全 文 ：@ f1]一渤
广西植物Guihata 20(2)：1 77 18,3 2000年j月I1]
文 章 编号 ：1 000—3142(2000)02—01 77一
产 生光活化杀虫剂 oc一三连噻吩
发根培养体 系的建立
， 徐 汉
(华 南 农业 大 学 资源 环境 学院 ．广 尔广州 51064 2 J
s 2
5482．；7，
摘 要 ：以万寿菊 (T’agetes㈣ fd1 )幼嫩健壮无苗叶片为材料 ，与发根农杆苗 (Agrobactew洲 rhi
zogenes)R1601共培养 ．成功地诱导井建立起 了万寿菊发根离体培养体系。利用 HPLC C 反相柱
分析万寿菊发报中 a一三连噻吩的含量 ．发现其含量在 6．1 0～7 73 txglg fw之间 ：还研究 r万寿菊
发根低
关 键 词
中图分
响 萁 生 恬 力
The foundation of Tagetes erecta L． hairy root
cul turing system producing phOt0actiVited
pesticide oc—terthienyl
HOU Xue—wen，XU Han hong，匮 堕匦玉圈
corA,ge c N atural IG-～ c⋯ I Em,h。⋯ “·S~mth Ckana AgⅢ ult~ral Lr,Jiz,er~
with Agrobacterium rhizoge~res R 1 60l—and the hairy root cultu ring system was btduced and folmded
through kanamycin resistance screening The~mount。f terthieny[between 6 10 and 73 itg,g．fw
in hairy 1001：of Tagete~㈣ fd L w analyzed hy HPI C Cl Reverse—phase co[Uta h；The possdfithv of
storing hai ry root in low tem perature also discussed—m ean while．the ability of hairy root not
reduced after 10 weeks storing ill 4 C refrigerator
Key words：Tagete．~erecta L．：d *erthienyl；hai ry root
化学合成杀虫剂在控制农业害虫、卫生害虫 、仓储害虫等方面已发挥着重要作用．但由
于长期使用而带来了抗药性 (Resistence)、害虫再猖獗 (Resurgence)、残留 (Residue)问题．
即著名的 “3R”问题 。为了解决这些问题 ，需要高效 、低毒、低抗性、低残留的安全农药．为
收 稿 日期 1 999—05—25
作 者 筒介 ：侯 学 文 (】969-)-男 ．现 为华 南 农业 大学 研铱 环 境学 院博 士后 研究 ^员 ．主要 从 事植 物谯 生{ 谢产 协研究
基金项目：广东省自然科学基金 (960{29)和高较博士点基金 (970501)资助项 目
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2期 侯学文等：产生光活化杀虫剂 n三连噻吩发根培养体系的建立 I78
此人们逐酝将 目光转向具杀虫活性的天然植物次生代谢物质 即植物性杀虫剂。华南农业犬
学昆虫毒理研究室在植物性杀虫剂领域作出 r卓有成敬的贡献 ，对鱼藤酮⋯、印楝、川愫 等
进行 了，系统而深入的研究 但植物性杀虫剂的来源常受到地域、季节 、土地资源、生态条件、
气候等诸多因素的制约 ，将植物细胞培养技术引入到植物性杀虫剂的生产中来可望解决这一
问题 。植物细胞培养技术在生产具重要医疗价值的药物 t如长春新碱 、紫杉醇 )、色素 (缸
紫草宁)、保健品 (如红景天、人参皂甙)等进行了许多研究．并取得了一定成功。固植物性
