GW(黄光伟)，Wei BH(韦宝韩)，Lu KL(卢凯玲)，et a1．
2009．Dtermination of total flavonoidS from the extract of G nk—
go leaf in toothpaste by HPLC(HPLc法测定牙膏 中银杏叶提
取物总黄酮的含量)[J]．FlavourFragrance Co~vnetics(香料香
精化妆品)。3：25—27
Jia DY(贾冬英)．Yao K(姚开)，Tan M(谭敏)，et a1．2001．Ad—
vance in research of physiologicaly-active compounds in pummelo
peel(柚果皮中生理活性成分的研究进展)[J]．Foodand Fer—
mentation Industries(食品与发酵工业)．27：77—78
Jia DY(贾冬英)．Yao K(姚 开)，Tan M(谭敏)．2002．Ethanol
extract processing of narigin from pummelo periearp(柚皮中柚
皮苷的乙醇提取工艺研究)[J]．Chin Trad Herb Drugs(中草
药)，33(9)：8O1-802
Lin CM(林春绵)，Wang 72(王忠杰)，Mao HZ(茅惠忠)．1996．
A study on the extraction and stability of the pigment from pom—
elo peel(柚皮 色素 的提 取及 其稳 定性 研究)[J]．Food and
Fermentation Industries(食品与发酵工业)，4：5o一53
Li F(李芳)，Zhou JP(周建平)，Lei JL(雷建林)，Cao XX(曹勋
学)，et a1．2007．Determination of naringin in Jiegu Xuiin cap—
sules by HPLc(HPLC测定接骨续筋胶囊 中柚皮苷的含量)
[J]．Modem Tradi Chin Med(现代中医药学)，27(6)：57—59
su DL(苏东林 )，Shan Y(单 杨)，Li GY(李 高 阳)，et a1．2008．
De termination of hesperidin and narigin in in citrus peel by RP-
HPLC simuhaneously(PR-HPLC法同时测定柑桔皮 中橙皮
苷和柚皮苷的含量)EJ]．Sci F0 Industry(食品工业科
技)，6：288—290
Su L(苏玲)，Liu QD(刘启德)．2008．Biological activity and pbar—
macokinetics of Naringin(柚皮苷生物活性和药代动力学研究
新进展)[J]．Chin J P^ n Economics Management(中国
医药技术经济与管理)，2(10)：74—8O
Wang LG(王林果)，Jiang LY(蒋玲 艳)，Huang GH(黄 国欢)，et
a1．2008． Extraetion and Application of Dietary Fiber from
Pomelo Peel(柚皮中膳食纤维的提取及其应用)[J]．J Anhui
Agric Sci(安徽农业科学)。36(24)：10 492—10 494
Yang Y(杨洋)，Yu L(余炼)。Deng LG(邓立高)，et a1．2001．
Study on extraction technology of flavonoid from pomelo peel and
determination(柚皮 黄酮 的提取工艺及其含量测定)[J]．
Guangxi J Light Industry(广西轻工业)，4：47—50
Zhang C(张展 )．Liu aw(刘 志伟 )．2000．Extraction of pomelo
peel oil by super critical C02(COz超临界萃取技术提取沙 田
柚皮的研究)[J]．FlawurFragrance Cosmetics(香料香精化妆
品)，3：10—12
(上接第668页 Continue from page 668)
The cloning of replicase gene of banana bunchy top virus and the
gene expression(香蕉束顶病毒复制酶基因克隆及转基因表
达)[J]．J Trop and Subtrop Bot(热带亚热带植物学报)，12
(4)：142—146
Remy S．2000．Genetic transform ation of banana(Musa spp．)for
disease resistance by expression of antimicrobial protein[D]．
Belgium：K．U Le!uven
Roux NS，Toloza A，Dolezel J，et a1．2004．Usefulness of embryo～
genie cell suspension cultures for the induction and selection of
mutants in Musa spprCq／／Jain SM．Swennen R．Banana im’
provement：celular，molecular biology，and induced mutations．
Enfield USA：Science Publishers，Inc：33—43
Sambrook J，Ffistch EF．Maniatis 1992．Molecular cloning：A labora—
tory manual(2nd ed)[ ．CoId Spring Harbor Laboratory Press
Worrall D。Elias L．Ashford D，el a1．1998．A carrot leueine-rich-
repeat protein that inhibits ice reerystalizationl-j]．Science，282
(2)：115—117
Xu CX(徐春香)，Panis B，Strosse H，el a1．2004a．The induction
of embryogenie calus and establishment of embryogenic cel SUS—
pension of Mus spp(香蕉胚性愈伤组织的诱导及胚性细胞悬
浮系的建立)[J]．J South China Agric Univ(Sci Nat)(华南农
业大学学报 ·自然科学版)，25(1)：7O一73
Xu CX(徐春香)，Panis B，Stros~ H，et a1．2004b．Factors affecting
banana(^ spp．．AAB Group)plant regeneration via embryo—
genesis(影响体胚发 生途径香蕉植 株再生的因素)EJ]．Plant
Physiol Commun(植物生理学通讯)，2004，40(3)：293—296
Xu CX．Panis B，Strosse H，eta1．2005．Establishment of embryo—
genie cel suspensions and plant regeneration of the dessert ba—
nana Wiliams(Musa AAA group)[J]．J of Horti Sci Biotech，
80(5)：523—528
YinMA(尹明安)，Cui Hw(崔鸿文)，Fan DM(樊代明)，et a1．
2001．CIoning and sequencing of antifreeze protein gene in Dan—
CUS carota var sativus Hoffm Deutschl(胡萝抗冻蛋 白基因的克
隆及测 序)[J]．Acta Bot Boreal—Occident Sin(西 北植 物学
报)，21(2)：226—231
Zhao L(赵凌)，Wang CL(王才林)，Zhang YD(张 亚东)，et a1．
2006．Transform ation of antifreeze protein gene(AFP)from car—
rot((DaUCUS carota)into rice(Oryza sativa L．)by polen-tube
pathway(花粉 管介 导的 转抗冻 蛋 白基因 (AFP)水稻)[J]．
Jiangsu J Agri Sci(江苏农业学报 )，22(4)：315—317