杀虫剂产品的品质要求相对较上述产品宽橙得多．即大大降低了下游工序成率 ．因此更具竞
争潜 力。
万寿菊 (Tagetes erect⋯1 )中 富含 多聚炔类 ，这类化 台物 具有 广泛 的生物 活性 ．如强 烈
的杀线 虫活性 ，以及对 细菌 、真菌 、杂草 、害虫 都有杀 灭活性 ．甚至还 具有抗 H1V 的活性 ；这
一 类化合物具有光活化特性 ，即在近紫外光 (300~ tO0 Dn1)光照条件下．其活性被l夫太提高 ．
同时发生光降解，在阳光下其半衰期约为 4 h 。因此这类化台物符合作为安全、高教 、低残
留农药的基本特征 ，具有进一步开发应用的价值 。a一三连噻吩 ( lerthieny[)主要存在 f万寿
菊的根部 ，其它部位 仅有微量存 在 鉴 于上述情 况 ，本研 究拟采用 发根农杆 菌 R】60I转 化刀
寿菊外植体 ，诱导建立发根培养体系，这是因为发根不仅生长速度快 ，次生代谢物含量也较
高．遗传性质稳定 ，从而开辟一个植物性杀虫剂的新来源
1 毡料 s 、盎
1．1材 料
1．1，l植 物材料 万 寿菊 (Tagetes erecta l ．)取 自本室 杀虫植 物标 本 园
1．1．2细菌茴株 发根农杆菌 (Ag~bactermm rhizogenes)R160l是将具广宿主超致病能力的
Tl质粒 pTiBO 542的片段 pTVK 291动员人发 根农杆菌 R1 500而形 成的工 程菌株 ，具有 宿主
范围广 ，诱导发 根能力强 的特点 。。：。
1 1．3试剂 胰蛋白胨和酵母粉为英国 Unipath公司产品 ；n一三连噻吩为 Sigma公司产品：羧
苄青霉素为上海第三制药厂产品；卡那霉索 为广东省利民制药厂产品，其余试剂均为国产分
析纯 或生化试剂 。
1 2方 法
1 2 1发根农杆茵的培养 将保藏的发根农杆菌 R1601在含卡那霉素 I_00~-g／mI 的 I 1 平板
上进行活化培养，培养温度为 28 c，挑取单菌落于 I B液体培养基中 【含 i00~*g／m1 卡那霉
素 )，于 28。C下振荡培 养 24~28 h，培 养物 经适 当稀 释后 即可用 于转 化
1 2 2万寿菊的转化及发根的诱导 参照 费厚满等“ 的方法进行。取万寿菊幼嫩健壮叶片．用
自来水洗净。此后操作均在无菌环境下进行 ，叶片用 75 酒精表面灭菌 30 s，立即转人 0 I
Hgcl：中消毒 10 min，再用无菌水反复冲洗 5次以上 ，用无菌滤纸吸干，并将其剪至适 当大小，
置 于不含植物 生长调节 剂的 MS培养基 上预培养 ；培养 3 d后 ，挑选无 杂菌污 染的健壮 叶 片用
于转化，发根农杆菌 R1 601的培养物用 MS培养基稀释 j0倍 ．将待转化叫片浸^其中 I min
取 出用无 菌滤纸吸 干 ，放 回原培养 基上继 续培养 2 d，然后 转人 含 500 mg／l 援苄 青霉素 的 M
基本 培养基 中进 行杀菌培 养 ，约 1～2 W 即可 见有发根诱 导 。每 隔一周转 接发根 于 含羧 苄青 霉
素 500 mg／I 卡那霉素 50 mg／I 的杀菌、选择培养基中，直至 l0代后可杀菌完全，万寿菊
的发根培养体系即宣告建立。
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179 广 西 植 物 20卷
1．2．3万寿 菊发根 的低 温保 存试 验 将万 寿菊发根 剪成 1 cm左 右 长短 ，接人不 含任何植 物生
长调节剂的 MS固体培养基中．每瓶约 10条，放人 4 C冰箱 中．每两周取出三瓶置f 25 C．
光暗 比为 l2：1 2的正常培养条件下培养 以此来考察其低温保存能力
1．2．4万寿菊发根 中a一三连噻吩含量的分析 取培养的发根用 自来水洗去残 留培养基．用滤
纸吸干，称取 200 mg鲜样 ，剪碎后再于匀浆器中匀浆，加入 3 ml 丙酮于具塞试管中浸提 3
d，取浸提液经适 当浓缩后 ．用 HP—HPI C C 反相柱进行分析 ：柱为 ODS hypersil．5 m，1 25
×4 mm，流动相 为甲醇 ：水 (80：2O)，流速 为 1．5 mI ／min，检测波 长为 350．,2n3。
2 实验 结果
2．1万寿菊发根 培养体 系的建立
万寿菊叶片经预培养排除杂菌污染后 ，3 d即发现有伸长迹象 ，在创伤切口处有愈伤组织
出现，1周以后 ，逐渐从这些部位生长出发根 ，待其生长至 2 cn3长度后 ，剪下放人杀菌、选
择培养基中继续培养。随着时间的推移．万寿菊叶片能诱导出发根的数 目逐渐增多，3周后诱
导率达到 i00 ；出根数 目从几条至十数条不等，诱导出的发根生长活力也有较大差异 ．有的
发根生长迅速，有的发根在继代培养过程中渐趋死亡 ，挑选长势 良好的发根进行继代培养，经
10次继代后 ，一个稳定的发根体系即建立成功。
2．2万 寿菊发根 的低温 保存试 验
在建立 万寿 菊发根 体系过程 中，发
现万 寿菊发 根生长 迅速 ，若 长时 间不进
行 继代培养 ，则不 仅发 根乃至 整个 培养
基 均变为黑 色 ，导致 培 养物 的死 亡。为
了避免将大量时间与材料浪费于以种质
保存为目的的继代培养上 ，特设计了此
低 温种 质保 存试 验 。 实验 中发现 ，在 d
℃ 条件下 ，发根并非完全停止生长．只
是生 长速度极慢 ，从 冰箱 中取 出时 ，均
发现有新的分枝点出现，在第 2、4、6、
踢用冰箱保存万寿菊发根是可行 的。
表 l 万 寿 菊 发 根诱 导 率 与 时间 的关 系
Table J The re[afionship betweeD Irv root inducing
H te of l agetes㈨ fd 1一 and cu]turi rlg time．
8、10周 时 ，发根保 存 的存 活率均 达到 1。o 这 说
2．3万寿 菊发根 的 ∞三 连噻吩 的含量分 析
先用 n一三连噻吩标准品求出其含量与峰面积的相关性，得二者的线性关系为 ：y= 1．j86
8× 10 + 2．746× 10。‘ ，r= 0．999 98．X代表峰面积，lr代表 a一三连噻吩含量 g)、峰
面积与 a三连噻吩含量高度相关，说明这一分析方法是完全可行的 在同样的分析测试条件
下，经 n一三连噻吩标准品以外标法确认 ，图谱 1中保 留时间为 4．286 min的峰即为万寿菊发
根中 三连噻吩 ，经换算培养发根的 a三涟噻吩含量在 6．1o～7．73 g／g．fw之间
3 讨 论
我们 可 初 步确 定所 获得的 为发根 ．而非离 体根培 养物 ．这 主要基 于以下 2点理 由 ：
是我们采用的是无激素培养基 ，在这个条件下万寿菊是不可能诱导出根培养物的；二是万寿
菊根培养物 在无激素的培养基 中是不能继代成活的．这两点都经我们的相应实验所证实，
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2期 侯学 文等 ：产生光 活化杀虫 剂 三连噻 吩发根 培养 体系 的建立 l 8O
iraU
v D1A．Wavele~ =35Ohm(IC4~99＼99051915．D)
一
．
0
圈 l 万 寿菊 发根 丙 酮抽 提物 的 HPLC图 谱
Fig 1 The HPLC elution profile of a terthmnyl exwaeted by acetone from hairy of Tagetes d L
Croes ：发现 ，在万寿菊愈伤组织培养过程中．伴随着根的产生，a一三连噻吩的含量急剧上升；
万寿菊发根的含量分析表明，其 三连噻吩含量高于万寿菊与孔雀草愈伤组织的含量，说明
三连噻吩的台成是需要一定的组织结构的 。由于发根 的生长速度快，再辅以相应的代谢调控
手段及培养工艺，万寿菊发根培养体系有可能成为 三连噻吩的新来源，这方面的研究正在
进行 中 。
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